消炎用藥程式的製作方法

2023-05-09 20:17:51

專利名稱：：消炎用藥程式的製作方法
技術領域：
：本發明涉及某種異類黃烷酮化合物、包含所述化合物的組合物以及所述化合物和/或組合物在治療，具體是炎症和疾病中的應用。炎症包括應激性腸道病(IBD)例如潰瘍性結腸炎(UC)、潰瘍性直腸炎、末端結腸炎和/或克羅恩病(CD)，以及其它肝腸症候群(hepatointestinalsyndromes)包括原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(AIH)和應激性腸道症候群(IBS)。
背景技術：
：UC引起大腸(結腸和直腸)內壁炎症。CD引起腸壁全層炎症並可累及從口腔到肛門的消化道任何部分。CD可引起復發性腸梗阻、瘻管、膿腫形成和敗血症以及腸外症狀如關節炎。IBD常發生於15-30年齡段，大約13，000澳大利亞人患有UC，10，000人患有CD。據美國克羅恩病和結腸炎基金會估計有多達1，000,000的美國人患有IBD，其每年的直接和間接的花費約為5520億美元。而且，有研究提示患IBD的人更可能發生結腸癌。IBD的病因還未知。然而，看來這些症候群受免疫介導，炎症過程受環境和遺傳因素的影響。醫學治療有助於控制炎症過程，並用於急性和慢性疾病，以及維持疾病的緩解。尚沒有完全有效的治療措施，當前的治療是用消炎(皮質激素、氨基水楊酸鹽)、免疫抑制、免疫治療或手術來緩解炎症和/或減輕免疫應答。治療的目的是引起並維持疾病緩解、最大程度降低治療伴有的副作用。高達80%的UC患者和35%的CD患者在症狀緩解後一年內會復發(Podolsky，D.K.(2002)"對炎性腸病今後的理角軍(Thecurrentfutureunderstandingofinflammatoryboweldisease)"BestPractice&ResearchinClinicalGastroenterology16(6):933-43)。另夕卜，現有療法中沒有一種不產生副作用。因此，IBD藥物開發的'聖杯(holygrail)，是能維持疾病緩解的無毒性成分(Feagan2003"炎性腸病的維持療法(Maintenancetherapyforinflammatoryboweldisease)，，TheAmericanJournalofGastroenterology98(12,副刊1):S6-S17)。原發性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(A加和原發性硬化性膽管炎(PSC)的發病機理可能是自身免疫為基礎的慢性肝臟疾病。PSC看來與UC相關聯。在PSC和PBC中，膽管發炎、結疤並最終阻塞，引起膽汁淤積、肝細胞損傷許多病例引起肝功能衰竭。應激性腸道症候群(IBS)是稱為功能性腸胃疾病(包括疾病如非心臟性胸痛、非潰瘍性消化不良和慢性便秘或腹瀉)的疾病中的一員。這些疾病全部以無法找到組織或生化病因的慢性或復發性胃腸症狀為特徵。在美國IBS影響了2500-5500萬人。在西方國家的普通人群中IBS的流行率為6-22%不等。IBS影響14-24%的婦女和5-19%男性。在高加索裔和非裔美國人中所述流行率相似，但看來在西班牙裔中較低。儘管有幾項研究報導老年人中IBS流行率較低，目前的研究還無法明確地得出IBS中是否存在年齡差異的結論。在非西方國家如日本、中國、印度和非洲，IBS也似乎很常見。因此，需要新的方法來治療炎症和相關疾病以及用於此方法的新的改進的藥劑和化合物。本發明人驚奇地發現了式(I)的化合物及其鹽特別適合用於治療炎症和心血管疾病。此式中R1和R2分別為羥基、烷氧基或醯氧基，R3為羥基、烷氧基、烷基或滷素，和X為二0或氫和羥基。優選式(I)化合物中的Rt和R2代表羥基。優選式(工)化合物中的R3代表甲基、溴、氯或羥基。一優選實施方式中，X=0，本發明的化合物是式(Ia)的異黃垸-4-酮:發明概述complexformulaseeoriginaldocumentpage6此式中R3是5-垸基、6-滷素或8-滷素，更優選R3是5-甲垸基、6-氯或8-溴。另一優選實施方式中，X是氫和羥基，本發明的化合物是式(Ib)的異黃垸-4-醇:complexformulaseeoriginaldocumentpage7此式中R3是8-烷基或8-羥基，更優選，R3是8-甲基、或8-羥基。