一種抑制N－乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA表達載體的構建方法及應用的製作方法
2023-05-10 14:10:31 2
專利名稱：一種抑制N－乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA表達載體的構建方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域。更具體涉及一種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達載體的構建方法，同時還涉及一種能特異性靶向並抑制鼠N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V(Mouse Golgi β1，6N-acetylglucosaminyltransferase V，也稱為Mgat5)基因表達的特異性小分子發卡幹擾RNA(ShRNA，Small hairpin RNA)，在體內抑制乳腺癌細胞中的用途。
背景技術：
乳腺癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，在西方發達國家已成為婦女的第一位死亡原因，也是我國常見的九大惡性腫瘤之一，其發病率在全國居5位，死亡率居所有癌症的第9位。隨著人們對各期乳腺癌的大規模前瞻性臨床研究以及對乳腺癌生物學性的不斷認識，人們認識到乳腺癌從一開始就是一種全身性疾病，其治療效果取決於遠處微小轉移的控制程度。目前，國內外公認的乳腺癌治療方式是以手術治療為主，輔以放射治療，化學治療及內分泌治療(王小波，張麗玲，崔志強，2005，乳腺癌治療的回顧及其新進展，山西醫藥雜誌，34131-133)。由於乳腺癌細胞生物學行為複雜，上述各種治療方式均有各自的禁忌症和不良反應，如手術治療不適於已有遠處轉移、惡病質、伴有其他重要器官疾病的患者，乳房局部皮膚橘皮樣水腫面積超出乳房面積一半以上，皮膚有衛星結節，腫瘤直接侵犯胸壁，胸骨旁淋巴結腫大證實為轉移者，鎖骨上淋巴結腫大證實為轉移的患者也是手術治療的禁忌症。放射治療適用於有保乳需要的患者，但對臨床一期及淋巴結無轉移的病例術後進行放射治療非但未見能提高療效，反而可能影響機體的免疫系統。目前乳腺癌的化學治療建議採用多藥聯合化學治療方案，如CMF(環磷醯胺、甲氨蝶呤、氟脲嘧啶)方案，FAC(氟脲嘧啶、多柔比星和環磷醯胺)或FEC(氟脲嘧啶、多柔比星和環磷醯胺)方案，輔助化學治療不能治癒所有的病人。術後輔助化學治療一般僅能減少1/3病人的復發率，有1/5的病人可能提高生存率，且只對絕經前的病人效果好。內分泌治療就是通過阻斷激素與腫瘤作用的途徑來達到最終的治療目的，其具體方式有卵巢去勢，及使用他莫昔芬(三苯氧胺)、芳香化酶抑制劑等藥物，但切除卵巢會使患者失去生育功能，他莫昔芬會導致視網膜炎、肝功能障礙等不良反應。
隨著對乳腺癌細胞生物學行為基礎研究的深入，基因治療已經成為當前確有成效的全身性治療方法。人們發現癌細胞中糖結構往往發生改變，最常見的一種變化是細胞N聚糖的大小和分支增加，這種增加的糖鏈分支往往歸因於N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V(GlcNAc-TV，也成稱為Mgat5，是導致β1，6分支的糖基轉移酶)。糖鏈分支增加產生了用於末端唾液酸殘基另外的位點，與相應的唾液酸酶上調協同，最終導致全面的唾液酸化。除了聚糖核心結構改變之外，終端結構改變也與細胞惡變有關。Mgat5是蛋白糖基化中一重要糖基轉移酶，乳腺癌細胞高度糖基化，Mgat5活力增高(張樹政，2002，糖生物學與糖生物工程，清華大學出版社)。近年來，已有研究者使用基因敲除技術(Knock out)研究Mgat5的功能，Mgat5編碼的N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V受RAS-PAF-MAPK信號途徑的調控，而這恰好是腫瘤細胞活化的途徑之一。(James W，Dennis，Maria Granovsky，Charles E，Warren.Glycoprotein glycosylation and cancer progression.Biochimica etBiophysica Acta 1473(1999)21-34)。Mgat5-/-小鼠顯示出增強的腫瘤轉移抗性以及相關細胞因子的顯著變化(Granovsky.M.J.Fata.J，Pawling.W.J，Muiler.R.Khokhaand J.W.Dennis.2000.Suppression of tumor growth and metastasis in Mgat5 deficientmice.Nat.Med.6306)。此外，尚有研究者使用苦馬豆鹼(swainsonine)等抑制小鼠體內Mgat5的表達，均有相近的變化。然而這兩種途徑都存在諸如操作困難、成本較高及副作用大等缺憾。
