含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液及其使用方法

2023-05-10 09:32:11

含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液及其使用方法
【專利摘要】含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液、其使用方法以及包含脫蠟緩衝液的試劑盒。所述脫蠟緩衝液含有沸點至少為80℃的水溶性有機溶劑。本文所述脫蠟緩衝液可用於在水性緩衝溶液中以及升高的溫度下快速並有效地去除裝載在玻片上的組織切片上的包埋石蠟，同時無須擔心玻片上的石蠟再沉積。此外，本文所述脫蠟緩衝液可用於在單個步驟中進行脫蠟和HIER，從而大幅減少實驗時間並降低樣品損失或損壞的風險。
【專利說明】含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液及其使用方法
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年1月23日提交的美國專利申請號13/356,491的優先權，其內 容通過引用全文納入本文。
[0003] 背景
[0004] 作為一種組織學研究中製備組織樣品所用的包埋介質，石蠟已經被使用了很長時 間。在一些情況下，塑料樹脂也被用作包埋介質。這類包埋過程通常包括以下步驟：樣品 固定（如福馬林固定）、脫水、清洗、石蠟浸潤或浸漬、封閉或包埋在一塊石蠟中，將石蠟 塊和樣品切成薄片，將切片裝載在玻片上、去除石蠟和用於該目的（即脫蠟或脫石蠟）的溶 齊IJ、以及在鏡檢前對切片進行染色。包埋介質的主要目的是使樣品在天然狀態下被切片和 裝載。石蠟包埋的優勢在於可在染色前將蠟溶解使之與樣品分離，從而使染色時切片為裸 露組織的形式並且避免了與難以去除的基於樹脂的包埋材料的存在相關的額外困難。
[0005] 最近對於石蠟包埋組合物的改進拓寬了其實用性，同時保留了其與下遊樣品製備 和分析的相容性。因此，對固定後石蠟包埋材料切片的脫蠟仍是一種廣泛使用的方法，尤其 是在免疫診斷目的的醫院組織病理學實驗室中。
[0006] -種通常使用的脫蠟方法涉及在有機溶劑中溶解包埋的石蠟。例如，目前通常在 實驗方案中使用二甲苯（一種可燃、有揮發性和毒性的有機溶劑）以溶解石蠟，實現對樣品 切片的脫蠟。通常，將裝載在顯微鏡玻片上的樣品浸入二甲苯浴中直至石蠟溶解。
[0007] 另一種常用於脫蠟的方法涉及在含水性緩衝溶液的熱浴中熔解並去除包埋的石 蠟。使用熱緩衝溶液的額外優勢在於其可通過一種被稱作熱誘導表位修復（"HIER")的過 程進行抗原修復。HIER是一種常在免疫組化（"IHC")或原位雜交（"ISH")前使用的預處理 過程，用於通過對裝載在玻片上的樣品材料中所含靶蛋白的分子構象進行熱誘導修飾以改 善染色。通常該修飾過程是必需的，因為雖然醛基固定劑（如福馬林）能夠很好地保存 細胞形態，但它們也會引起蛋白交聯，導致一些蛋白表位無法結合互補的抗體。HIER通常與 酶消化聯用，作為改善IHC/ISH染色反應中多種抗原反應性的方法。
[0008] 現有的被設計用來在IHC/ISH前同時對玻片脫蠟並進行HIER的緩衝液配方利用 了低濃度的表面活性劑和其他乳化劑以破碎石蠟。HIER步驟中玻片被置於高溫（如70至 l〇〇°C)下，使石蠟熔化且表面活性劑溫和地將石蠟運送至緩衝液表面。然而，已知的緩衝 液配方和方法的性能有限，有時會造成石蠟拖尾、玻片重新塗覆和不一致的染色結果。
[0009] 相應地，需要能夠在免疫組化或其他診斷分析前有效地去除樣品中的石蠟或改良 的石蠟基包埋材料的脫蠟組合物和方法，同時最小化對使用者的危險，與自動系統相容且 保持與下遊分析的相容性。需要不存在毒性或致癌性或毒性或致癌性有限、不產生或產生 最少量的氣味、能夠降低有毒溶劑的使用量，使有毒廢物最少和/或能夠降低腐蝕性和可 燃性的脫蠟組合物和方法。


【發明內容】

[0010] 本發明公開了含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液及其使用方法以及包含脫蠟緩衝 液的試劑盒。本文所述脫蠟緩衝液可用於在高溫下的水性緩衝溶液中快速並有效地去除裝 載在玻片上的組織切片中的包埋的石蠟，同時無需擔心玻片上石蠟的再沉積。此外，本文所 述脫蠟緩衝液可在單個步驟用於脫蠟和HIER，能夠大幅減少實驗方案的時間並降低樣品損 失或破壞的風險。
