用於測定包含tc1507事件的玉米的接合性的端點taqman法的製作方法

2023-05-09 19:49:01

專利名稱：用於測定包含tc1507事件的玉米的接合性的端點taqman法的製作方法
用於測定包含TC1507事件的玉米的接合性的端點TAQMAN法
背景技術：
Herculex^ I是ー種對昆蟲損害(特別是歐洲玉米螟的)有抗性的商業玉米產品，其包含CrylF事件TC1507。該事件本身披露於例如美國專利No. 7，605，310和7，449，564。可以使用多種方法來檢測玉米樣品中的此事件的存在。一個例子是焦磷酸測序(pyrosequencing)技術，如由 Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24，2000)所描述的。在此方法中，設計與相鄰的基因組DNA和插入DNA連接重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自感興趣區域的單鏈PCR產物(在插入序列中的一條引物和在側翼基因組序列中的一條)雜交，並在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5』磷酸硫酸酯和螢光素的情況中溫育。個別添加DNTP，並且摻入導致測量的光信號。由於成功擴增、雜 交、和單或多鹼基延伸，光信號指示轉基因插入/側翼序列的存在。(此技木通常用於初始的測序，在特定基因已知時不用於其檢測)。螢光偏振是另ー種可以用於檢測擴增子的方法。遵循此方法，將寡核苷酸設計為與基因組側翼和插入DNA連接重疊。將寡核苷酸與來自感興趣區域的單鏈PCR產物(在插入DNA中的一條引物和在側翼基因組DNA序列中的一條)雜交，並在存在DNA聚合酶和經螢光標記的ddNTP的情況中溫育。單鹼基延伸導致ddNTP的摻入。可以使用螢光計以偏振變化測量摻入。由於成功擴增、雜交、和單鹼基延伸，偏振變化指示轉基因插入/側翼序列的存在。TAQMAN(Life Technologies, Foster City, Calif.)是一種檢測並量化 DNA 序列的存在的方法。簡言之，將FRET寡核苷酸探針設計為轉基因內的一種寡聚物和側翼基因組序列中的一種以進行事件特異性檢測。在存在熱穩定性聚合酶和dNTP的情況中循環FRET探針和PCR引物(在插入DNA序列中的一條引物和在側翼基因組序列中的一條)。FRET探針的雜交導致對螢光模塊的切割和釋放，遠離FRET探針上的淬滅模塊。由於成功擴增和雜交，螢光信號指示側翼/轉基因插入序列的存在。已經描述了分子信標(Molecular Beacon)在序列檢測中使用。簡言之，設計與側翼基因組和插入DNA連接重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨特結構導致其含有使螢光和淬滅模塊保持極其接近的ニ級結構。在存在熱穩定性聚合酶和dNTP的情況中循環FRET探針和PCR引物(在插入DNA序列中的一條引物和在側翼基因組序列中的一條)。在成功的PCR擴增後，FRET探針與靶序列的雜交導致除去探針ニ級結構和空間分離螢光和淬滅模塊。由於成功擴增和雜交，螢光信號指示側翼基因組/轉基因插入序列的存在。許多中的另ー個考驗是尋找適合於給定測試的參照基因。例如，如Czechowski等的摘要中所述的，「來自Affymetrix ATHl全基因組GeneChip研究的格外大的數據集提供了鑑定在模式植物物種擬南芥屬(Arabidopsis)(擬南芥(Arabidopsis thaliana))中具有非常穩定的表達水平的新一代參照基因的手段。找到貫穿發育及在一系列環境條件下就表達穩定性而言勝過傳統的參照基因的數百種擬南芥基因。」 (Czechowski等(2005)Genome-wide identification and testing of superior reference genes fortranscript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol.139，5 - 17)。Brodmann等(2002)涉及歐盟批准的4種不同玉米品種的食物中的轉基因玉米含量的實時定量 PCR 檢測。Brodmann，P. D.，P. D.，Ilg E. C. , Berthoud H.和 Herrmann，A.Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four GeneticallyModified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international2002 85(3) oHernandez等(2004)提及與實時PCR —起使用的4種可能的基因。Hernandez, M.，Duplan, M. -N.，Berthier, G.，Vaitilingom, M.，Hauser, W.，Freyer, R.，Plaj M.衝:ロ Bertheau, Y. Development and comparison oi four real-time polymerase chainreaction systems for specific detection and quantification of Zea maysL J. Agric. Food Chem. 2004，52，4632-4637。 Costa等(2007)考慮這4種基因(也在實時PCR背景中)，並且推斷醇脫氫酶和玉米醇溶蛋白基因是用於檢測轉基因飼料混合組織的樣品「事件」(凝集素基因)的最好的參照基因。Costa，L D.和 Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Basedon Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically ModifiedSoybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007，55，1264—1273。Huang等(2004)使用質粒pMulM2作為參照分子來檢測玉米中的M0N810和NK603轉基因。Huang 和 Pan，「Detection of Genetically Modified Maize M0N810 and NK603by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods，，，J. Agric. FoodChem.，2004，52 (11)，pp 3264 - 3268。Gasparic等(2008)通過與循環探針技術、TaqMan、和各種實時PCR化學比較提示了 LNA技術，以定量分析玉米事件(諸如M0N810)。Gasparic, Cankar, Zel和Gruden，「Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitabilityfor detection and quantification of genetically modified organisms, 」 BMCBiotechnol.2008;8:26。US 20070148646涉及ー種用於量化的引物延伸方法，其需要可以通過摻入的核苷酸量檢測並量化的個別核苷酸的受控分配。這與使用內部參照基因的TaqMan PCR方法不同。為了區別TC1507的純合子和半合子基因型，已經為此事件成功使用Invader測定法。Gupta，M.，Nirunsuksiri, W.，Schulenberg, G.，Hartl, T.，NovaKj S.，Bryan, J.，Vanopdorp, N. , Bing, J.和 Thompson，S. A non-PCR-based Invaaer Assay Quantitatively DetectsSingle-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008，21，173-181。Huabang(2009)涉及轉基因玉米的基於PCR的接合性測試。然而，似乎沒有使用參照基因。Huabang，「An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method forGenetically Modified Maize，』』Molecular Plant Breeding，2009，Vol. 7，No. 3，619-623.發明概述本發明部分涉及用於測定玉米中的事件TC1507的接合性的分子測定法。更具體地，本發明部分涉及利用玉米內源參照基因的用於玉米中的Hercidex l事件TC1507的端點TaqMan PCR測定法。一些實施方案涉及能夠高通量接合性分析的測定法。本發明進一步部分涉及用於測定接合性的優選參照基因的發現。附圖