發明內容
本發明的目的是在於提供一種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達載體的構建方法，該方法簡便，載體分子量小，能更快的滲入細胞，易於轉染，此外該載體可大量擴增，並可將其有效片段克隆至其它更好的載體上如腺病毒載體、慢病毒載體上，具有應用方便、特異性高、無免疫原性、無毒副作用。
本發明的另一個目的涉及N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達載體作為製備治療或預防乳腺癌藥物中的應用。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施RNA幹擾技術(RNA interference，RNAi，也譯作RNA幹預或者幹涉)是近幾年來發現並迅速發展的一種新的分子生物學技術，研究表明，一些小的雙鏈RNA(siRNA，small interfering RNA)可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型。將SiRNA構建於pSilence1.0-U6真核表達質粒上，成為shRNA，將其轉染細胞，篩選出特異阻斷體內特定基因表達的shRNA。
具體步驟製備shRNA真核表達載體shRNA1-Mgat5、shRNA2-Mgat5的步驟如下A.按照siRNA的靶序列選取原則，根據Genebank提供的小鼠MGAT5的基因序列(AF474155)，從編碼區中選取第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列，設計併合成引物設計、合成引物，引物由上海賽百盛公司合成，其序列為siRNA1-Oligo15』-TCGGGCTTCAAGATTGCGGTTCA-3’siRNA1-Oligo25』-AGCTTGAACCGCAATCTTGAAGCCCGAGGCC-3’siRNA1-Oligo35』-AGCTTCCGCAATCTTGAAGCCCGATTTTTT-3’siRNA1-Oligo45』-AATTAAAAAATCGGGCTTCAAGATTGCGGA-3’siRNA2-Oligo15』-AAGATTGAGCCGTATATGCCATTCA-3’siRNA2-Oligo25』-AGCTTGAATGGCATATACGGCTCAATCTTGGCC-3’siRNA2-Oligo35』-AGCTTTGGCATATACGGCTCAATCTTTTTT-3’siRNA2-Oligo45』-AATTAAAAAA GATTGAGCCGTATATGCCAA-3』B.將載體psilencer1.0-U6(美國Ambion公司)經ApaI、HindIII雙酶切，用回收試劑盒(美國promega公司)回收。
C.siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火。用雙蒸水稀釋引物至20pmol/μl，取siRNA1-up與siRNA1-down各2μl，加水補至20μl，95℃2～8分鐘，55℃10～20分鐘，自然冷卻至室溫(20～25℃)。siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火方式與此相同。
D.取1μl siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火退火產物，加入1μlpsilencer1.0-U6經ApaI、EcoRI雙酶切回收後的產物，1μlT4連接酶和2μl10×連接緩衝液(立陶宛MBI公司)，加雙蒸水補至20μl體系，置於4℃反應過夜。siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火產物的連接方法與本步驟相同。
E.將步驟D所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5α。取連接產物10μl，加入100μl DH5α感受肽細胞，冰浴30分鐘，42℃90秒，再冰浴5分鐘，加入800μl LB液體培養基(LB液體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37℃，225rpm振搖40～50分鐘。取200μl菌液均勻塗在有氨苄青黴素(Ampr)抗性的LB固體培養基(LB固體培養基為10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，15g瓊脂粉溶解至1000ml雙蒸水)上(氨苄青黴素濃度為50μg/ml)，37℃培養過夜。