[0011] 在一個實施方式中，一種脫蠟緩衝液包括緩衝劑、沸點高於80°C且在水中的溶解 度至少為20體積百分比（〃V〇l%〃）的有機溶劑和水。所述脫蠟緩衝液的工作溶液可包括 大於95vol%的水。在一個實施方式中，可使用濃縮脫蠟緩衝劑，通過用水稀釋濃縮液以制 備脫蠟緩衝液工作溶液。
[0012] 在一個方面，所述脫蠟緩衝液能夠在高溫下在水性溶液中溶解熔解後的包埋石蠟 且熔解後的石蠟在冷卻後不會發生再固化。同樣，所述脫蠟緩衝液能夠降低石蠟的熔點，這 可以大幅減少實驗方案的時間。人們認為該活性是由於水溶性有機溶劑的作用。也就是 說，由於溶劑化學性質的雙重性，人們認為該溶劑能夠在水性溶液中破壞氫鍵，並在水中溶 解有機分子（如石蠟）。
[0013] 通過以下描述和所附權利要求書或者通過學習下文中所述的本發明的實踐，可以 更充分地理解本發明的這些和其他目的及特徵。
[0014] 發明詳述
[0015] I?引言
[0016] 本發明公開了含水溶性有機溶劑的脫蠟緩衝液及其使用方法以及包含脫蠟緩衝 液的試劑盒。本文所述脫蠟緩衝液可用於在高溫下的水性緩衝溶液中快速並有效地去除裝 載在玻片上的組織切片中的包埋石蠟。本文所述脫蠟緩衝液能夠溶解熔解後的包埋石蠟， 這意味著可從脫蠟緩衝液中移出玻片同時無需擔心玻片上石蠟的再沉積。本文所述脫蠟緩 衝液能夠降低石蠟的熔點，這可以大幅減少實驗方案的時間。同樣，因為是在水性溶液中對 裝載在玻片上的組織樣品進行脫蠟，所以脫蠟前無需對組織樣品進行脫水。這也可大幅減 少玻片處理的時間。此外，本文所述脫蠟緩衝液可在單個步驟用於進行脫蠟和HIER，能夠大 量減少實驗方案的時間並降低樣品損失的風險。
[0017] II?脫蠟緩衝液
[0018] 在一個實施方式中，描述了一種脫蠟緩衝液。所述脫蠟緩衝液包括緩衝劑、沸點高 於80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（〃v〇l%〃）的有機溶劑和水。在一個實施 方式中，所述脫蠟緩衝液的pH範圍為約pH 5至約pH 10,或者約pH 6至約pH 9。但通常 可根據優選用於特定組織類型或特定脫蠟實驗方案的PH選擇任意的pH。
[0019] 在一個實施方式中，所述脫蠟緩衝液能夠在水中溶解有機分子（如石蠟）。人們 認為有機溶劑的主要作用在於這一特性。然而，如下文所詳細討論的那樣，在脫蠟期間和脫 蠟後，脫蠟緩衝液的各組分協同作用以穩定細胞結構，從而有效且完全地去除裝載在玻片 上的組織樣品中的包埋蠟，避免包埋蠟在玻片上再沉積並在脫蠟期間和脫蠟後穩定細胞結 構。
[0020] 在一個實施方式中，所述有機溶劑的沸點為至少90°C、至少100°C、至少110°C、至 少120°C、至少130°C、至少140°C、至少150°C、至少160°C、至少170°C、至少180°C、至少 190°C或至少200°C。但通常沸點較高的溶劑（如沸點高於IKTC的溶劑）優於沸點較低的 溶劑（如沸點低於約75°C的溶劑）。例如，一些HIER實驗方案要求在高溫（如高於80°C) 下將玻片在脫蠟緩衝液中孵育約1-20小時。在這類情況下，沸點較高的溶劑從緩衝液中蒸 發的可能性較小，如果發生蒸發則會隨著時間降低緩衝液溶解蠟的能力。同樣，優選沸點較 高溶劑的原因在於由於其不易蒸發的事實，其產生溶劑氣味的可能性較小。
[0021] 在一個實施方式中，所述脫蠟緩衝液的工作溶液可包括約0. Ivol %、0.2v〇l %、 0? 25vol %、0? 3vol %或 0? 4vol % 的下限量的有機溶劑，約 5vol %、3vol %、2vol %、Ivol % 或0. 5vol %的上限量的有機溶劑，或列出的下限量和上限量的任意組合。在一個優選實 施方式中，所述緩衝液包括約〇.25vol %的有機溶劑。所含有機溶劑量低至0. Ivol %至 0. 25v〇l%的本文所述脫蠟緩衝液能夠溶解裝載在玻片上的組織樣品中的大量包埋蠟。應 當理解的是，可使用如此少量的有機溶劑在水性溶液中溶解包埋蠟是出乎意料的。
[0022] 在一個實施方式中，所述有機溶劑可具有約20vol%、25vol%、30vol%、35vol%、 40vol %、45vol % 或 50vol % 的下限範圍水溶性，99vol %、95vol %、90vol %、85vol %、 80vol %、75vol %、70vol %、65vol %、60vol %、55vol %、50vol % 的上限範圍水溶性，或列 出的下限和上限水溶性限值的任意組合。在一個優選實施方式中，所述有機溶劑與水互溶 (即可以任意比例混合溶劑和水）。
