一種肉靈芝多糖的發酵製備方法
2023-05-10 11:11:36 1
專利名稱：一種肉靈芝多糖的發酵製備方法
技術領域：
本發明涉及一種多糖的發酵製備方法，特別是涉及一種肉靈芝多糖的發酵製備方法。
背景技術：
肉靈芝俗稱「太歲」，具有很高的藥用保健價值。明代醫學家李時珍在《本草綱目》中把肉靈芝收入「菜」部「芝」類，並稱其為「本經上品」。他援引近代著名的藥物學家葛洪《抱樸子》裡的話，把「芝」分為五種即石芝、木芝、肉芝、菌芝、草芝。其中「肉芝」是這樣解釋的「肉芝狀如肉，附於大石，頭尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚，白者如截肪，黑著如澤漆，青者如翠羽，黃者如紫金，皆光明洞徹如堅冰也。大者十餘斤，小者三四斤。」(摘自本草綱目第二十八卷菜部五)並指出「肉芝」的特徵是「皆光明如堅冰」，即半透明體。陝西周至所發現的肉靈芝和《本草綱目》所描述的肉靈芝特徵完全一致。據生物學專家確定此肉靈芝是本世紀所發現的歷史上最大最重的天然大型「肉靈芝」，《本草綱目》裡還列舉了幾部以「芝」為主的藥方，說明對一些疑難雜症有著特殊療效，其共同特點是「久食，輕身不老，延年神仙。」經研究發現，肉靈芝多糖具有明顯的抗疲勞作用，有望開發成保健食品。目前有關肉靈芝多糖的製備方法和應用研究還沒有相關的技術報導。
發明內容
本發明的目的就是提供一種適合工業化生產的肉靈芝多糖的製備方法。
為了實現上述目的，本發明的技術方案如下1.菌種的獲得，具體方法是
(1)取自然採集的肉靈芝，表面流水清洗，出去附著的泥沙，再用滅菌蒸餾水清洗；(2)在無菌室內的超淨臺上，用滅菌手術刀切除肉靈芝表皮部分，並切下0.5～1.5cm3的樣品，浸入2％升汞溶液中消毒10～20分鐘；(3)將樣品放入已滅菌的搗碎機中，加入100毫升無菌水，將樣品粉碎成懸濁液；(4)將樣品懸濁液用無菌水按1∶9逐級稀釋，形成10-1；10-2；10-3；10-4；10-5；10-6次濃度梯度，從個稀釋度中取1毫升，常規培養基平板塗布，培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1，滅菌條件1kg/cm2，20～30分鐘；(5)將塗布好的平板放入30～38℃培養24～48小時，挑選生長良好的單菌落分別接入無菌斜面(培養基配方葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5～2.0％，氨水調節PH至7.1。滅菌條件1kg/cm2，30分鐘)36℃培養24小時，編號後備選。
2.菌種的篩選，具體方法是(1)按以下配方配置多糖篩選培養基蛋白腖0.3％，酵母浸出粉0.1％，硫酸銨1.0％，葡萄糖3.0％，磷酸氫二鉀0.1％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；分裝到40×210mm試管中，每管裝50毫升；棉塞封口，滅菌；滅菌條件115℃，10～20分鐘；(2)將編號備選的菌株分別接入上述試管，種量為1環，做好標記；放入30～38℃搖床培養24～48小時，搖床為旋轉式，轉速為120～180轉/分；(3)試管培養結束後，用苯酚硫酸法分別測定各樣品的多糖含量，將多糖濃度大於1.0％的菌種選出，編號；本試驗篩選出的菌種多糖濃度最高為1.7％，編號為RLZ62-1；以下皆以該菌種為試驗說明對象。
3.培養斜面菌種，具體方法是斜面培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1；滅菌條件1kg/cm2，20～30分鐘；斜面培養時間為18～36小時。
4.培養一級菌種，具體方法是培養基配方為蛋白腖10g，酵母浸出粉3g，硫酸銨10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，複合維生素及微量元素10mL，蒸餾水定容至1000ml，調節PH至6.8；裝量1000毫升三角瓶裝100～400毫升培養基，8層紗布封口，滅菌條件1kg/cm2，10～30分鐘；接種量每支斜面接3瓶菌種；培養旋轉式搖床100～400轉/分，培養溫度32℃～33℃，培養時間17～30小時。培養結束後顯微鏡鏡檢，菌體應大小一致，無雜菌感染，OD淨生長值應大於0.4。