在還有一優選實施方式中，所述化合物是式(Ic)的8-取代異類黃烷酮化合物及其鹽complexformulaseeoriginaldocumentpage7此式中R1和R2分別是羥基、垸氧基或醯氧基，R3是羥基、烷基或滷素，和X=0或氫和羥基，更優選R1和R2是羥基，和R3是羥基、甲基或溴。尤其優選式(I)異類黃烷酮化合物及其藥學上可接受的鹽選自化合物1到5:complexformulaseeoriginaldocumentpage8本發明的另一個方面提供一種或多種式(I)化合物作為消炎藥劑或心血管藥的應用。所述炎症疾病包括炎症相關疼痛、水腫和紅斑，一般說，炎症疾病包括骨關節炎、炎性腸病(潰瘍性結腸炎和克羅恩症)、潰瘍性直腸炎、末端結腸炎、自身免疫疾病(SLE、類風溼性關節炎、腎小球腎炎)、哮喘以及疾病包括肺炎、心血管疾病包括動脈粥樣硬化、高血壓和脂質疾病以及雌激素受體活化相關疾病。即所述化合物可用於治療炎症相關的疼痛。一優選實施方式中，此種對炎症疾病的治療沒有心血管副作用、而有心臟保護和/或腸保護作用。本發明另一方面提供血栓烷合酶抑制劑在製備治療炎症包括炎症相關疼痛的藥物中的應用。優選所述治療具有心臟保護和/或腸保護作用。本發明另一方面提供一種治療炎症和疾病或作為血栓烷合酶抑制劑的含式(I)化合物的藥物製劑。除非內容另有需要，本說明書及其後的權利要求書中所用的術語"包含"或"含有"應理解為指包括所指定的整數或步驟或一組整數或步驟，但不排除任何其它的整數或步驟或一組整數或步驟。附圖簡述圖1顯示10uM測試化合物對經LPS刺激的人單核細胞合成PGE2的影響。圖2顯示10uM測試化合物對經LPS刺激的人單核細胞合成TXB2的影響。圖3顯示將外來PGH2加入到U937細胞後測試化合物對TXB2合成的影響。圖4顯示TNFa刺激的THP-1單核細胞/巨噬細胞中NFkB啟動子活性受抑制的百分比。圖5顯示口服劑量lmg/kg化合物1和4對結腸炎症的影響(平均值士SEM)。圖6顯示口服劑量lmg/kg化合物1和4對結腸長度的影響(平均值士SEM)。圖7顯示口服劑量lmg/kg的化合物1和4對臨床評分的影響。圖8顯示口服劑量lmg/kg的化合物1和4對體重的影響。圖9顯示預先口服劑量lmg/kg化合物1和2對結腸炎症的影響(平均值土SEM)。圖10顯示預先口服劑量為lmg/kg化合物1和2對結腸長度的影響(平均值士SEM)。圖11顯示預先口服劑量lmg/kg的化合物1和2對臨床評分的影響。圖12顯示預先口服劑量lmg/kg的化合物1和2誘導結腸炎10天對體重的影響。圖13顯示口服劑量L25mg/kg化合物3a和3b對結腸炎症的影響(平均值士SEM)。圖14顯示口服劑量1.25mg/kg化合物3a和3b對結腸長度的影響(平均值土SEM)。圖15顯示口服劑量1.25mg/kg的化合物3a和3b對臨床評分的影響。圖16顯示口服劑量1.25mg/kg的化合物3a和3b對體重的影響。圖17顯示在無有絲分裂刺激物時培養結腸所產生的PG&和TXB2。圖18顯示在存在ConA時培養結腸所產生的PG&和TXB2。圖19顯示去甲基腎上腺素收縮反應受抑制百分比。圖20顯示口服給予11天高劑量化合物1後大鼠的體重變化。圖21顯示每天口服給予5mg/kg化合物2或運載體後的體重變化。圖22顯示每天口服給予20mg/kg化合物3a和3b的混合物後的體重變化(得自各小鼠的數據組，各組平均值以粗體標出)。圖23顯示每天口服給予5mg/kg化合物4或運載體後的體重變化。發明詳述術語"烷基"包括1-6個碳原子的直鏈和支鏈飽和烷基組，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。所述垸基更優選包括含1到4個碳原子的烷基，尤其是甲基、乙基、丙基或異丙基。本發明的化合物包括其所有的鹽，例如酸加成鹽、陰離子鹽和兩性離子鹽，特別包括本領域技術人員已知的藥學上可接受的鹽。術語"藥學上可接受的鹽"指帶電荷能與藥物製劑聯用的有機或無機部分，例如，鹽中的反陽離子或反陰離子。藥學上可接受的陽離子是本領域技術人員已知的，包括但不限於鈉離子、鉀離子、鈣離子、鋅離子和季胺離子。