致癌劑誘導的高產杆狀病毒細胞系及其製備方法和應用的製作方法

2023-08-10 09:02:41 1

專利名稱：致癌劑誘導的高產杆狀病毒細胞系及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種昆蟲細胞系及其製備方法和應用，尤其是一種來源於昆蟲蛹卵巢組織，通過致癌劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)誘導轉化的細胞系，及通過人工體外誘導轉化獲得永生化細胞系的方法，屬於轉基因動物技術領域。
背景技術：
昆蟲是世界上種類最多的生物群體，有著豐富的細胞遺傳學系統，無論科學研究還是實際應用，昆蟲細胞系日益受到重視。昆蟲細胞系一直是生理學、發育生物學、細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要工具；它是四大表達系統之一的杆狀病毒表達載體系統的主要組成成分，可表達具有重大經濟價值和科學意義的外源蛋白質；作為生物反應器擴增昆蟲杆狀病毒，特別是含有外源基因的重組杆狀病毒，用於病毒生物殺蟲劑的研製與生產。自Grace在1962年建立了第一個可連續培養的昨蠶(Autheraea pernyi)卵巢細胞系以來，40年的時間內，已經建立的昆蟲細胞系超過500種，它們分別來源於170多種昆蟲，其中包括鱗翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等。昆蟲細胞培養雖然受到了眾多科學家的青睞，近年來也得到了不斷深化與發展，但一株昆蟲細胞系的建立往往需要消耗大量的時間和精力，尤其與哺乳動物細胞日益成熟多樣的培養技術相比，昆蟲細胞的培養手段老化、單一，缺乏創新。到目前為止，來自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的細胞系共有6株，通常來源於初孵幼蟲、血細胞和脂肪體。甜菜夜蛾第一個細胞系UCR-SE-1由Gelernter和Federici(Gelernter, ff. D.和 B. A. Federici J.1nvertebr. Pathol. 1986,48 199 207)建立，第二株細胞系 Se3FH 是 Hara 等(Hara, K.，K. Tsuda, M. Funakoshi 和 T. KawarabataIn Vitro Cell. Dev. Biol. 1993,29A(12) :904 907)建立的，兩株細胞系均來源於甜菜夜蛾初孵幼蟲組織。第三株Le-H_HNU 7細胞系和第四株SeHe920-la細胞系來源於甜菜夜蛾血細胞，該細胞系對斜紋夜蛾核多角體病毒敏感。另外兩株是由本實驗室建立的來源於甜菜夜蛾幼蟲脂肪體的細胞系，這兩株細胞系對甜菜夜蛾核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒均非常敏感。儘管前述文獻已有甜菜夜蛾細胞系的有關報導，然而到目前為止，還沒有來源於甜菜夜蛾卵巢的細胞系。昆蟲的卵巢通常是成對的，是卵子發生和發育的場所。卵巢是由卵巢管(ovariole)組成，在各類昆蟲中卵巢管的數目差異很大，鱗翅目昆蟲一般為4、6或8條。自Grace利用卵巢組織建立了第一個昆蟲細胞系以來，卵巢一直是細胞系建立的重要組織來源。解剖將要羽化的蛹獲得的卵巢組織更易於操作，減少汙染機會。更多種類的昆蟲細胞系仍存在很大的需求，建立新的來源於昆蟲卵巢的細胞系，構建更加高效的杆狀病毒表達載體系統是十分有意義的。傳統的昆蟲細胞系建立方法通常是等待細胞自發轉化，因條件難以控制，常常由於汙染而前功盡棄。體外培養細胞成功傳代後，當培養到一定代數時，會進入生長抑制狀態，生命力明顯減弱，增殖能力下降，生長停滯並最終死亡。人工誘導體外培養細胞轉化是獲得細胞永生化的重要手段。在人工設計的誘變因素下使細胞發生轉化，轉化率較高，傳代細胞生長周期長、性狀穩定。在體外細胞培養過程中，人工誘發轉化包括化學、物理、生物(病毒)等各種誘變因素影響。在誘變劑存在下，體外培養的細胞DNA發生損傷，但此時細胞仍存活，細胞為了自己的生存而進行DNA的自我修復，因細胞本身就有許多自我修復DNA的酶存在，其修復過程是複雜的，但在這複雜的DNA修復過程中，也難免會發生修復錯誤，錯誤的修復可引起DNA結構的改變，修復結束，這種改變了的DNA結構就被固定下來，而不可逆。