尤韋可擬盤多毛孢代謝產物在製備抗腫瘤藥物中的應用的製作方法

2023-05-10 08:56:41 1

尤韋可擬盤多毛孢代謝產物在製備抗腫瘤藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物【技術領域】，本發明所述的牡蒿內生真菌是從貴州省貴陽市郊區採集的牡蒿植物活體中採用內生真菌分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定，命名為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31，該菌株已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登記號CCTCCNO:M2014303。本發明最顯著的特徵是：該菌株發酵菌絲體能分泌多種天然活性成分，具有廣譜抗腫瘤等藥效作用，是新型天然活性藥物的重要微生物資源。
【專利說明】尤韋可擬盤多毛孢代謝產物在製備抗腫瘤藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物【技術領域】，尤其是涉及一株來源於藥用植物牡蒿的擬盤多毛孢屬內生真菌尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31及其代謝產物在醫藥中的應用。

【背景技術】
[0002]植物內生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定階段或全部階段生活與健康植物各組織合格器官內的真菌。它們與宿主植物通過互作形成了緊密的共生關係，可以促進植物的生長，提供植物應對脅迫的適應能力，有的植物內生真菌還具有藥用價值。從植物內生真菌中尋找和發現活性化合物已成為國內外研究的又一熱點。如中國專利文獻CN201310194836.5公開了一株龍膽中分離得到的內生真菌(Metarrhizium) LD421,可用於防治龍膽葉枯病；專利申請CN201210067829.4則公開了從銀杏根、莖、葉等組織中分離得到的內生真菌腐皮鐮孢菌T-7，對辣椒疫黴病菌、番茄枯萎病菌、蘋果腐爛病菌等具有很好的抑制作用。
[0003]牡蒿(Artemisia japonica)為菊科蒿屬植物,其味苦、微甘、性涼。民間又稱土紫胡(《陸川草本》)、胃痛靈、熊掌草，以全草入藥。具有清熱、涼血、解毒、健胃止血功效，主要用於治療感冒發熱，中暑、瘧疾、肺結核潮熱、高血壓病、五癆七傷、大小便不通和毒蛇咬傷等。同時也有記載牡蒿為藥食兩用植物，含有多種活性物質，具有免疫、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂保肝以及延緩衰老等多種生理功能。另外，牡蒿還可用於製備生物農藥，作為殺蟲劑使用。
[0004]目前在農業生產過程中控制農作物病蟲草害的主要手段是化學農藥防治，其對減輕病蟲草害，保證農作物豐產豐收起到積極的作用，但是由於自然界生物之間的相互制約相互依存，現在已不建議過分依賴化學農藥在進行病害的處理。因此，對植物內生真菌的研究，利用植物內生真菌與宿主植物生物活性共生的關係，來篩選具有高生物活性的內生真菌，進一步獲得活性產物，是今年來研究的一大熱點。但是，對於某一宿主植物，究竟何種內生真菌或哪幾類內生真菌具有抗病原微生物活性，且各內生真菌中哪種菌活性最高，分離純化是否容易，發酵過程是否複雜等等，都是需要進行大量研究加以證實的，目前尚未發現牡蒿內生真菌及其分離培養和抗病原微生物活性、藥用活性應用的具體報導。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對化學藥品不安全與微生物源藥品種類較少的不足，提供一種從藥用植物牡蒿中分離篩選出的內生真菌-尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis
uvicola)。
[0006]本發明所述內生真菌，是從貴州省貴陽市郊區的藥用植物牡蒿(Artemisiajaponica)中分離獲得的，命名為內生尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31，並對該菌株的發酵代謝產物進行了多種生物活性研究。該發明為微生物源農藥和醫藥的進一步研製和開發提供優良的出發菌株。
[0007]本發明技術方案如下:
[0008]本發明尤韋可擬盤多毛孢的分離、篩選與鑑定:
[0009]是於2011年8月在貴州省貴陽市郊區採集的牡蒿葉片中，經分離、純化、培養、發酵和活性測定等步驟獲得並保存；經微生物分類學鑑定為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola),定名為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola) GMH31。該菌株已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登記號CCTCCN0:M2014303，地址湖北省武漢市武昌珞珈山。
[0010]具體的分離培養方法為:
[0011](I)牡蒿植物組織的準備:採集牡蒿的葉組織，用自來水衝洗，除去樣品表面的表生微生物，然後放於乾淨的紗布上風吹晾乾；
[0012](2)表明消毒及無菌檢測:晾乾後的組織塊剪成適宜大小，用滅菌蒸餾水衝洗乾淨，葉片消毒採用75%乙醇浸泡l-2min、0.1% HgCl2溶液浸泡3_4min，然後用滅菌蒸餾水衝洗至消毒液無殘留，用滅菌濾紙吸乾組織段表面殘留水滴後，切成直徑4?6_大小的組織切段；