5.培養二級菌種，具體方法是培養基配方為蛋白腖0.5％，酵母浸出粉0.3％，硫酸銨2.0％，葡萄糖2.0％，磷酸氫二鉀0.1％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；裝量種子罐有效容積的60％；滅菌條件115℃，10～30分鐘；接種量5％。培養溫度32℃～33℃，培養時間15～30小時；罐壓1kg/cm2，攪拌轉速100～400轉/分；通風量1∶0.5～1.5(體積比)。培養結束後，顯微鏡鏡檢，菌體應大小一致，無雜菌感染，OD淨生長值應大於0.5。
6.多糖的發酵，具體方法是培養基配方為玉米漿粉1.5％，酵母浸出粉0.3％，硫酸銨2.0％，葡萄糖2.0％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；裝量發酵罐有效容積的70％；滅菌條件115℃，10～30分鐘，接種量1～10％。培養溫度32℃～33℃，培養時間60小時；發酵罐罐壓1kg/CM2，攪拌轉速100～400轉/分，起始風量1∶0.5～1.5(體積比)，每小時測定還原糖，當還原糖含量低於1％時，流加50％葡萄糖糖漿，流加量使總還原糖達到2％，同時風量加到1∶1.0～2.0(體積比)；當每小時糖耗小於0.2時，停止流加，風量調至1∶1.0～1.5(體積比)，至總糖小於1％時，結束髮酵。
7.提取，具體方法是(1)向發酵液中加入3～5倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置1～3小時；(2)過濾或離心，取沉澱物用乙醇在洗滌一次；(3)沉澱用冷凍過的丙酮洗滌兩次，再用乙醚洗滌一次；(4)放入真空乾燥箱，烘乾；(5)將乾燥的肉靈芝多糖用球磨機粉碎成粉末。
採用本發明方法，可以得到粗多糖含量大於70％的肉靈芝多糖粉末，能夠適合工業化生產。
具體實施例方式
實例1(搖瓶發酵實例)斜面培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1。滅菌條件1kg/cm2，20分鐘。斜面培養時間為18小時。
一級菌種一級菌種培養基配方為蛋白腖10g，酵母浸出粉3g，硫酸銨10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，複合維生素及微量元素10mL，蒸餾水定容至1000ml，調節PH至6.8。裝量1000毫升三角瓶裝100毫升培養基，8層紗布封口，滅菌條件1kg/cm2，10分鐘。接種量每支斜面接3瓶菌種；培養旋轉式搖床400轉/分，培養溫度32℃，培養時間18小時。
發酵培養基蛋白腖0.5％，酵母浸出粉0.3％，硫酸銨2.0％，葡萄糖4.0％，磷酸氫二鉀0.1％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0。裝量1000毫升三角瓶裝200毫升培養基，8層紗布封口；滅菌條件115℃，20分鐘；接種量1％。培養溫度32℃-33℃，搖床轉速200轉/分；培養時間60小時。培養結束後，經測定發酵液中多糖含量為2.030/100ml。
多糖提取(1)合併發酵液，向發酵液中加入5倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置1小時；(2)過濾，取沉澱物用乙醇在洗滌一次；(3)沉澱用冷凍過的丙酮洗滌兩次，再用乙醚洗滌一次；(4)放入真空乾燥箱，烘乾；(5)將乾燥的肉靈芝多糖用球磨機粉碎成粉末。
按以上步驟，可以得到粗多糖含量大於70％的肉靈芝多糖粉末。
實例2(50升發酵罐實例)斜面培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1。滅菌條件1kg/cm2，30分鐘。斜面培養時間為24小時。
一級菌種一級菌種培養基配方為蛋白腖10g，酵母浸出粉3g，硫酸銨10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，複合維生素及微量元素10mL，蒸餾水定容至1000ml，調節PH至6.8。裝量1000毫升三角瓶裝400毫升培養基，8層紗布封口，滅菌條件1kh/cm2，20分鐘。接種量每支斜面接3瓶菌種；培養旋轉式搖床200轉/分，培養溫度33℃，培養時間24小時。
二級菌種二級菌種培養基配方(每升培養基質量分數)玉米漿粉10g；硫酸銨5g；酵母浸出粉3g；葡萄糖2g；氯化鈉3g；磷酸氫二鉀1.0g；複合生長素1毫升，調整PH至7.0，培養基裝量200毫升/1000毫升。培養基滅菌條件1KG/CM2壓力20分鐘；旋轉式搖床轉速200轉/分；培養溫度32℃；二級菌種種齡為30小時。