這就標誌著細胞DNA發生了遺傳性改變。在合適的條件下這種細胞就能不斷生長繁殖。單獨用化學致癌物誘導動物正常細胞系轉化，國內外均有報導(Nes now S，Garland H，Curt is G. Cancer let t, 1989 ；47 (1-2) :91 97. ；Tsuch iya T, UmedaM. Carcinogenes is. 1995 ；16 (8) : 1887 1894.)。甲基硝基亞硝基狐(MNNG)是人工合成的亞硝醯胺代表物，為常用的化學致癌劑，其烷化基團能與DNA鳥嘌呤的0-6位發生共價結合，形成加合物，導致鹼基錯配，從而誘發細胞轉化(範虹，董惠芬，蔣明森，明珍平，鍾沁萍，甲基硝基亞硝基胍對日本血吸蟲成蟲培養細胞骨架作用的研究，中國地方病學雜誌，2001,20(6) :401-403)。據國內報導，甲基硝基亞硝基胍多用於研究哺乳動物細胞的增殖。例如，1994年胡靜等報導的甲基硝基亞硝基胍對血管平滑肌細胞增殖的影響，明顯增強了細胞的DNA合成，顯著促進了細胞的分裂增殖(胡靜，溫進坤，魏素珍，左連富，甲基硝基亞硝基胍對血管平滑肌細胞增殖的影響，中華物理醫學雜誌，1994，16 (4) :211-213)。張文庚等利用MNNG誘導轉化並建立了人胎兒皮膚成纖維細胞系(張文庚，徐剛，王豔萍，陳曉兵，MNNG誘導轉化的人胎兒皮膚成纖維細胞系的建立，1994，16 (3) :125-128)。在無脊椎動物方面，MNNG多集中於對日本血吸蟲細胞誘導作用的研究,對日本血吸蟲成蟲培養細胞骨架、磷酸酶和鳥氨酶脫羧酶的作用；核仁組織區相關嗜銀蛋白的影響；對日本血吸蟲成蟲培養細胞增殖的研究等均有報導(範虹，董惠芬，蔣明森，明珍平，鍾沁萍，甲基硝基亞硝基胍對日本血吸蟲成蟲培養細胞骨架作用的研究，中國地方病學雜誌，2001，20 (6) =401-403 ;劉晴，董惠芬，蔣明森，明珍平，鍾沁萍，甲基硝基亞硝基胍對日本血吸蟲成蟲培養細胞磷酸酶影響的研究，中國血吸蟲病防治雜誌 ，2002,14(1) :14-16 ;範虹，黃敏，王倩，李曼軍，MNNG對日本血吸蟲成蟲細胞鳥氨酸脫羧酶活性作用的初步研究，中國寄生蟲學與寄生蟲病雜誌，2002，20(1) 35-36 ;鍾沁萍，明珍平，蔣明森，董惠芬，MNNG誘導對日本血吸蟲成蟲培養細胞核仁組織區相關嗜銀蛋白的影響，中國血吸蟲病防治雜誌，2009，21卷(5) =378-381 ；董惠芬，蔣明森，明珍平，鍾沁萍，楊明義，甲基硝基亞硝基胍誘導日本血吸蟲成蟲培養細胞增殖的研究，中國公共衛生，2000，16 (10) =883-884)。目前未見甲基硝基亞硝基胍(MNNG)用於鱗翅目昆蟲細胞誘導轉化的報導。通過甲基硝基亞硝基胍(MNNG)對甜菜夜蛾蛹卵巢原代細胞體外誘導並建立細胞系，為昆蟲細胞系的建立提供了新的方法與途徑。

發明內容
因此，本發明的目的是針對目前尚無甲基硝基亞硝基胍(MNNG)用於鱗翅目昆蟲細胞誘導轉化的不足，提供一種致癌劑誘導的高產病毒細胞系及其製備方法和應用，以為昆蟲細胞系的建立提供了新的方法與途徑。一方面，本發明提供一種致癌劑誘導的高產病毒卵巢細胞系，該細胞系的名稱為I0ZCAS-Spexl2，其保藏號為CGMCC No. 4808(分類命名甜菜夜蛾蛹卵巢細胞株，保藏日期，2011年05月03日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)。優選地，所述致癌劑為甲基硝基亞硝基胍。優選地，所述卵巢細胞係為甜菜夜蛾卵巢細胞系。另一方面，本發明提供一種致癌劑誘導的高產病毒卵巢細胞系的製備方法，在無菌的條件下進行，具體包括以下步驟步驟1:培養甜菜夜蛾卵巢細胞；步驟2 :用致癌劑誘導轉化步驟I中獲得的甜菜夜蛾卵巢細胞；和步驟3 :獲得致癌劑誘導轉化的高產杆狀病毒卵巢細胞系。優選地，在步驟I中，所述培養甜菜夜蛾卵巢細胞，包括以下步驟步驟1.1 :將甜菜夜蛾雌性蛹浸沒在3%次氯酸溶液中5分鐘，75%乙醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒，然後用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸乾蛹表面水分；步驟1. 