[0023] 在一個實施方式中，合適的具有上文所述特性且可包含於脫蠟緩衝液中的有機溶 劑的示例包括但不限於脂肪族化合物、醇、醛、酮和雜環有機化合物的酯類衍生物（如氧雜 環丁烷、呋喃、四氫呋喃、吡喃、四氫吡喃、噻丁環、噻吩、四氫噻吩、噻喃或四氫噻喃）。例 如，已知的四氫呋喃（也被稱作氧戊環）衍生物包括但不限於甲基四氫呋喃、四氫呋喃醇、 2_(羥基甲基）氧戊環-3-醇、糖呋喃亞甲基（2_((四氫糠基）氧基）乙醇）、2_(羥基甲 基）氧戊環_3, 4-二醇、二羥基甲基四氫呋喃、甲基四氫呋喃羧酸鹽等。其他上文所列化合 物的衍生物包括但不限於四氫噻吩基甲醇、四氫吡喃基甲醇、（氧雜環丁烷氧基）甲醇和呋 喃醇。
[0024] 在另一個實施方式中，所述有機溶劑至少是糠醛、糠醇、甲基四氫呋喃、四氫呋喃 醇、二甘醇二甲醚、二甘醇、二甲基甲醯胺、二甲亞碸、二噁烷、二乙醇胺、丙二醇或其衍生物 中的一種。
[0025] 在一個優選實施方式中，所述有機溶劑是四氫呋喃醇（"THFA")。THFA的沸點約 178°C，這意味著其不易蒸發，其可與水混容、氣味極少、非反應性、毒性低且易於生物降解。 此外，THFA來源於農業產品（如玉米芯和甘蔗渣）且其不是石油蒸餾的產物。在另一個優 選實施方式中，所述有機溶劑是甲基四氫呋喃（"me-THF")。me-THF的許多特性與THFA相 同，除了 me-THF的沸點為約78-80°C。下文的式1和2分別顯示了 THFA和me-THF的結構。
[0026]

【權利要求】
1. 一種脫蠟緩衝液，所述脫蠟緩衝液包括： 緩衝劑； 沸點高於80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（"vol% 〃）的有機溶劑；以及 水。
2. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述脫蠟緩衝液能夠降低包埋石蠟的熔點並能夠 在水性溶液中至少部分溶解包埋石蠟。
3. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑的沸點高於100°C。
4. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑的沸點高於150°C。
5. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑在水中的溶解度為至少0. 3vol %至 lvol %。
6. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑與水互溶。
7. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑是氧雜環丁烷、呋喃、四氫呋喃、批 喃、四氫吡喃、噻丁環、噻吩、四氫噻吩、噻喃或四氫噻喃的脂族、醇、醛、酮、或酯衍生物中的 至少一種。
8. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述有機溶劑是糠醛、糠醇、甲基四氫呋喃、四氫 呋喃醇、二甘醇二甲醚、二甘醇、二甲基甲醯胺、二甲亞碸、二噁烷、二乙醇胺、丙二醇或其衍 生物中的至少一種。
9. 如權利要求1所述的脫錯緩衝液，進一步包括約0. 5vol%至約2vol%的多官能醇。
10. 如權利要求9所述的脫蠟緩衝液，所述多官能醇是聚乙二醇（'1^6〃）、聚丙二醇 (〃PPG〃）或糖醇中的至少一種。
11. 如權利要求9所述的脫蠟緩衝液，所述多官能醇是PEG 200、PEG 300、PEG 400或 PEG 600中的至少一種。
12. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述脫蠟緩衝液進一步包括約0. 2vol %至約 4vol%的表面活性劑。
13. 如權利要求12所述的脫蠟緩衝液，所述表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽 離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑及其組合。
14. 如權利要求1所述的脫蠟緩衝液，所述水構成所述脫蠟緩衝液的超過95vol %。
15. -種脫蠟方法，所述方法包括： 提供裝載在玻片上的組織切片，所述組織切片至少部分包埋於包埋石蠟中； 將所述裝載在玻片上的組織切片浸入脫蠟緩衝液中，所述脫蠟緩衝液包括： 緩衝劑； 沸點高於80°C且在水中的溶解度至少為20體積百分比（"vol% 〃）的有機溶劑； 約0. 5vol%至約2vol%的多官能醇；以及 至少95vol %的水； 將所述裝載在玻片上的組織切片在脫蠟緩衝液中在選定溫度下孵育足夠對所述裝載 在玻片上的組織切片進行脫蠟的一段時間，所述脫蠟緩衝液能夠使所述包埋石蠟至少部分 溶解於所述脫蠟緩衝液中； 冷卻所述脫蠟緩衝液；以及 將所述裝載在玻片上的組織切片從所述脫蠟緩衝液中移出。