[0013](3)內生真菌的分離純化:將步驟(2)消毒後的組織切段接種於含有硫酸鏈黴素(100 μ g.mL—1)和青黴素(50 μ g.mL—1)的PDA培養基平板上，封口後於25_30°C恆溫培養2?7天，至菌絲體從組織塊中長出，採用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉移至純化PDA培養基平板上，於25-30°C下進行純化培養5?9天，長出完整菌落，即為牡蒿內生真菌。
[0014]優選地，所述步驟(3)中培養溫度為28°C，平板培養，純化培養時間為7天。
[0015]該牡蒿內生真菌命名為尤韋可擬盤多毛孢GMH31，其固體培養特徵為:菌落在PDA平板上28°C培養8-9天擴展至直徑為9cm，菌落白色棉絮狀，輪狀擴展不明顯，背面淡橘黃色，無輪紋，子實體墨汁狀，顆粒較大，分布比較稀疏。顯微形態特徵:分生孢子盤黑色，近球狀，初埋生寄主表皮下，成熟後突破表皮外露，呈粒點狀；分生孢子5細胞，兩端細胞無色(呈圓錐形或三角形)，中間細胞呈橄欖色至褐色(9.7?12.6 μ m)，近紡錘形，直立，壁厚，大小為19.7?23.5X5.5?6.6 μ m ;附屬絲著生於分生孢子的頂端，為2?3根,角度開張，較細長，長度為5.9?6.5 μ m,底部無色,三角形,尾絲短或無。見圖1、圖2。
[0016]菌株GMH31的分子生物學特徵:採用分子生物學PCR技術，DNA序列測定分析，菌株GMH31的ITS rDNA基因組由495個鹼基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎構建系統發育樹，該菌為尤韋可擬盤多毛孢，見圖3。
[0017]本發明的另一目的是提供利用該菌株發酵液代謝產物防治植物真菌病害的方法。
[0018]上述目的通過以下技術方案來實現:
[0019]一種防治獼猴桃褐腐病和辣椒疫病等植物真菌病害的微生物代謝產物的製備方法，按以下步驟進行:
[0020](I)菌種的活化培養:將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0021](2)液體發酵培養:發酵培養液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白腖 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發酵培養液10mL ;配製後121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發酵培養28-35天；
[0022](3)發酵液提取:發酵完畢後收集發酵液，加入1-3倍體積的乙酸乙酯萃取，取下層溶液，再用1-2倍體積的正丁醇萃取，分層後取上層液，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇發酵液萃取物。
[0023]本發明的再一目的是提供該菌株發酵菌絲體代謝產物在製備抗腫瘤等藥物中的應用。
[0024]上述目的通過以下技術方案來實現:
[0025]一種具有抗腫瘤活性的菌絲體代謝產物的製備方法，按以下步驟進行:
[0026](I)菌種的活化培養:將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0027](2)液體發酵培養:發酵培養液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白腖 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發酵培養液10mL ;配製後121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發酵培養28-35天；
[0028](3)菌絲體提取:發酵完畢後收集菌絲體，加入濃度為30-90%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小於等於0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取2-5次，然後在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取2-5次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
[0029]本發明的有益效果:
[0030]一是本發明從藥用植物牡蒿葉片中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌和腫瘤細胞具有較強抑制作用的尤韋可擬盤多毛孢GMH31，這為農業上防治植物真菌病害病原菌和醫藥上抗惡性腫瘤新藥源的開拓提供了一種微生物菌株。
[0031]二是本發明提供了利用尤韋可擬盤多毛孢GMH31發酵獲得活性發酵液代謝產物的方法；該代謝產物可應用於植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
[0032]三是本發明提供了利用尤韋可擬盤多毛孢GMH31發酵獲得活性菌絲體代謝產物的方法；該代謝產物可應用於抗腫瘤藥物的製備，為醫用藥物新來源的開發增添了新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的平板圖。
[0034]圖2為尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的分生孢子圖。
[0035]圖3為尤韋可擬盤多毛抱(Pestalot1psis uvicola)GMH31菌株的基因樹圖。

【具體實施方式】
[0036]為了使本領域普通技術人員更好的理解本發明，本 申請人:進行了一系列實驗研究，以證明本發明的效果。
[0037]下面，舉出實施例對本發明進一步描述，但本發明並不限於下述的實施例。
[0038]實施例1:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31的分離與篩選)