培養結束後無菌室內並種。
發酵培養基配方(每升培養基質量分數)玉米漿粉10g；硫酸銨10g；酵母浸出粉3g；葡萄糖20g；氯化鈉3g；磷酸氫二鉀1.0g；消泡劑(泡敵)0.2毫升；複合生長素1毫升，調整PH至7.0，發酵罐裝量罐容70％左右，即50升；接種量5％(2.5升)；實消溫度115℃，時間30分鐘；發酵溫度32℃；攪拌轉速400轉/分；風量1∶1.5(體積比)，發酵周期48小時。經測定發酵液中多糖含量為3.015/100ml。
多糖提取(1)在攪拌下向發酵液中加入4倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置2小時；(2)過濾，取沉澱物用乙醇在洗滌一次；(3)沉澱用冷凍過的丙酮洗滌兩次。
(4)放入真空乾燥箱，烘乾；(5)將乾燥的肉靈芝多糖用球磨機粉碎成粉末。
按以上步驟，可以得到粗多糖含量大於70％的肉靈芝多糖粉末。
具體實施例方式
實例3(1500升發酵罐流加糖發酵實例)斜面培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1。滅菌條件1kg/cm2，30分鐘。斜面培養時間為36小時。
一級菌種一級菌種培養基配方為蛋白腖10g，酵母浸出粉3g，硫酸銨10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，複合維生素及微量元素10mL，蒸餾水定容至1000ml，調節PH至6.8。裝量1000毫升三角瓶裝200毫升培養基，8層紗布封口，滅菌條件1kg/cm2，20分鐘。接種量每支斜面接3瓶菌種；培養旋轉式搖床180轉/分，培養溫度32℃-33℃，培養時間30小時。
二級菌種二級菌種培養基配方(每升培養基質量分數)玉米漿粉10g；硫酸銨5g；酵母浸出粉3g；葡萄糖2g；氯化鈉3g；磷酸氫二鉀1.0g；複合生長素1毫升，調整PH至7.0，培養基裝量200毫升/1000毫升。培養基滅菌條件1KG/CM2壓力20分鐘；旋轉式搖床轉速100轉/分；培養溫度32℃；二級種子種齡為15小時。
生產菌種工藝設備容積150升，種子液裝量100升。
生產菌種培養基配方玉米漿粉15g；硫酸銨10g；酵母浸出粉3g；葡萄糖20g；氯化鈉3g；磷酸氫二鉀1.0g；消泡劑(泡敵)0.2毫升；複合生長素1毫升，調整PH至7.0，種子罐實消溫度115℃，時間30分鐘。
種子罐接種量5％。
種子罐攪拌轉速300rpm。
種子罐罐壓0.1Mpa。
種子罐風量3.6M3/小時種子罐培養時間18小時。
生產菌種質量標準單染色鏡檢菌體大小均勻、無雜菌，淨長OD大於等於0.5。
種子罐在給發酵罐接種後，立即洗罐、空消，並配50％濃度葡萄糖溶液100升，實消後保壓，作大罐糖流加用。
發酵罐生產參數發酵罐罐容1500升，發酵液裝量1000升。
生產菌種培養基配方(每升)玉米漿粉10g；硫酸銨10g；酵母浸出粉3g；葡萄糖20g；氯化鈉3g；磷酸氫二鉀1.0g；消泡劑(泡敵)0.2毫升；複合生長素1毫升，調整PH至7.0，發酵罐實消溫度115℃，時間30分鐘。
發酵罐接種量10％。
發酵罐攪拌轉速180rpm。
發酵罐罐壓0.1Mpa。
發酵罐起始風量34M3/小時發酵罐培養時間48小時。
風量採用二級風量控制，起始風量為34M3/小時，發酵24小時將風量提高到60M3/小時。
流加糖控制24小時開始流加，每4小時流加20升，由種子罐視孔鏡裡目視控制，流加後，每小時測定殘糖，若殘糖大於2％，則推遲下一次流加。
發酵結果
多糖提取(1)在攪拌下向發酵液中加入3倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置3小時；(2)過濾，取沉澱物用3倍乙醇在洗滌一次；(3)沉澱用冷凍過的3倍乙醇洗滌兩次。
(4)放入真空乾燥箱，烘乾；(5)將乾燥的肉靈芝多糖用球磨機粉碎成粉末。
按照以上步驟，可以得到粗多糖含量大於70％的肉靈芝多糖粉末。
權利要求
1.一種肉靈芝多糖的發酵製備方法，其特徵在於該方法具體步驟是1.菌種的獲得，具體方法是(1)取自然採集的肉靈芝，表面流水清洗，出去附著的泥沙，再用滅菌蒸餾水清洗；(2)在無菌室內的超淨臺上，用滅菌手術刀切除肉靈芝表皮部分，並切下0.5～1.5cm3的樣品，浸入2％升汞溶液中消毒10～20分鐘；(3)將樣品放入已滅菌的搗碎機中，加入100毫升無菌水，將樣品粉碎成懸濁液；(4)將樣品懸濁液用無菌水按1∶9逐級稀釋，形成10-1；10-2；10-3；10-4；10-5；10-6次濃度梯度，從個稀釋度中取1毫升，常規培養基平板塗布，培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1，滅菌條件1kg/cm2，20～30分鐘；(5)將塗布好的平板放入30～38℃培養24～48小時，挑選生長良好的單菌落分別接入無菌斜面36℃培養24小時，編號後備選；