2 :解剖昆蟲，取出甜菜夜蛾卵巢組織；步驟1. 3 :用生理鹽水清洗步驟1. 2中獲得的組織2-3次，再用細胞培養液清洗，清洗後把該組織放入含有ImL細胞培養液I潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養24小時；步驟1. 4 :加 入適量的細胞培養液II，使組織完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟1. 3同樣條件下培養；步驟1. 5 :每7-10天吸出半量的培養液，並同時換入半量新的細胞培養液II，直至觀察到不斷擴展並開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶。優選地，在步驟2中，所述致癌劑為甲基硝基亞硝基胍。優選地，所述步驟2的具體反應步驟如下換用含有3 U g/mL甲基硝基亞硝基胍(MNNG)的細胞培養液III，繼續在與步驟1. 3同樣條件下培養。優選地，在步驟3的具體反應步驟如下步驟3.1 :用含甲基硝基亞硝基胍(MNNG)的細胞培養液III培養甜菜夜蛾卵巢組織72小時後，相差顯微鏡觀察細胞狀態，換細胞培養液II，成功轉化的細胞繼續與步驟1. 3 :同樣條件下培養；步驟3. 2 :再與步驟1. 5相同的條件下培養細胞，直至獲得致癌劑誘導的高產病毒卵巢細胞系。再一方面，本發明提供一種致癌劑誘導的高產病毒卵巢細胞系在杆狀病毒生產中的應用，並且可使用杆狀病毒表達載體表達重組蛋白。優選地，所述杆狀病毒為甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。本發明方法所使用細胞培養液的說明本發明所使用的細胞培養液是常規採用的昆蟲細胞培養液與青黴素、鏈黴素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液PH在6. 0-6. 8之間。昆蟲細胞培養液可以是各種商品化的昆蟲細胞培養液，如TNM-FH，GraCe’s，Sf 900，TC-100, IPL-41, Ex-Cel 1400 等等。其中細胞培養液I為昆蟲細胞培養液與青黴素、鏈黴素、苯基硫脲和胎牛血清的混合物；細胞培養液II為昆蟲細胞培養液與青黴素、鏈黴素和胎牛血清的混合物；細胞培養液III為昆蟲細胞培養液與青黴素、鏈黴素、甲基硝基亞硝基胍(MNNG)和胎牛血清的混合物。通常，細胞培養液中青黴素含量為100U/mL、鏈黴素含量為100U/mL ;誘導轉化培養液為上述培養液含甲基硝基亞硝基胍(MNNG) 3 ii g/mL ;動物血清含量為細胞培養液的10% (體積比)。本發明利用甜菜夜蛾蛹卵巢細胞為實驗材料，通過致癌劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)誘導轉化的方法，建成了一株甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系，該細胞系對甜菜夜蛾核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒高度敏感。本發明中誘導轉化的甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系的生物學特徵觀察和測定1.經實驗觀察，該細胞系大部分為貼壁細胞，也有部分懸浮於培養液中。細胞的形狀有3種類型大部分細胞圓形、少部分梭形，較少橢圓形，易聚集形成細胞團。(圖1);2.10ZCAS-Spexl2對甜菜夜蛾核型多角體病毒及苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒敏感，可以觀察到典型的細胞病理特 徵，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒，感染率分別為91. 4%和65. 5% ;並且至少可以連續傳代3代。(圖2-3)3.按照McIntosh和 Ignoffo, 1989 (McIntosh, A. H.和 C. M.1gnoffo J.1nvertebr.Pathol. 1989，54 :97 102)的方法，測定第11代細胞生長曲線和群體倍增時間。