[0039]本發明於2011年8月在貴州省貴陽市郊區採集藥用植物——牡蒿的健康葉片，經表面消毒、內生真菌分離、培養、發酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株和腫瘤細胞株的篩選等步驟，從中獲得尤韋可擬盤多毛孢GMH31，保存。
[0040]具體的分離培養方法為:(I)牡蒿植物組織的準備:採集牡蒿的葉組織，用自來水衝洗，除去樣品表面的表生微生物，然後放於乾淨的紗布上風吹晾乾；
[0041](2)表明消毒及無菌檢測:晾乾後的組織塊剪成適宜大小，用滅菌蒸餾水衝洗乾淨，葉片消毒採用75%乙醇浸泡lmin、0.1 % HgCl2溶液浸泡3min，然後用滅菌蒸餾水衝洗至消毒液無殘留，用滅菌濾紙吸乾組織段表面殘留水滴後，切成直徑4?6_大小的組織切段；
[0042](3)內生真菌的分離純化:將步驟(2)消毒後的組織切段接種於含有硫酸鏈黴素(100 μ g -πιΓ1)和青黴素(50 μ g -πιΓ1)的PDA培養基平板上，封口後於28°C恆溫培養5天，至菌絲體從組織塊中長出，採用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉移至純化PDA培養基平板上，於28°C下進行純化培養7天，長出完整菌落，即為牡蒿內生真菌。
[0043]尤韋可擬盤多毛孢GMH31抑菌活性測定:
[0044]取經0.22 μ m膜過濾的發酵液ImL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻後在每個培養基平面分別放I個直徑為7mm的獼猴桃褐腐病菌(Sclerotinia sclerot1rum)或辣椒疫黴菌(Phytophthora capsici)等供試菌菌餅，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養72h，以無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:1(%)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/ (對照菌落直徑-7) ] X 100%。
[0045]測定結果表明:尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物對獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫黴菌的抑制率分別為82.8%和86.9%。
[0046]尤韋可擬盤多毛孢GMH31抑制腫瘤細胞株生長測定:
[0047]將腫瘤細胞懸液接種於96孔培養板，每孔100 μ L，標準條件培養12h後，分別加入含有對照或發酵菌絲體提取物的培養液(濃度分別為20 μ g/mL和200 μ g/mL)。標準條件分別培養12、24、48、72、96h，於培養結束前4h，各孔加入0.5%的MTT溶液20 μ L。培養結束後，棄上清，每孔加入二甲基亞碸(DMSO) 150 μ L終止反應，於自動酶標儀上，測定各孔在波長492nm處的光密度值(0D值)，計算細胞抑制率:1 (% ) = [I —加藥孔OD值/對照孔OD值]X 100%。抑制率>50%的為具有腫瘤細胞毒活性的菌株。
[0048]測定結果表明:濃度為20 μ g/mL的尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物，在72h時，對小鼠腹水型肝癌細胞H22、小鼠腹水型宮頸癌細胞U14和小鼠腹水型肉瘤細胞S18tl的抑制率分別為 86.1%,92.4%和 77.9%。
[0049]實施例2:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31發酵代謝產物的製備方法)
[0050]按以下步驟進行:
[0051](I)菌種的活化培養:將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；
[0052](2)液體發酵培養:發酵培養液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖 20g、酵母膏 5g、蛋白腖 10g、KH2PO40.5g、CaC0315g、MgSO4.7H200.3g，每 300mL 三角瓶裝發酵培養液10mL ;配製後121^滅菌20!^11，待冷卻至401:在無菌條件下挑取I直徑為7mm的菌餅，在28 ± I °C條件下，靜置發酵培養30天；
[0053](3)發酵液提取:發酵完畢後收集發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層溶液，再用等體積正丁醇萃取，分層後取上層液，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇發酵液萃取物；
[0054](4)菌絲體提取:發酵完畢後收集菌絲體，加入濃度為80%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小於等於0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取4次，然後在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取4次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
[0055]以下實施例3中所述的尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物為實施例2下方法(3)中所製備的正丁醇發酵液萃取物；所述產品的百分含量為質量/體積百分比。