2.菌種的篩選，具體方法是(1)按以下配方配置多糖篩選培養基蛋白腖0.3％，酵母浸出粉0.1％，硫酸銨1.0％，葡萄糖3.0％，磷酸氫二鉀0.1％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；分裝到40×210mm試管中，每管裝50毫升；棉塞封口，滅菌；滅菌條件115℃，10～20分鐘；(2)將編號備選的菌株分別接入上述試管，種量為1環，做好標記；放入30～38℃搖床培養24～48小時，搖床為旋轉式，轉速為120～180轉/分；(3)試管培養結束後，用苯酚硫酸法分別測定各樣品的多糖含量，將多糖濃度大於1.0％的菌種選出，編號；
3.培養斜面菌種，具體方法是斜面培養基配方為葡萄糖0.1％、牛肉膏1％、蛋白腖1％、氯化鈉0.3％、瓊脂粉1.5-2.0％，氨水調節PH至7.1；滅菌條件1kg/cm2，20～30分鐘；斜面培養時間為18～36小時；
4.培養一級菌種，具體方法是培養基配方為蛋白腖10g，酵母浸出粉3g，硫酸銨10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，複合維生素及微量元素10mL，蒸餾水定容至1000ml，調節PH至6.8；裝量1000毫升三角瓶裝100～400毫升培養基，8層紗布封口，滅菌條件1kg/cm2，10～30分鐘；接種量每支斜面接3瓶菌種；培養旋轉式搖床100～400轉/分，培養溫度32℃～33℃，培養時間17～30小時；
5.培養二級菌種，具體方法是培養基配方為蛋白腖0.5％，酵母浸出粉0.3％，硫酸銨2.0％，葡萄糖2.0％，磷酸氫二鉀0.1％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；裝量種子罐有效容積的60％；滅菌條件115℃，10～30分鐘；接種量5％；培養溫度32℃～33℃，培養時間15～30小時；罐壓1kg/cm2，攪拌轉速100～400轉/分；通風量的體積比為1∶0.5～1.5；
6.多糖的發酵，具體方法是培養基配方為玉米漿粉1.5％，酵母浸出粉0.3％，硫酸銨2.0％，葡萄糖2.0％，氯化鈉0.3％，調節PH至7.0；裝量發酵罐有效容積的70％；滅菌條件115℃，10～30分鐘；接種量1～10％；培養溫度32℃～33℃，培養時間60小時；發酵罐罐壓1kg/CM2，攪拌轉速100～400轉/分，起始風量體積比為1∶0.5～1.5，每小時測定還原糖，當還原糖含量低於1％時，流加50％葡萄糖糖漿，流加量使總還原糖達到2％，同時風量加到體積比為1∶1.0～2.0；當每小時糖耗小於0.2時，停止流加，風量調至體積比為1∶1.0～1.5，至總糖小於1％時，結束髮酵；
7.提取，具體方法是(1)向發酵液中加入3～5倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置1～3小時；(2)過濾或離心，取沉澱物用乙醇在洗滌一次；(3)沉澱用冷凍過的丙酮洗滌兩次，再用乙醚洗滌一次；(4)放入真空乾燥箱，烘乾；(5)將乾燥的肉靈芝多糖用球磨機粉碎成粉末。
全文摘要
本發明涉及一種肉靈芝多糖的發酵製備方法。本發明方法具體步驟包括菌種的獲得、菌種的篩選、培養斜面菌種、培養一級菌種、培養二級菌種、多糖的發酵和提取。菌種獲得的具體方法是將自然採集的肉靈芝，表面流水清洗，滅菌蒸餾水清洗；切除肉靈芝表皮部分，並切下的樣品進行消毒；將樣品粉碎成懸濁液；將樣品懸濁液用無菌水按1∶9逐級稀釋，從各稀釋度液中取1毫升，常規培養基平板塗布；將塗布好的平板培養挑選生長良好的單菌落分別接入無菌斜面培養，編號後備選。採用本發明方法，可以得到粗多糖含量大於70％的肉靈芝多糖粉末，能夠適合工業化生產。
文檔編號C12R1/645GK1970782SQ20061015447
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月2日 優先權日2006年11月2日
發明者楊志堅, 鍾世彬, 王彥波 申請人:浙江大學