F.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基(含氨苄青黴素50μg/ml)培養過夜。
G.提取步驟F獲得的菌液的質粒DNA。
H.所提質粒DNA經ApaI、HindIII酶切鑑定，選出正確質粒，此質粒再經ApaI、EcoRI雙酶切、回收，按步驟D的方法與siRNA1-Oligo3與siRNA1-Oligo4退火退火產物連接。
I.將步驟H所得的連接產物按步驟E的方法轉化至大腸桿菌DH5α。
J.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基(含氨苄青黴素50μg/ml)培養過夜，提取菌液的質粒DNA。
K.所提質粒DNA經ApaI、HindIII、EcoRI酶切鑑定，選出正確質粒，命名為shRNA1-Mgat5。
L.shRNA2-Mgat5的構建方法與shRNA1-Mgat5構建方法相同。
ShRNA1-Mgat5體外抑制MA782細胞(武漢大學細胞典藏中心購得)Mgat5基因表達及轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞在Balb/C小鼠的致瘤能力及腫瘤生長情況，該載體應用過程如下A.用質粒抽提試劑盒(美國Promega公司)提取shRNA1-Mgat5的高純質粒。
B.培養鼠乳腺癌細胞MA782。培養條件為10％胎牛血清的DMEM培養基(Gibco公司購買)，培養於37℃，含5％二氧化碳的培養箱中。
C.轉染前24小時接種5×105個生長狀態良好的MA782細胞於35mm培養皿，待其豐度為90％時，參照轉染試劑Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)說明書，將質粒shRNA1-Mgat5，shRNA2-Mgat5pSilencer1.0-U6分別轉染至MA782細胞。質粒DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)為4μg∶10μl。
D.轉染48小時後，棄培養上清，每孔加入1ml Trizol(美國invitrogen公司產品)裂解細胞，獲得細胞總RNA，再按Fergment cDNA第一鏈合成試劑盒(立陶宛MBI公司)說明書，合成cDNA第一鏈。
E.RNA逆轉錄PCR擴增(RT-PCR)。上遊引物為5』-AGCAGCTCCA-TGTTACGG-3』，下遊引物為5』-GACCAGATTGTCCACCTTT-3』。將上遊引物0.1nmol、下遊引物0.1nmol、10mmol/L MgSO4、2μl、10mmol/LdNTP 1μl、由美國Promega公司提供的10倍RT-PCR反應緩衝液5μl、DNA聚合酶2個活性單位、及步驟D所得的cDNA 1μl，使總體積為50μl，將其放入PCR儀中，94℃預變性3分鐘，然後按下列條件循環30次94℃30秒，55℃45秒，72℃1分30秒，再72℃10分鐘，得到Mgat5基因的PCR片段。
F.按步驟C所述接種轉染MA782細胞，轉染後72小時後，加入冰的含0.04％乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩衝液(PBS-EDTA，pH7.5)消化細胞，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液(PBS-BSA)洗滌細胞兩次，加入FITC-L-PHA(美國vector公司)使其終濃度為2.5μg/ml，避光，4℃放置25～35分鐘，加1ml PBS-BSA重懸，上流式細胞儀檢測FITC螢光強度。
G.檢測轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞在Balb/C小鼠的致瘤能力及腫瘤生長情況。
a.轉染前24小時接種5×106個生長狀態良好的MA782細胞於100mm培養皿，待其豐度為90％時，參照美國Invitrogen公司Lipofectamine2000轉染試劑說明書，將質粒shRNA1-Mgat5，shRNA2-Mgat5 pSilencer1.0-U6分別轉染至MA782細胞。質粒DNA(ug)∶Lipofectamine2000(μl)為15ug∶30μl。
b.轉染48小時後收穫細胞，重懸於磷酸鹽緩衝液PBS中，注射於小鼠背部右側皮下，注射劑量為4×106cells/100μl。
c.觀察腫瘤生成情況，待肉眼可見的腫瘤長出後，每日用遊標卡尺測量大小，瘤體體積按以下公式計算mm3＝0.53×短徑2×長徑。