以1.54X IO5細胞/mL的濃度接種到24孔培養板中，27°C培養，每48h測定細胞濃度，繪製生長曲線，並按公式T = tlg2/[lg(N/N0)]計算，第11代的細胞群體倍增時間為71. 06小時。其中T =在對數期平均增長一倍所需的時間t =接種到測定細胞數的時間NO =接種時的細胞數N =時刻t所測定的細胞總數4.按照 Takahashi 等 (Takahashi, Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop.Growth and Differ. 22 :11-19)的方法，測定了第12代細胞的核型。由於甜菜夜蛾的染色體數目 n = 31 (Hara,Tsuda,Funakoshi and Kawarabata In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993,29A(12) :904 907)，而I0ZCAS_Spexl2的染色體數目在116-131之間，因此，新建立的細胞系I0ZCAS-Spexl2由4倍體細胞組成(圖2)。5.使用 DAF-PCR 的方法(McIntosh, Grasela and Matteri (1996), Insect Mol.Biol. 5 187 195)鑑定了細胞系I0ZCAS-Spexl2確是來源於甜菜夜蛾，而非其它細胞系的汙染(圖4)。由I0ZCAS-Spexl2提取的DNA與甜菜夜蛾蛹DNA、甜菜夜蛾卵巢DNA、來源於甜菜夜蛾幼蟲脂肪體的IOZCAS-SpexI1-A的DNA擴增後主要的帶型相同；而與對照，來源於草地貪夜蛾的Sf9、美洲棉鈴蟲蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl的細胞帶型明顯不同。6.使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，並成功復甦。本發明中誘導轉化的甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系的差異基因表達分析I0ZCAS-Spexl2與IOZCAS-Spexll (對照，同樣來源於甜菜夜蛾蛹卵巢組織，未經MNNG處理)有10個基因在表達上具有顯著或極顯著差異。IOZCAS-SpexlI為本實驗室建立，同樣來源於甜菜夜蛾蛹卵巢組織，未經過MNNG處理的細胞系。其保藏號為CGMCC No. 4807(分類命名甜菜夜蛾蛹卵巢細胞株，保藏日期，2011年05月03日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為本發明所述的I0ZCAS_Spexl2的培養形態圖，圖中標尺所示為400 ii m ;圖2為本發明所述的I0ZCAS-Spexl2感染甜菜夜蛾核型多角體病毒後獲得大量的病毒多角體的形態圖，圖中標尺所示為200 y m ;圖3為本發明所述的I0ZCAS-Spexl2感染苜蓿銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒獲得大量的病毒多角體的形態圖，圖中標尺所示為200 ii m ;圖4為本發明所述的I0ZCAS_Spexl2的生長曲線；圖5為本發明所述的I0ZCAS_Spexl2的核型；圖6為DAF-PCR鑑定I0ZCAS_Spexl2的DNA指紋擴增圖譜，圖中I為甜菜夜蛾卵巢(Spodoptera exigua ovary)的圖譜，2 為甜菜夜蛾蛹(Spodoptera exigua pupa)的圖譜，3為脂肪體的IOZCAS-Spex I1-A的圖譜，4為草地貪夜蛾的Sf9的圖譜，5為美洲棉鈴蟲蛹卵巢的 BCIRL-Hz-AMl 的圖譜，6 為 I0ZCAS_Spexl2 的圖譜，7 為 DNA 標記(DNA Marker)的圖譜。