簡述圖I顯示了樣品數目與S0B1/S0B2的絕對比率間的分布圖的例子。圖2是TC1507與調查的不同參照基因的二重(biplex)組合的實時PCR擴增圖。用CrylF純合子基因組DNA的2倍連續稀釋液分別對TC1507與ivr (2a)、hmg(2b)、ivrl04(2c)、和zein(2d)的二重顯示實時PCR擴增圖。用每個稀釋液得到的Ct值在其相應的圖內部顯示。圖3是使用不同參照基因用端點TaqMan的CrylF接合性測定的分布圖。對於使用ivrl04(a)、ivr (b)、hmg(c)和zein(d)作為參照基因的測定法,小圖如下。在完成PCR和螢光讀數後，產生分布圖=SOBl=FAM的高於背景的信號(於535nm的高於背景信號平均 值的樣品信號)、S0B2=Cy5的高於背景的信號(於670nm的高於背景信號平均值的樣品信號)。對於ivrl04(a)，可以進行基因型調用(call)，其中對於野生型，S0B1/S0B2〈0. 5，對於半合子，0. 5〈S0B1/S0B2〈2，而對於純合子，S0B1/S0B2>2。圖4顯示了對三個群體(對於每個群體為2塊96孔板的基因組DNA)使用ivrl04作為參照基因用端點TaqMan測定法的CrylF接合性測定的驗證。在完成PCR和螢光讀數後，產生分布圖=SOBl=FAM的高於背景的信號(於535nm的高於背景信號平均值的樣品信號的比率)、S0B2=Cy5的高於背景的信號(於670nm的高於背景信號平均值的樣品信號的比率)。因而，用純合子、半合子和野生型的獨特簇進行基因型調用。圖4a是對Cry34/35PoCrylF疊加群體用端點TaqMan測定法的CrylF接合性測定的分布圖。圖4b是對PoCrylF單ー疊加群體用端點TaqMan測定法的CrylF接合性測定的分布圖。圖4c (PoCry 1F_NK603)僅具有兩個簇(純合子和半合子)，因為如預期的，WT植物未倖免於除草劑噴霧。序列簡述SEQ ID NO: I是玉米事件TC1507的5』側翼序列的序列。SEQ ID N0:2是玉米事件TC1507的3』側翼序列的序列。SEQ ID NO: 3是玉米事件TC1507的連續序列，其包含5』側翼序列、crylF插入物、和3』側翼序列。SEQ ID N0s:4_21是依照本發明使用的例示的引物和探針。發明詳述本發明部分涉及基於螢光的端點TaqMan PCR測定法，其利用內源基因作為參照(拷貝數)對照以對TC1507(即ー種玉米CrylF事件)進行高通量接合性分析。本發明進一歩部分涉及優選的參照基因轉化酶的發現。將幾種參照基因鑑定為可能的選項。本發明還部分涉及用於TC1507事件特異性接合性分析的二重端點TaqMan PCR的開發。此外，本發明部分涉及TC1507育種測試試劑盒的開發。端點TaqMan測定法基於+/_策略，根據該策略，「 + 」表示樣品在測定的基因方面呈陽性，而表示樣品在測定的基因方面呈陰性。這些測定法通常利用分別用於鑑定TC1507轉基因序列和野生型基因序列的兩組寡核苷酸以及測量轉基因和野生型序列含量的經雙重標記的探針。雖然Invader測定法已經是一種用於表徵這些事件的穩健技術,但是它對DNA質量非常靈敏。另外，該測定法需要較高的DNA數量。Invader還需要額外的變性步驟，若不正確操作，它可使Invader測定法不成功。另外，Invader測定法的較長測定時間在其有效加工商業背景中分析的大量TC1507樣品的靈活性上受到限制。本發明的ー個主要優點是節省時間的且消除變性步驟。用於檢測TC1507事件的主題端點TaqMan分析提供與Invader相比的令人驚訝的優點，特別是在分析大量樣品中。然而，其對TC1507的應用是複雜的。舉例而言，TC1507的邊界區不是實際的基因組序列。例如，它含有重複側翼序列。它是ー種含有轉基因片段和反轉錄轉座子的獨特序列，其會被理解為ー種執行此上下文中的端點Taqman測定法+/-策略的非常顯著的障礙。另外，例如，嘗試多種引物和探針組合。然而，那些組合無一導致能夠區別野生型等位基因和轉基因的強力信號。在一個實施方案中，TC1507事件特異性PCR反應擴增出對於事件獨特的58_bp片段，其源自TC1507構建體盒對玉米基因組DNA的插入。TC1507靶物特異性寡核苷酸探針 結合兩種事件特異性PCR引物間的靶物，並且用螢光染料和淬滅劑標記。