藥學上可接受的陰離子是本領域技術人員已知的，包括但不限於氯離子、醋酸根離子、甲苯磺酸根離子、檸檬酸根離子、碳酸氫根離子和碳酸根離子。藥學上可接受的鹽包括從以下酸形成的鹽乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、檸檬酸、肉桂酸、乙磺酸、延胡索酸、穀氨酸、戊二酸、葡糖酸、鹽酸、氫溴酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、萘甲酸、羥基萘甲酸、萘磺酸、萘二磺酸、萘丙烯酸、油酸、草酸、草醯乙酸、磷酸、丙酮酸、對甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、丙三羧酸、水楊酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸和琥珀酸。術語"藥學上可接受的衍生物"或"藥物前體"指給予受者後能直接或間接提供母體化合物或代謝物的活性，或顯示自身活性的化合物衍生物，包括例如磷酸酯衍生物和磺酸酯衍生物。因此，衍生物包括溶劑化物、藥學上的活性酯、藥物前體等。本發明的優選化合物還包括所有含生理可切斷(cleavable)的離去基團的衍生物，它們可在體內被切斷從而提供本發明化合物或它們的活性部分。離去基團可包括醯基、磷酸酯(基團)、硫酸酯(基團)、磺酸酯(基團)，優選單、二和全醯氧基取代的化合物，其中一個或多個側羥基(pendanthydroxy)用醯基，優選乙醯基保護。本發明的典型醯氧基被取代的化合物易於被切斷成為相應的羥基取代的化合物。本發明還提供一種含式(I)化合物和至少一種藥學上可接受賦形劑的藥物組合物，尤其適用於治療或製備藥劑，例如，用於治療炎性腸病(IBD)如潰瘍性結腸炎(UC)、潰瘍性直腸炎、末端結腸炎和/或克羅恩病(CD)，以及其它肝腸症候群(h印atointestinalsyndromes)包括原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(AIH)和應激性腸道症候群(IBS)。本申請全文中，基本純指例如用HPLC分析方法評估為90。/。純，或更高如95%純，尤其是98%純，特別是99%純。本文描述了本發明的各種方面中，本發明還採用至少兩種式(I)化合物。藥物製劑包括適合於口服、腸胃道外(包括皮下、皮內、肌肉內、靜脈內和關節內)、吸入(包括計量的加壓噴霧、氣霧器或吹入器)、直腸和局部(包括皮膚、頰、舌下和眼內)給藥的那些製劑。最適合的途逕取決於例如接受者的狀況和疾病。可將所述製劑配成單位劑量提供，，可用製藥領域公知的任何方法製備。所有方法均包括將所述活性成分與包含一種或多種輔助成分的運載體相混合的步驟。通常都要將活性成分均勻緊密地與液體運載體或細分固體運載體或兩者混合來而製備所述製劑，然後，如果需要，可將產物製成所需要的製劑形狀。提供的本發明適合於口服給藥的製劑可以是分離的單位，例如包含預先確定量活性成分的膠囊(如明膠膠囊或HPMC膠囊)、扁膠囊或片劑；如粉劑或顆粒劑；如用含水液體或無水液體配的溶液或懸液；或水包油乳液或油包水乳液。活性成分也可以軟膏形式提供。當將式(I)化合物製成膠囊時，優選所述化合物與一種或多種藥學上可接受的運載體如澱粉、乳糖、微晶纖維素、二氧化矽和/或環狀寡糖如環糊精共同配製。輔助成分可包括潤滑劑如硬脂酸鎂和/或硬脂酸鈣。合適的環糊精包括a-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、去甲基-β-環糊精、2-羥基乙基-β-環糊精、2-羥基丙基-環糊精、3-羥基丙基-β-環糊精和三甲基-β-環糊精。更優選所述環糊精為羥基丙基-β-環糊精。可通過壓縮或模塑，任選地與一種或多種輔助成分一同製備片劑。可在合適的機器中加壓自由流動形態的化合物，例如任選與黏合劑、潤滑劑(如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)、惰性稀釋劑或表面活性劑/分散劑混合的粉末或顆粒來製備壓縮片劑。可在合適的機器中模塑用惰性液體稀釋劑潤溼的粉末化合物來製作模塑片劑。所述片劑可任選地(例如)用腸衣包裹，可製成能提供緩釋或控制其中活性成分的劑型。