d.荷瘤後第8天處死小鼠，取出瘤體測量並拍照。
本發明的優點本發明所得的shRNA真核表達載體分子量小，能更快的滲入細胞，易於轉染，能在多種腫瘤細胞系中有效抑制Mgat5基因的表達，並能抑制小鼠乳腺癌細胞在體、內外的增殖。此外該質粒可大量擴增，並可將其有效片段克隆至其它更好的載體上如腺病毒載體、慢病毒載體上，具有應用方便、特異性高、毒副作用小、無免疫原性，且既可以用於遏制乳腺癌早期發展，又可以對乳腺癌轉移進行全身治療，可作為有潛力的治療乳腺癌(Mammaryadenocarcinoma)的新型試劑或藥物。本發明為臨床治療乳腺癌提供了一種可能的新型試劑或藥物。本發明所提供的針對Mgat5基因表達的shRNA真核表達載體彌補了以上提及的手術、放，化療治療乳腺癌不足，並且顯示出了明顯的抑瘤作用。其最大的優點是可以高效、特異、快速的抑制乳腺癌細胞內癌基因的表達，
圖1.小鼠ShRNA1-Mgat5真核表達載體的構建流程圖1為DNA分子量marker；2、4和6為shRNA1-Mgat5分別被ApaI、HindIII和EcoRI酶切消化；3、5和7為pSilencer1.0-U6分別被ApaI、HindIII和EcoRI酶切消化。
圖2.小鼠ShRNA1-Mgat5真核表達載體的鑑定示意圖。
1為DNA分子量marker；2、4和6為shRNA1-Mgat5分別被ApaI、HindIII和EcoRI酶切消化；3、5和7為pSilencer1.0-U6分別被ApaI、HindIII和EcoRI酶切消化。
圖3，圖4.小鼠Mgat5 shRNA真核表達載體(shRNA1-Mgat5)特異性幹擾鼠乳腺癌MA782細胞中Mgat5的表達示意圖。
圖3為shRNA1-Mgat5和無效幹擾RNA質粒shRNA2-Mgat5及空載pSilencer1.0-U6分別轉染小鼠乳腺癌細胞MA782，轉染後48小時提取細胞總RNA進行RT-PCR，泳道1為未轉染的對照細胞組的Mgat5的表達，泳道2轉染空載pSilencer1.0-U6的細胞的Mgat5的表達，泳道3為轉染無效幹擾RNA質粒shRNA2-Mgat5的細胞Mgat5的表達，泳道4即為轉染有效幹擾RNA質粒shRNA1-Mgat5的細胞Mgat5的表達。
圖4為轉染後72小時，細胞被FITC標記的L-PHA染色，經流式細胞儀檢測細胞表面的FITC螢光強度。
圖5，圖6.小鼠荷瘤實驗觀察轉染shRNA1-mgat5的MA782細胞在小鼠體內的生長受到明顯抑制。
圖5為將shRNA1-Mgat5，shRNA2-Mgat5，pSilencer1.0-U6分別轉染MA782細胞後，將細胞種植倒BalB/C鼠右側背部皮下，觀察各組小鼠腫瘤生成情況。其中黑線表示轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞在小鼠體內的腫瘤生成曲線，紅線和藍線分別表示轉染shRNA2-Mgat5和pSilencer1.0-U6的MA782細胞在小鼠體內的腫瘤生成曲線，綠線表示未經轉染的MA782細胞在小鼠體內的腫瘤生成曲線。
圖6為荷瘤第8天處死小鼠，取出瘤體的腫瘤實物圖。
具體實施例方式
1、設計引物，構建載體(圖1)。
A.按照siRNA的靶序列選取原則，根據Genebank提供的小鼠MGAT5的基因序列(AF474155)，從編碼區中選取第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列，設計併合成引物設計、合成引物(上海賽百盛公司合成)，引物為siRNA1-Oligo15』-TCGGGCTTCAAGATTGCGGTTCA-3’siRNA1-Oligo25』-AGCTTGAACCGCAATCTTGAAGCCCGAGGCC-3’siRNA1-Oligo35』-AGCTTCCGCAATCTTGAAGCCCGATTTTTT-3’siRNA1-Oligo45』-AATTAAAAAATCGGGCTTCAAGATTGCGGA-3’siRNA2-Oligo15』-AAGATTGAGCCGTATATGCCATTCA-3’siRNA2-Oligo25』-AGCTTGAATGGCATATACGGCTCAATCTTGGCC-3’siRNA2-Oligo35』-AGCTTTGGCATATACGGCTCAATCTTTTTT-3’siRNA2-Oligo45』-AATTAAAAAAGATTGAGCCGTATATGCCAA-3』
B.將載體psilencer1.0-U6(美國Ambion公司)經ApaI、HindIII雙酶切，用回收試劑盒(美國promega公司)回收。