可能的螢光標記物包括在TC1507探針5』端作為報告物染料的FAM和在TC1507探針3』端作為淬滅劑的Black Hole Quencher I (BHQl)。使用一批經驗因素以及我們的判斷，我們憑經驗鑑定出如下的玉米內源基因，其能夠單或低拷貝數PCR擴增，並且證明了其在許多栽培種中是保守的。大量參照基因是可能性。我們為了初始評估選擇的參照基因作為TC1507接合性分析的可能的參照基因評估。選出5組寡聚物(表I) :ivr、ivrl04 (來自轉化酶的79和104bp片段)、adh (來自adhl的136bp片段)、hmg(來自hmga的79bp片段)、和zein (來自玉米醇溶蛋白的72bp片段)。評估基因特異性引物和基因特異性探針(在一個實施方案中用探針5』端的Cy5和探針3』端的Black Hole Quencher 2 (BHQ2)標記)以在作為TC1507接合性分析的可能的參照基因評估的玉米內源基因的快速量化中使用。對CrylF基因和玉米內源基因的基因特異性引物和探針測試PCR效率。對多重化(multiplexing)性能和端點TaqMan接合性測定法進ー步利用測定為與CrylF事件特異性引物和探針具有相對相似的PCR效率的玉米內源基因的引物和探針組合。對所有寡聚物測試PCR效率。對多重化和端點TaqMan接合性測定法進ー步利用與事件特異性寡聚物具有相對接近的PCR效率的寡聚物。在一些實施方案中，此接合性測定法在相同擴增測定法中利用對TC1507事件和對玉米內源參照基因(在一些優選的實施方案中為轉化酶)特異性的寡核苷酸的二重。通過與參照DNA相比，對事件TC1507特異性的螢光的相對強度來測定接合性。在一些實施方案中，TC1507事件特異性測定法擴增出對於事件獨特的58-bp片段，其源自TC1507構建體盒對玉米基因組DNA的插入。靶物特異性寡核苷酸探針結合兩種事件特異性TC1507 PCR引物間的靶物，並且用兩種螢光染料標記在其5』端作為報告染料的FAM和在其3』端作為淬滅劑染料的BHQ。在最佳循環數後測量PCR產物，此時反應處於早期指數期。在一些實施方案中，玉米特異性參照系統擴增出轉化酶基因的104bp片段。使用一對轉化酶特異性寡聚物和在3』端用Cy5和在5』端用BHQ標記的轉化基因特異性探針進行快速定量。在一些實施方案中，用於TC1507接合性分析的基於螢光的端點TaqMan測定法容許在讀板儀中直接讀取結果以鑑定玉米中的HcrcuIcx屮[事件TC1507和參照基因。本發明包括育種應用諸如測試Herculex I對其它玉米系的基因滲入Untrogression,澌滲入)。可以使用本發明的檢測方法和試劑盒來鑑定依照本發明的事件。可以使用本發明的方法和試劑盒進行加速的育種策略及建立連鎖數據。本發明的檢測技術與植物育種一起特別是有用的，以在將包含感興趣事件的親本植物與另ー種親本系雜交以在後代中賦予ー種或多種感興趣的其它性狀後，測定哪些後代植物是否包含給定的事件。這些Taqman PCR分析法使玉米育種程序及質量控制受益，尤其對於商業化的轉基因玉米種子。現在還可以生成並使用用於這些轉基因玉米系的Taqman PCR檢測試劑盒。這還可以使產品登記和產品管理受益。
此外，可以使用本發明來研究並表徵轉基因整合過程、基因組整合位點特徵、事件分選、轉基因及其側翼序列的穩定性、和基因表達(尤其是涉及基因沉默、轉基因甲基化模式、位置效應和潛在的表達相關元件諸如MARS [基質附著區]等)。本發明進ー步包括使用TC1507植物作為至少一個親本進行雜交的方法。例如，本發明包括具有本文中例示的任何植物作為ー個或兩個親本的Fl雜種植物。本發明包括一種用於生產Fl雜種種子的方法，其通過將例示的植物與不同(例如，近交親本)植物雜交，收穫所得的雜種種子，並測試依照本發明的種子/植物樣品來進行。可以通過仔細考慮親本植物來改善所得植物的特徵。可以如下育種昆蟲抗性玉米植物，即首先將由自本文中提及的任一種系的種子種植的玉米植物組成的第一親本玉米植物與第二親本玉米植物有性雜交，由此生成多個第一後代植物；然後選出對昆蟲有抗性(或擁有本發明的至少ー個事件)的第一後代植物；並自交第一後代植物，由此生成多個第二後代植物；然後自第二後代植物選出對昆蟲有抗性(或擁有本發明的至少ー個事件)的第二後代植物。這些步驟可以進ー步包括第一後代植物或第二後代植物與第二親本玉米植物或第三親本玉米植物的回交。然後，可以種植包含本發明的玉米種子的玉米作物或其後代。還應當理解，也可以將兩種不同轉基因植物雜交以生成含有兩個獨立分離的添加的外源基因的後代。