一種反硝化細菌及其發酵生產方法
2023-05-09 21:08:56 1
一種反硝化細菌及其發酵生產方法
【專利摘要】本發明涉及微生物發酵工程【技術領域】內能有效利用無機氮源、抑制硫酸鹽還原菌（SRB）生長繁殖的一種反硝化細菌及其發酵生產方法，本發明的高溫反硝化細菌保藏於中國微生物菌種保藏管理委託員會普通微生物保藏中心，拉丁文學名為Geobacilluspallidas，保藏編號為CGMCCNO7270保藏日期為2013年3月5日。本發明的高溫反硝化細菌能有效利用無機氮源，可以在45℃—90℃高溫條件下有效抑制SRB的生長繁殖，發酵工藝簡單，可一次發酵成功，並且培養基成本低，培養周期短，生產的反硝化細菌活菌含量及芽胞率高，單位活芽胞含量達2×108cfu/mL，芽孢含量90%以上。
7270
2013.03.05
【專利說明】一種反硝化細菌及其發酵生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵工程【技術領域】，特別涉及一種能有效利用無機氮源、抑制 硫酸鹽還原菌（SRB)生長繁殖的反硝化細菌及其該反硝化細菌的發酵生產方法。
【背景技術】
[0002] 油藏注水開發導致原油生物降解及其降解的中間產物，刺激了油藏、石油管道及 採油裝置中的硫酸鹽還原菌（SRB)的生長。硫酸鹽還原菌產生大量的硫化氫，造成油藏酸化 及管道的腐蝕，給全球石油工業帶來了嚴重的損失。美國和西德科研機構最近的數據表明： SRB腐蝕僅對油田礦廠供水系統造成的損失就達7億美元/年，對油田保持地層壓力系統和 礦場回收利用汙水系統造成的損失就更為嚴重。我國大部油田如四川油氣田，大慶、遼河、 吉林等油田都不同程度地受到SRB腐蝕的危害，其中以四川油氣田受SRB腐蝕之害最深，曾 先後發生過多起因應力腐蝕引起的惡性事故。防止SRB腐蝕已是腐蝕科學和微生物學和工 業系統共同關注的重要課題。
[0003] 目前，投入殺菌劑是最常用的防治SRB腐蝕的方法。但SRB種類繁多，化學殺菌劑 能夠波及到也難於全面捕殺；同時殺菌劑的大量使用，可使細菌產生耐藥性，也會給環境帶 來汙染負荷。近年來，利用微生物來抑制或消除微生物腐蝕的研究已經受到普遍的關注，應 用最為廣泛的是用硝酸鹽還原菌NRB (亦稱反硝化細菌）作用來抑制硫酸鹽還原菌的生長 或產物的積累，減輕或抑制腐蝕的發生。
[0004] 反硝化細菌在生活習性、生長環境等方面與硫酸鹽還原菌非常相似，只是它們不 產生H2S，而生成其它對油田無害的產物或者將H 2S轉化，降低SRB的腐蝕。這些細菌注入 地層中，可以與SRB發生競爭，使SRB的生長繁殖受到抑制，即利用微生物之間的競爭關係 來防止SRB腐蝕。該方法在不破壞環境的條件下，利用系統本身微生物的競爭生長規律治 理腐蝕菌，或利用微設備危害較小，成本相對較底，因而是今後研究工作的重點。但現有技 術中用於抑制硫酸鹽還原菌的反硝化細菌均是中低溫範圍下使用的，最佳工作溫度一般是 20- 30°C只能應用於油田地面汙水處理系統，而油井和油藏等高溫環境下傳統的反硝化細 菌並沒有任何效果；並且反硝化菌種需經多次放大發酵才能發酵成適用工業應用菌液，發 酵工藝繁瑣，能源消耗高。因此，目前大部分反硝化細菌進行SRB的防治基本停留於室內研 究或者小試階段。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術中反硝化細菌抑制SRB的最佳溫度低，菌液的工業發酵程序 繁瑣、能耗高的問題，提供一種反硝化細菌，以提高反硝化細菌抑制SRB的抑制溫度，並且 可以簡化反硝化細菌工業發酵過程。
[0006] 本發明的反硝化細菌，為JSHDOl地芽孢桿菌，具有序列表SEQ IDNO :1所示 的序列，保藏於中國微生物菌種保藏管理委託員會普通微生物保藏中心，拉丁文學名為 Geobacillus pallidas，保藏編號為CGMCC NO 7270保藏日期為2013年3月5日。
[0007] 本發明還提供上述高溫反硝化細菌的發酵生產方法，包括如下步驟： 1) 將所述CGMCC NO 7270反硝化細菌接種在固體培養基上，50°C-60°C靜止培養3-4 天以形成反硝化細菌芽胞； 2) 將步驟1)中培養過的固體培養基表面用無菌水洗涮，獲得反硝化細菌孢子懸浮液， 顯微鏡鏡檢計數芽胞含量>1X 101(lcfu/mL ;將懸浮液經70-75°C水浴10_15min以獲得發芽 勢強、發育一致的孢子懸浮液作為發酵生產菌種； 3) 將步驟2)中孢子懸浮液生產菌種按IOOmL接種2000L - 2400L無菌培養基的比例 接種到發酵罐中進行放大培養，發酵控制條件為：接種溫度63-65°C，培養溫度55-60°C，罐 壓0. 01-0. 05Mpa，發酵過程中向培養基中通入經除塵殺菌後的空氣，每分種通入的空氣量 為液體體積的〇. 2 - 0. 3倍，攪拌速度為150-250rpm ;發酵培養35-45h，取樣鏡檢90%以上 菌體產生芽孢後，再收集菌液獲得反硝化細菌產品，所述硝化細菌產品的單位活芽胞量大 於 2X108cfu/mL。