C.siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火。用雙蒸水稀釋引物至20pmol/μl，取siRNA1-up與siRNA1-down各2μl，加水補至20μl，95℃5分鐘，55℃15分鐘，自然冷卻至室溫(24℃)。siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火方式與此相同。
D.取1μl siRNAl-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火退火產物，加入1μlpsilencer1.0-U6經ApaI、EcoRI雙酶切回收後的產物，1μl T4連接酶和2μl10×連接緩衝液(立陶宛MBI公司)，加雙蒸水補至20μl體系，置於4℃反應過夜。siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火產物的連接方法與此相同。
E.將步驟D所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5α(美國invitrogen公司購買)。取連接產物10μl，加入100μl DH5α感受肽細胞，冰浴30分鐘，42℃90秒，再冰浴5分鐘，加入800μl LB液體培養基(10g胰蛋白腖，5g酵母提取物，10g氯化鈉，溶解至1000ml雙蒸水)，37℃，225rpm振搖45分鐘。取200μl菌液均勻塗在有氨苄青黴素(Ampr)抗性的LB固體培養基上(氨苄青黴素濃度為50μg/ml)，37℃培養過夜。
F.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基(含氨苄青黴素50μg/ml)培養過夜。
G.提取步驟F獲得的菌液的質粒DNA。
H.所提質粒DNA經ApaI、HindIII酶切鑑定，選出正確質粒，此質粒再經ApaI、EcoRI雙酶切、回收，按步驟D的方法與siRNA1-Oligo3與siRNA1-Oligo4退火退火產物連接。
I.將步驟H所得的連接產物按步驟E的方法轉化至大腸桿菌DH5α。
J.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基(含氨苄青黴素50μg/ml)培養過夜，提取菌液的質粒DNA。
K.所提質粒DNA經ApaI、HindIII、EcoRI酶切鑑定(圖2)，選出正確質粒，命名為shRNA1-Mgat5。ShRNA2-Mgat5的構建方法與shRNA1-Mgat5構建方法相同步驟1所獲得的真核表達載體shRNA1-Mgat5為閉合環狀質粒，大小為3310bp，載體主要部分為ColE1 origin，F1 origin，Ampr，mouse U6promotor，及插入序列5』-AAACGTCCGCCAGCAATACCATTCAAGCTTTGGTATTGCTGGCGGACGTTTTTTT-3』。該載體儲存於大腸桿菌DH5α，用LB液體培養基培養擴增，培養溫度為37℃。
ShRNA1-Mgat5體外抑制MA782細胞(武漢大學細胞典藏中心購得)Mgat5基因表達及轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞在Balb/C小鼠的致瘤能力及腫瘤生長情況。
所構建的shRNA1-Mgat5真核表達式載體在預防或治療乳腺癌苗中的應用過程是A.用質粒抽提試劑盒(美國Promega公司)提取shRNA1-Mgat5的高純質粒。
B.培養鼠乳腺癌細胞MA782。培養條件為10％胎牛血清的DMEM培養基(美國Gibco公司)，培養於37℃，含5％二氧化碳的培養箱中。
C.轉染前24小時接種5×105個生長狀態良好的MA782細胞於35mm培養皿，待其豐度為90％時，參照轉染試劑Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)說明書，將質粒shRNA1-Mgat5，shRNA2-Mgat5pSilencer1.0-U6分別轉染至MA782細胞。質粒DNA(μg)∶Lipofectamine2000(μl)為4μg∶10μl。
D.轉染48小時後，棄培養上清，每孔加入1ml Trizol(美國invitrogen公司產品)裂解細胞，獲得細胞總RNA，再按Fergment cDNA第一鏈合成試劑盒(立陶宛MBI公司)說明書，合成cDNA第一鏈。