合適後代的自交可以生成在這兩種添加的外源基因方面純合的植物。因為是無性繁殖，所以也涵蓋與親本植物回交和與非轉基因植物的異型雜交。通常用於不同性狀和作物的其它育種方法是本領域中已知的。已經使用回交育種來將簡單遺傳的、高度可遺傳性狀的基因轉移入期望的純合栽培種或近交系(其作為回歸親本)中。要轉移的性狀的來源稱作供體親本。預期所得的植物具有回歸親本(例如栽培種)的屬性和自供體親本轉移的期望的性狀。在初始雜交後，將擁有供體親本表型的個體選出並與回歸親本重複雜交(回交)。預期所得的親本具有回歸親本(例如栽培種)的屬性和自供體親本轉移的期望的性狀。本發明的DNA分子在標誌物輔助育種(MAB)方法中可以作為分子標誌物使用。本發明的DNA分子可以在鑑定遺傳連鎖的農藝學有用的性狀的方法(諸如AFLP標誌物、RFLP標誌物、RAPD標誌物、SNPjP SSR)中使用，如本領域中已知的。可以使用MAB方法在與本發明的玉米植物(或其後代及任何其它玉米栽培種或品種)的雜交後代中追蹤昆蟲抗性性狀。DNA分子是此性狀的標誌物，並且可以使用本領域中公知的MAB方法來在玉米植物中追蹤昆蟲抗性性狀，其中本發明的至少ー種玉米系或其後代是親本或祖先。可以使用本發明的方法來鑑定具有來自玉米系TC1507的昆蟲抗性事件的任何玉米品種。本發明的方法包括ー種生成昆蟲抗性玉米植物的方法，其中所述方法包括用本發明的植物育種。更具體地，所述方法可以包括雜交本發明的兩種植物，或本發明的ー種植物和任何其它植物，並追蹤依照本發明的主題事件。優選的方法進ー步包括通過對所述後代分析依照本發明可檢出的事件來選擇所述雜交的後代。依照本發明繁殖並開發的一種優選的植物，或種子包含在其基因組中至少ー種插入物序列(如表I中鑑定的)，以及在插入物的兩側上的至少20-500或更多個連續側翼核苷酸(如表I中鑑定的)。除非另有指示，「事件TC1507」或類似的提及指SEQ ID N0:3的DNA,其包含通過與插入DNA緊密相鄰的整個或部分SEQ ID NO: I和/或SEQ ID NO: 2側翼基因組序列兩者(預期其會由於包含該事件的親本系的有性雜交而轉移至接受插入DNA的後代)鑑定的基因組位置中插入的異源DNA。 本文中提供了定義和例子以幫助描述本發明，並且指導本領域普通技術人員實施本發明。除非另有記錄，應當依照相關領域普通技術人員的常規用法理解術語。使用DNA鹼基的命名，如於37CFR§ I. 822列出的。轉基因「事件」如下產生，即用異源DNA，即包含感興趣轉基因的核酸構建體轉化植物細胞、源自轉基因插入植物基因組的植物群體的再生、並選擇以插入特定的基因組位置中為特徵的特定植物。術語「事件」指包含異源DNA的初始轉化體和轉化體的後代。術語「事件」也指通過轉化體和包含基因組/轉基因DNA的另一品種間的有性異型雜交產生的後代。即使在對回歸親本進行重複回交後，插入的轉基因DNA和來自所轉化親本的側翼基因組DNA (基因組/轉基因DNA)在雜交後代中也存在於相同的染色體位置。術語「事件」也指來自初始轉化體及其後代的DNA，該DNA包含插入的DNA和緊鄰插入DNA的側翼基因組序列，由於包含所插入DNA的親本系(例如初始轉化體和自交後代)和不含所插入DNA的親本系間的有性雜交，可以預期該DNA會轉移到接受包含感興趣轉基因在內的插入DNA的後代中。「連接序列」跨越插入基因組中的DNA與在插入點側翼的玉米天然基因組的DNA連接的點，在植物遺傳物質中鑑定或檢測出ー個或另一個連接序列便足以診斷該事件。包括跨越本文中所描述的玉米事件中的插入物和類似長度的側翼DNA的DNA序列。本文中提供了此類診斷序列的具體例子；然而，與各插入物的連接，或插入物與基因組序列的連接重疊的其它序列也是診斷性的，並且可以依照本發明使用。部分基於側翼、連接、和/或插入序列設計依照本發明使用的引物、擴增子和探針。相關引物和擴增子可以作為本發明的組分包括在內。可以使用PCR分析方法來檢測或鑑定源自主題專利轉基因玉米系的商業化轉基因玉米品種或系，所述PCR分析方法使用跨越整個插入DNA及其邊界的擴增子。HERCULEX I (TC1507事件)的5，側翼序列的序列以SEQ ID NO: I提供。3，側翼序列的序列以SEQ ID N0:2提供。側翼有(SEQ ID N0s:l和2的)側翼序列的crylF插入物(與調節序列一起)的序列以SEQ ID NO: 3提供。表I提供了就SEQ ID NO: 3而言的插入物和側翼序列的坐標。
權利要求