16. 如權利要求15所述的方法，所述脫蠟緩衝液能夠將包埋石蠟的熔點降低至少5°C。
17. 如權利要求15所述的方法，100ml的所述脫蠟緩衝液能夠溶解至少lg至5g石蠟。
18. 如權利要求15所述的方法，所述脫蠟緩衝液在約58-62°C或以上溫度下能夠溶解 所述裝載在玻片上的組織切片中基本全部的包埋石蠟。
19. 如權利要求15所述的方法，所述脫蠟緩衝液能夠在約55°C的溫度下溶解所述裝載 在玻片上的組織切片中約7-12%的包埋石蠟且在低於55°C的溫度下溶解所述裝載在玻片 上的組織切片中約5%的包埋石蠟。
20. 如權利要求15所述的方法，所述孵育包括： 在約室溫下將所述裝載在玻片上的組織切片浸入所述脫蠟緩衝液中； 在所述脫蠟緩衝液中將所述裝載在玻片上的組織切片預熱至約85°C ; 將其中浸有所述裝載在玻片上的組織切片的所述脫蠟緩衝液的溫度提高至約97°C ; 使所述裝載在玻片上的組織切片在約97°C下在所述脫蠟緩衝液中孵育10分鐘至24小 時； 將其中浸有所述裝載在玻片上的組織切片的所述脫蠟緩衝液的溫度冷卻至約85°C。
21. -種試劑盒，所述試劑盒包括： 濃縮脫蠟試劑，包含： 緩衝劑； 沸點高於約80°C且在水中的溶解度至少為2〇V〇1%的有機溶劑； 約 7. 5vol %至約 30vol % 的 PEG 200 ;以及 至少47vol%水；以及 實驗方案，所述實驗方案包括稀釋所述濃縮脫蠟試劑以製備脫蠟緩衝液的指示和將裝 載在玻片上的組織切片在所述脫蠟緩衝液中進行脫蠟的方法的說明。
22. 如權利要求21所述的試劑盒，所述試劑盒還包括第一濃縮脫蠟試劑、第二濃縮脫 蠟試劑和第三濃縮脫蠟試劑，所述第一濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 6時提供緩衝的第 一緩衝劑，所述第二濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 8時提供緩衝的第二緩衝劑，所述第三 濃縮脫蠟試劑含有能夠在約pH 9時提供緩衝的第三緩衝劑。
23. 如權利要求22所述的試劑盒，所述第一、第二和第三濃縮脫蠟試劑各自包括所述 有機溶劑、PEG 200和水。
24. 如權利要求22所述的試劑盒，所述第一濃縮脫蠟試劑包括第一著色劑，所述第二 濃縮脫蠟試劑包括第二著色劑且所述第三濃縮脫蠟試劑包括第三著色劑，且所述第一、第 二和第三著色劑的作用是用於通過視覺區分所述第一、第二和第三濃縮脫蠟試劑。
25. 如權利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機溶劑的沸點高於約150°C。
26. 如權利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機溶劑在水中的溶解度為至 少 4. 5vol % 至 15vol %。
27. 如權利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機溶劑與水互溶。
28. 如權利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫蠟試劑的有機溶劑是甲基四氫呋喃或四 氫呋喃醇中的至少一種。
29. 如權利要求21所述的試劑盒，所述濃縮脫錯試劑還包括約3vol %至約15vol %的 表面活性劑。
30. 如權利要求29所述的試劑盒，所述表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽離子 型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑及其組合。
31. -種脫蠟緩衝液，所述脫蠟緩衝液包括： 選自檸檬酸鹽、EDTA-HEPES和Tris-EDTA的緩衝劑； 含量為0. lvol%至0. 75vol%的四氫呋喃醇； 含量為〇? 5vol%至2vol%的聚乙二醇200 ; 含量為0. lvol %至0. 75vol %的表面活性劑，所述表面活性劑選自辛基酚乙氧基化 物、聚氧乙烯（20)山梨糖醇酐單月桂酸酯及其組合；以及 水。
【文檔編號】C12N5/00GK104334717SQ201380015622
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年1月18日 優先權日:2012年1月23日
【發明者】J·H·弗裡蘭德, M·A·哈維 申請人:理查艾倫科學公司