E.RNA逆轉錄PCR擴增(RT-PCR)。上遊引物為5』-AGCAGCTCCA-TGTTACGG-3』，下遊引物為5』-GACCAGATTGTCCACCTTT-3』。將上遊引物0.1nmol、下遊引物0.1nmol、10mmol/L MgSO4、2μl、10mmol/LdNTP 1μl、由美國Promega公司提供的10倍RT-PCR反應緩衝液5μl、DNA聚合酶2個活性單位、及步驟4所得的cDNA 1μl，使總體積為50μl，將其放入PCR儀中，94℃預變性3分鐘，然後按下列條件循環30次94℃30秒，55℃45秒，72℃1分30秒，再72℃10分鐘，得到Mgat5基因的PCR片段。我們發現轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞的Mgat5的表達量明顯低於其它組(圖3)F.按步驟C所述接種轉染MA782細胞，轉染後72小時後，加入冰的含0.04％乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩衝液(PBS-EDTA，pH7.5)消化細胞，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液(PBS-BSA)洗滌細胞兩次，加入FITC-L-PHA(美國vector公司)使其終濃度為2.5μg/ml，避光，4℃放置25～35分鐘，加1ml PBS-BSA重懸，上流式細胞儀檢測FITC螢光強度。我們發現轉染ShRNA1-Mgat5的MA782細胞的FITC螢光強度明顯低於其它組(圖4)，提示β1，6分支的N糖鏈的表達減少，進一步說明了合成該糖鏈的Mgat5的表達受到抑制(表1)。
表1 L-PHA-FITC染色檢測MA782細胞表面N-聚糖表達
G.檢測轉染shRNA1-Mgat5的MA782細胞在Balb/C小鼠的致瘤能力及腫瘤生長情況。
a.轉染前24小時接種5×106個生長狀態良好的MA782細胞於100mm培養皿，待其豐度為90％時，參照美國Invitrogen公司Lipofectamine2000轉染試劑說明書，將質粒shRNA1-Mgat5，shRNA2-Mgat5 pSilencer1.0-U6分別轉染至MA782細胞。質粒DNA(μg)∶Lipofectamine2000(μl)為15μg∶30μl。
b.轉染48小時後收穫細胞，重懸於磷酸鹽緩衝液PBS中，注射於小鼠背部右側皮下，注射劑量為4×106cells/100μl。
c.觀察腫瘤生成情況，待肉眼可見的腫瘤長出後，每日用遊標卡尺測量大小，瘤體體積按以下公式計算mm3＝0.53×短徑2×長徑。每組9隻小鼠(n＝9)，shRNA1-Mgat5轉染的MA782細胞其致瘤性明顯低於其它組(圖5)，腫瘤生長緩慢(表2)，經x2檢驗P＜0.05，具有統計學意義。
表2不同處理組的MA782細胞荷瘤小鼠後腫瘤生長情況(mm3)(均數±標準誤)
n＝9，P＜0.05，d.荷瘤後第8天處死小鼠，取出瘤體測量並拍照(圖6)。ShRNA1-Mgat5處理組的小鼠腫瘤明顯低於其它對照組。
SEQUENCE LISTING-------------------110武漢大學120一種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA表達載體構建方法及應用130一種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA表達載體構建方法及應用1408141Patentin version 3.1Sequence--------213OrganismNamesiRNA1-Oligo1400PreSequenceStringtcgggcttcaagattgcggttca23212TYpeDNA211Length23SequenceName1SequenceDescription合成Sequence--------213OrganismNamesiRNA1-Oligo2400PreSequenceStringagcttgaaccgcaatcttgaagcccgaggcc31212TypeDNA
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SequenceDescription合成Sequence--------213OrganismNamesiRNA2-Oligo2400PreSequenceStringagcttgaatggcatatacggctcaatcttggcc33212TypeDNA211Length33SequenceName6SequenceDescription合成Sequence--------213OrganismNamesiRNA2-Oligo3400PreSequenceStringagctttggcatatacggctcaatctttttt 30212TypeDNA211Length30SequenceName7SequenceDescription合成Sequence--------213OrganismNamesiRNA2-Oligo4400PreSequenceStringaattaaaaaagattgagccgtatatgccaa 30212TypeDNA211Length30SequenceName8SequenceDescription合成