1.一種用於測定玉米組織中的TC1507事件的接合性的方法，所述TC1507事件包含含有crylF基因的轉基因構建體，所述方法包括使用基於螢光的端點Taq PCR測定法來檢測所述TC1507事件和內源參照基因， 所述方法包括 自所述玉米組織獲得基因組DNA的樣品， 使所述樣品與下列各項接觸 a.事件正向弓I物和事件反向引物，其中至少一種所述事件弓I物特異性結合所述轉基因構建體，且其中在存在於所述樣品中時，所述引物生成所述事件診斷性的事件擴增子， b.參照正向引物和參照反向引物，其自所述內源參照基因生成參照擴增子， c.螢光事件探針，其與所述事件擴增子雜交， d.螢光參照探針，其與所述參照擴增子雜交， 定量與所述事件擴增子雜交的所述螢光事件探針， 定量與所述參照擴增子雜交的所述螢光參照探針， 比較雜交的螢光事件探針與雜交的螢光參照探針的量；並 通過比較雜交的螢光事件探針和雜交的螢光參照探針的螢光比率來測定TC1507的接合性。
2.權利要求I的方法，其中一種事件引物與TC1507側翼序列雜交，而一種事件引物與所述轉基因構建體雜交。
3.權利要求2的方法，其中所述TC1507側翼序列選自下組SEQID N0:1和SEQ IDN0:2。
4.權利要求2的方法，其中所述轉基因構建體是SEQID NO:3的殘基2830-9015。
5.權利要求I的方法，其中所述參照基因是內源玉米轉化酶基因。
6.權利要求2的方法，其中所述側翼序列是SEQID NO:3的殘基2629-2829。
7.權利要求2的方法，其中所述側翼序列是SEQID NO: 3的殘基9016-9216。
8.權利要求5的方法，其中所述方法用於所述TC1507事件對另一種玉米系的育種基因滲 入。
9.權利要求8的方法，其中所述另一種玉米系是空TC1507玉米系。
10.權利要求I的方法，其中所述事件擴增子是58個鹼基對。
11.權利要求5的方法，其中所述參照基因包含選自下組的序列或與選自下組的序列雜交SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、和 SEQ ID NO:9。
12.權利要求I的方法，其中所述參照引物包含SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，且所述參照探針包含SEQ ID NO:9。
13.權利要求I的方法，其中所述探針是用螢光染料和淬滅劑標記的。
14.權利要求13的方法，其中所述事件探針包含在所述事件探針的5』端作為所述螢光染料的FAM和在所述事件探針的3』端上作為所述淬滅劑的Black Hole QuencherI(BHQl)。
15.權利要求I的方法，其中所述參照基因是能夠單或低拷貝數PCR擴增的保守玉米內源基因。
16.權利要求13的方法，其中所述參照探針在所述參照探針的5』端用Cy5並在所述參照探針的 3，端用 Black Hole Quencher 2 (BHQ2)標記。
17.權利要求12的方法，其中所述參照擴增子是通過所述引物擴增的104個鹼基對的片段。
18.權利要求I的方法，其中所述參照探針包含SEQID N0:9。
19.權利要求I的方法，其中所述參照正向引物包含SEQID N0:7，且所述參照反向引物包含 SEQ ID NO:8。
20.權利要求I的方法，其中在讀板儀中直接讀取所述方法的結果。
21.權利要求I的方法，其中自田間的玉米植物獲得所述樣品。
22.一種用於實施權利要求I的方法的試劑盒，所述試劑盒包含 a.事件正向引物和事件反向引物，其中至少一種所述事件引物特異性結合所述cryIF轉基因構建體，且其中在存在於所述樣品中時，所述引物生成所述事件診斷性的事件擴增子; b.參照正向引物和參照反向引物，其自所述內源參照基因生成參照擴增子； c.事件探針，其與所述事件擴增子雜交；和 d.參照探針，其與所述參照擴增子雜交。
全文摘要
提供了一種用於對玉米Cry1F事件TC1507的接合性分析的方法。該方法提供了在端點二重TaqMan PCR測定法中使用的TC1507事件特異性和玉米內源參照基因特異性引物和TaqMan探針組合，其能夠產生幫助TC1507分子育種的強力基因型調用(call)。
文檔編號C12P19/34GK102770553SQ201080064269
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月18日
發明者M.古普塔, S.庫姆帕特拉, S.諾瓦克, T.W.格裡尼, W.陳, W.馬奇奧尼 申請人:陶氏益農公司