圖7為使用微管蛋白(tubulin)作為內參通過Real-Time PCR方法分析十個基因表達圖中縱坐標為基因相對表達量，橫坐標依次為SUM0-1激活酶(activatingenzyme), BCCIP-類蛋白(like protein)，小 HSP (small HSP), IOkDa HSP, GST, CypA,激活的 PKC 的受體(receptor for activated PKC), PDI 類蛋白 ERp57 (PDI like proteinERp57)，ALDH, ATP 依賴性的 RNA 解旋酶-類蛋白 DEAD 盒(DEAD box ATP-dependent RNAhelicase-like protein)。生物材料的保藏信息本發明的名稱為I0ZCAS_Spexl2的細胞系的保藏號為CGMCC No. 4808，分類命名甜菜夜蛾蛹卵巢細胞株，保藏日期，2011年05月03日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。名稱為IOZCAS-Spexll的細胞系的保藏號為CGMCC No. 4807，分類命名甜菜夜蛾蛹卵巢細胞株，保藏日期，2011年05月03日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
具體實施例方式實施例1 MNNG誘導甜菜夜蛾蛹卵巢細胞系的建立取末齡的甜菜夜蛾5天雌性蛹(來源於中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，甜菜夜蛾幼蟲使用人工飼料在26±1.5%°C，相對溼度65% -75%的條件下飼養。)浸沒在3%次氯酸溶液中5分鐘，75%乙醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒。解剖該蛹取出卵巢組織，操作時儘量保持其完整。用生理鹽水清洗該組織2-3次，再用細胞培養液I (以TNM-FH為主，含100U/mL的青黴素，100U/mL的鏈黴素和10%(v/v)的胎牛血清，pH = 6. 2)清洗2-3次，放入使用ImL細胞培養液潤洗過的25cm2的細胞培養瓶中，放入攝氏27°C無光照的細胞培養箱中培養24小時。然後加入3mL細胞培養液II，放入同樣條件下培養。注意該方法成功建立細胞系的關鍵是要使組織緊貼在細胞培養瓶底，勿使組織懸浮在細胞培養液中。以後每7-10天左右吸出半量的培養液，並同時換入半量的新培養液II。在此操作第3天後可以觀察到組織周圍游離出大量單個的細胞，並逐漸向外圍擴展。當原代細胞增殖至9天時，換用含3 ii g/mL甲基硝基亞硝基胍(MNNG)的細胞培養液III，72小時後換用正常細胞培養液II，27°C無光照的細胞培養箱中培養。誘導初期，並非所有細胞受到損傷，只有一小部分進入轉化發展階段，稱為癌前細胞，分散於未受損傷的細胞中。細胞繼續培養過程中正常細胞由於接觸抑制而停止分裂直至死亡，那些癌前細胞則由於失去接觸抑制的限制加快了繁殖生長的速度，進而持續不斷地分裂增殖。轉化的細胞接觸抑制消失，有堆積生長的趨勢。60天後當細胞增殖至將要鋪滿整個培養瓶時，細胞連同全部的培養液吸出放入新培養瓶中，並加入2mL新的細胞培養液II。細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第8天後開始第二次半量分瓶傳代，以後傳代時間維持在7天。傳到第11代時，傳代比1: 3，傳代時間維持在6天，細胞生長開始穩定，傳至第12代時，傳代時間已縮短至4-5天。最終該細胞系被命名為IOZCAS-Spexl2。實施例2 I0ZCAS-Spexl2的牛物學特件觀察和測定(I)形態特徵如圖1所示，經顯微鏡觀察，該細胞系細胞易於形成細胞團且可忍受高密度生長環境，突破了接觸抑制。細胞的形狀有3種類型圓形、梭形和橢圓形。大部分細胞貼壁。·(2)細胞的生長27°C下，細胞系第11代在含10%胎牛血清、100U/mL的青黴素、100U/mL的鏈黴素、g/mL甲基硝基亞硝基胍(MNNG)的TNM-Hl培養液中，群體倍增時間為71.06h。如圖4所示，細胞最高密度約可達1. 6X IO6個細胞/mL。(3)核型分析I0ZCAS-Spexl2第12代細胞是4倍體細胞，染色體數目範圍116-131 (2n = 62)，見圖 5。(4) DAF-PCR鑑定如圖6所示，細胞系I0ZCAS_Spexl2確是來源於甜菜夜蛾，而非其它細胞系的汙染。由I0ZCAS-Spexl2提取的DNA同於甜菜夜蛾蛹、甜菜夜蛾卵巢(均來源於中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，甜菜夜蛾幼蟲使用人工飼料在26±1. 