權利要求
1.一種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達載體的構建方法，其特徵是包括下列步驟A.根據Genebank提供的MGAT5的基因序列，從編碼區中選取第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列，設計併合成引物，引物為siRNA1-Oligo15』-TCGGGCTTCAAGATTGCGGTTCA-3’siRNA1-Oligo25』-AGCTTGAACCGCAATCTTGAAGCCCGAGGCC-3’siRNA1-Oligo35』-AGCTTCCGCAATCTTGAAGCCCGATTTTTT-3’siRNA1-Oligo45』-AATTAAAAAATCGGGCTTCAAGATTGCGGA-3’siRNA2-Oligo15』-AAGATTGAGCCGTATATGCCATTCA-3’siRNA2-Oligo25』-AGCTTGAATGGCATATACGGCTCAATCTTGGCC-3’siRNA2-Oligo35』-AGCTTTGGCATATACGGCTCAATCTTTTTT-3’siRNA2-Oligo45』-AATTAAAAAAGATTGAGCCGTATATGCCAA-3』B.將載體psilencer1.0-U6經ApaI、HindIII雙酶切，用回收試劑盒回收；C.siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火，用雙蒸水稀釋引物至20pmol/μl，取siRNA1-up與siRNA1-down各2μl，加水補至20μl，95℃ 2～8分鐘，55℃ 10～20分鐘，冷卻至室溫，siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火方式與本步驟相同；D.取1μl siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火退火產物，加入1μlpsilencer1.0-U6經ApaI、EcoRI雙酶切回收後的產物，1μl T4連接酶和2μl 10×連接緩衝液，加雙蒸水補至20μl體系，置於4℃反應過夜，siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火產物的連接方法與本步驟相同；E.將步驟D所得的連接產物分別轉化至大腸桿菌DH5α，取連接產物10μl，加入100μl DH5α感受肽細胞，冰浴30分鐘，42℃ 90秒，再冰浴5分鐘，加入800μl LB液體培養基，37℃，225rpm振搖40～50分鐘，取200μl菌液均勻塗在有氨苄青黴素抗性的LB固體培養基上，37℃培養過夜；F.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基培養過夜；G.提取步驟F獲得的菌液的質粒DNA；H.所提質粒DNA經ApaI、HindIII酶切鑑定，選出正確質粒，此質粒再經ApaI、EcoRI雙酶切、回收，按步驟D的方法與siRNA1-Oligo3與siRNA1-Oligo4退火退火產物連接；I.將步驟H所得的連接產物按步驟E的方法轉化至大腸桿菌DH5α；J.挑取單個克隆菌落，置於3ml LB液體培養基培養過夜，提取菌液的質粒DNA；K.所提質粒DNA經ApaI、HindIII、EcoRI酶切鑑定，選出質粒，為shRNA1-Mgat5。
2.種抑制N-乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達質粒在製備治療或預防乳腺癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制N－乙醯葡萄糖胺轉移酶V的shRNA真核表達載體的構建方法及應用，其步驟是根據Genebank提供的MGAT5的基因序列，選取編碼區第836－856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列設計併合成引物，通過引物退火，連接至載體psilencer1.0－U6，得到真核表達載體shRNA1－Mgat5，將shRNA1－Mgat5轉染至乳腺癌細胞MA782，能明顯抑制MA782細胞在小鼠體內生長，該質粒在製備治療或預防乳腺癌的藥物中的應用，前景廣泛。
文檔編號C12N1/19GK1936012SQ200610019800
公開日2007年3月28日 申請日期2006年8月3日 優先權日2006年8月3日
發明者章曉聯, 李冬青 申請人:武漢大學