[0008] 上述步驟1)中固體培養基的配方及各組分的質量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%， 乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬 氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵0. 005-0. 01%，酵母膏0. 01-0. 012%，瓊脂1. 5-2. 0%，餘量為水， pH 值 7. 0-7. 2。
[0009] 上述步驟3)中無菌培養基的配方及各組分的質量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%， 乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬 氨酸 0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0. 005-0. 01%，酵母膏 0. 01-0. 012%，泡敵 0. 05-0. 1%，餘量為水， pH 值 7. 0-7. 2。
[0010] 本發明的高溫反硝化細菌為地芽孢桿菌，能有效利用無機氮源，可以在45°C - 90°C高溫條件下有效抑制SRB的生長繁殖，發酵工藝簡單，可一次發酵成功，並且培養基成 本低，培養周期短，生產的反硝化細菌活菌含量及芽胞率高，單位活芽胞含量達2 X IO8Cfu/ mL，芽孢含量90%以上。
[0011] 生物保藏 本發明所涉及的微生物已提交生物保藏：
【權利要求】
1. 一種反硝化細菌，其特徵在於，為JSHDOl地芽孢桿菌，具有序列表SEQ IDNO :1所 示的序列，保藏於中國微生物菌種保藏管理委託員會普通微生物保藏中心，拉丁文學名為 Geobacillus pallidas，保藏編號為CGMCC NO 7270保藏日期為2013年3月5日。
2. -種權利要求1所述的反硝化細菌的發酵方法，其特徵在於，包括如下步驟： 1) 將所述CGMCC NO 7270反硝化細菌接種在固體培養基上，50- 60°C靜止培養3-4天 以形成反硝化細菌芽胞； 2) 將步驟1)中培養過的固體培養基表面用無菌水洗涮，獲得反硝化細菌孢子懸浮液， 顯微鏡鏡檢計數芽胞含量>1 X 101(lCfu/mL ;將懸浮液經70-75°C水浴10_15min以獲得發芽 勢強、發育一致的孢子懸浮液作為發酵生產菌種； 3) 將步驟2)中孢子懸浮液生產菌種按IOOmL接種2000L - 2400L無菌培養基的比例 接種到發酵罐中進行放大培養，發酵控制條件為：接種溫度63-65°C，培養溫度55-60°C，罐 壓0. 01-0. 05Mpa，發酵過程中向培養基中通入經除塵殺菌後的空氣，每分種通入的空氣量 為液體體積的〇. 2 - 0. 3倍，攪拌速度為150-250rpm ;發酵培養35-45h，取樣鏡檢90%以上 菌體產生芽孢後，再收集菌液獲得反硝化細菌產品，所述硝化細菌產品的單位活芽胞量大 於 2X108cfu/mL。
3.根據權利要求2所述的反硝化細菌的發酵生產方法，其特徵在於，所述步驟1)中固 體培養基的配方及各組分的質量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%，乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二 氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0? 005-0. 01%，酵母膏0? 01-0. 012%，瓊脂L 5-2. 0%，餘量為水，pH值7. 0-7. 2。
4.根據權利要求2所述的反硝化細菌的發酵生產方法，其特徵在於，所述步驟3)中無 菌培養基的配方及各組分的質量百分比為：硝酸鈉〇. 15-0. 2%，乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二 氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0? 005-0. 01%，酵母膏0? 01-0. 012%，泡敵0? 05-0. 1%，餘量為水，pH值7. 0-7. 2。
【文檔編號】C12N1/20GK104312957SQ201410569620
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月23日 優先權日:2014年10月23日
【發明者】吳偉林, 楊海濱, 姚峰, 林晶晶, 孟章進, 楊帆 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司