5% °C，相對溼度65%-75%的條件下飼養。)和脂肪體(來源於中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，甜菜夜蛾幼蟲使用人工飼料在26 ±1. 5 % °C，相對溼度65 % -75 %的條件下飼養。請說明其來源)的DNA指紋擴增圖譜，而不同於草地貪夜蛾(來源於中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室)的Sf9、美洲棉鈴蟲蛹卵巢(來源於中國農業科學研究院生物技術研究所)的 BCIRL-Hz-AMl 的圖譜。(5)凍存和復甦使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，並可以成功復甦。實施例3.病毒敏感件I0ZCAS-Spexl2對多種核型多角體病毒敏感將SeNPV、AcMNPV及SpltNPV出芽型病毒粒子BV(均來源於中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室)以0. 001幼蟲當量/毫升的濃度接種I0ZCAS-Spexl2，培養7天後，通過倒置顯微鏡可以觀察到典型的細胞病理特徵，如圖2-3，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒。並且至少可以連續傳代3代。病毒感染率分別為91. 4%,81. 4%和31. 9%。實施例4.10ZCAS~Spexl2與IOZCAS-Soexll的差異某閔表汰分析使用Invitrogen 公司 Trizol 分別提取 I0ZCAS_Spexl2 與 IOZCAS-Spexll (對照，同樣來源於甜菜夜蛾蛹卵巢組織，未經MNNG處理)細胞的RNA，然後使用DNase I處理除去基因組 DNA。用 TakaRa 公司PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 試劑盒，將RNA反轉錄成完整的cDNA後，進行實時定量PCR反應，如圖7所示，表明I0ZCAS-Spexl2與IOZCAS-Spexll相比有10個基因在表達上具有顯著或極顯著差異。這10個基因及內參的反轉錄反應引物見表I。表1.實時定 量PCR反應引物序列.
權利要求
1.一種致癌劑誘導的高產杆狀病毒卵巢細胞系，該細胞系的名稱為I0ZCAS-Spexl2，其保藏號為CGMCC No. 4808。
2.根據權利要求1所述的卵巢細胞系，其特徵在於，所述致癌劑為甲基硝基亞硝基胍。
3.根據權利要求1所述的卵巢細胞系，其特徵在於，所述卵巢細胞係為甜菜夜蛾卵巢細胞系。
4.根據權利要求1至3任一項所述的卵巢細胞系的製備方法，包括以下步驟 步驟1:培養甜菜夜蛾卵巢細胞； 步驟2 :用致癌劑誘導轉化步驟I中獲得的甜菜夜蛾卵巢細胞；和 步驟3 :獲得致癌劑誘導轉化的高產杆狀病毒卵巢細胞系。
5.根據權利要求4所述的卵巢細胞系的製備方法，其特徵在於，在步驟2中，所述致癌劑為甲基硝基亞硝基胍。
6.根據權利要求1至3任一項所述的卵巢細胞系在杆狀病毒生產中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述杆狀病毒為甜菜夜蛾核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
全文摘要
本發明提供一種致癌劑誘導的高產杆狀病毒卵巢細胞系及其製備方法和應用，所述細胞系的名稱為IOZCAS-Spex12，其保藏號為CGMCC No.4808，所述致癌劑誘導的高產杆狀病毒卵巢細胞系的製備方法，包括以下步驟培養甜菜夜蛾卵巢細胞；用致癌劑誘導轉化步驟1中獲得的甜菜夜蛾卵巢細胞；獲得致癌劑誘導轉化的高產杆狀病毒卵巢細胞系；及所述致癌劑誘導的高產杆狀病毒卵巢細胞系在杆狀病毒生產中的應用。
文檔編號C12N5/07GK103060258SQ20111031740
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者李瑄, 張寰, 王紅託, 秦啟聯, 張繼紅, 苗麟, 張寧, 孟茜, 朱未, 周桂靈, 楊青 申請人:中國科學院動物研究所