[0056]實施例3:(尤韋可擬盤多毛孢GMH31發酵液代謝產物對獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫黴菌的抑制作用)
[0057](I)準確稱取尤韋可擬盤多毛孢GMH31正丁醇發酵液萃取物0.1g,加入1mL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為10g/L的母液；
[0058](2)抑菌活性測定:取上述母液分別稀釋成濃度為1000mg/L和500mg/L的溶液，取各濃度溶液ImL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻(尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物終濃度為100mg/L和50mg/L)，冷卻後在每個培養基平面分別放I個直徑為7mm的獼猴桃褐腐病菌和辣椒疫黴菌菌餅，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養36h，以常規化學藥劑和無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:1(%)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/ (對照菌落直徑-7) ] X 100 %。
[0059](3)本發明產品與常規農藥防治效果對比試驗:試驗結果見表1。從表1看出，尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物抑制效果較常規化學藥劑略優，且安全。
[0060]表1尤韋可擬盤多毛孢GMH31代謝產物對供試病原真菌的抑制效果
[0061]

【權利要求】
1.尤韋可擬盤多毛孢(Pestalot1psisuvicola)GMH31代謝產物在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述的尤韋可擬盤多毛孢GMH31在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏登記號為CCTCCNO:M2014303。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述代謝產物按以下方法製備: (1)菌種的活化培養:將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用； (2)液體發酵培養:發酵培養液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白腖 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發酵培養液10mL ;配製後121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 土 1°C條件下，靜置發酵培養28-35天； (3)菌絲體提取:發酵完畢後收集菌絲體，加入濃度為30-90%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小於等於0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取2-5次，然後在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取2-5次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
3.如權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述代謝產物按以下方法製備: (1)菌種的活化培養:將分離保存的尤韋可擬盤多毛孢GMH31菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28 ± I °C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為7mm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用； (2)液體發酵培養:發酵培養液為每100mL中含有玉米粉10g、甘露醇20g、葡萄糖20g、酵母膏 5g、蛋白腖 10g、KH2P040.5g、CaC0315g、MgS04.7Η200.3g，每 500mL 三角瓶裝發酵培養液10mL ;配製後121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取I直徑為7mm菌餅，在28 °C條件下，靜置發酵培養30天； (3)菌絲體提取:發酵完畢後收集菌絲體，加入濃度為80%丙酮水溶液，使菌絲體在丙酮水溶液中的濃度小於等於0.50g/L，在功率為40KHz、30min/次的條件下超聲萃取3次，然後在同等條件下再加入等體積乙酸乙酯超聲萃取3次，過濾，收集上層乙酸乙酯溶液，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯菌絲體萃取物。
4.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述腫瘤細胞為小鼠腹水型肝癌細胞H22、小鼠腹水型宮頸癌細胞U14或小鼠腹水型肉瘤細胞S180。
【文檔編號】A01N63/04GK104161777SQ201410335854
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】錢一鑫, 康冀川, 王魯 申請人:貴州大學