腸道外給藥的製劑包括水和無水無菌注射溶液，可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和賦予製劑與接受者血液等滲的溶質，還可包含懸浮劑和增稠劑。優選腸胃道外製劑包含環狀寡糖例如羥基丙基-3-環糊精。所述製劑可以裝有單劑量或多劑量的容器提供，例如密封的安瓿和小瓶，可以凍幹(冷凍乾燥的)狀態貯存，使用前刻，僅需加入無菌液態運載體例如鹽水或注射用水。可用以上描述的無菌粉末、顆粒和片劑類來製備臨用時的注射溶液和懸液。可將通過吸入向肺局部遞送乾粉組合物，例如裝在明膠膠囊和藥筒中、或例如層狀鋁箔小泡中，採用吸入器或吹入器遞送。通常製劑包含可吸入的本發明的一種或多種化合物的粉末混合物以及合適的粉末基質(運載體)如乳糖或澱粉。優選採用乳糖。通常每個膠囊或藥筒含20ixg-10mg的式(I)化合物，任選與另一治療活性成分混合。或者，本發明的化合物可不加賦形劑。製劑的包裝可用於單劑量或多劑量遞送。可將通過吸入向肺局部遞送噴霧組合物，例如採用適當的液體霧化推進劑配製成用加壓袋如計量霧化劑遞送的水溶液或懸液或氣霧化懸液或溶液。合適的噴霧推進劑包括碳氟化合物或含氫的氯氟烴或其混合物，尤其是氫氟代烷，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷，尤其是1，1，1，2-四氟乙垸、1，1，1，2，3，3，3-七氟正丙烷或它們的混合物。二氧化碳或其它合適的氣體也可用作噴霧推進劑。所述氣霧組合物可不含賦形劑或可任選含有本領域公知的其它賦形劑，例如表面活性劑油酸或卵磷脂和共溶劑如乙醇。通常將加壓製劑存放於有閥門(如金屬閥門)的密封金屬罐(如鋁罐)內與提供管嘴的促動器相配。吸入給藥的藥物宜具有控制的顆粒大小。用於吸入支氣管系統的最佳顆粒大小通常為卜10um，優選2-5um。20um以上的顆粒太大吸入時不能到達小氣道。當賦形劑為乳糖時通常以研碎的乳糖粉提供，其中不超過85%的乳糖顆粒為60-90iiraMMD並且不小於15%的麗D小於15pm。直腸給藥製劑可以是帶有運載體如可可脂或聚乙二醇的栓劑，或為運載體為等滲液如鹽水的灌腸劑。該製劑的附加組分可包括環寡糖，例如上述環糊精，如羥丙基-e-環糊精，一種或多種表面活性劑，緩衝鹽或調節pH的酸或鹼，等滲調節劑和/或抗氧化劑。應理解除了上面特別提到的成分，考慮到討論的製劑的類型，本發明的製劑可包含本領域的其它常規製劑，例如那些適合口服給藥的製劑可包含調味劑。本發明的化合物和藥物製劑可聯用或包含一種或多種其它治療藥物，例如消炎藥、抗膽鹼藥(特別是M,、M2、M,/M2或M3受體拮抗劑)、32-腎上腺素受體拮抗劑、抗感染製劑(如抗生物素、抗病毒等)、或抗組胺劑。優選包含式(I)化合物或藥學上可接受的鹽、溶劑合物或其生理功能衍生物以及皮質類激素、和/或抗膽鹼能藥、禾口/或PDE-4抑制劑。合適的消炎藥包括皮質類激素和NSAID。適合與本發明化合物聯用的合適皮質類激素是具有消炎活性的可口服和吸入皮質類激素及其前藥。例子包括甲基強的松龍、強的松龍、地塞米松、丙酸氟替卡松、6a，9a-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧]-ll13-羥基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-l，4-雙烯-17e-卡比嗎唑酸S-氟甲基酯、6a，9a-二氟-11P-羥基-16a-甲基—3—氧代—17a-丙醯氧-雄甾垸-1，4-雙烯-173-卡比嗎唑酸S-(2-氧代-四氫化呋喃-3S基)酯、倍氯米松酯(如17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼縮松、莫米松酯(如安特醯胺酯)、曲安奈德、羅氟奈德、環索奈德和丙酸布替可特。優選的皮質類激素包括氟替卡松和6d，9ct-二氟-17a-[(2-呋喃基羰基)氧]-113-羥基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-1，4-雙烯-17P-卡比嗎唑酸S-氟甲基酯，更優選6a，9a-二氟-17a-[(2_呋喃基羰基)氧]-11P-羥基-16a-甲基-3-氧代-雄甾垸-1，4-雙烯-17e-卡比嗎唑酸S-氟甲基酯。合適的NSAID包括色甘酸鈉、萘多羅米鈉、磷酸二酯酶(PDE)抑制劑(如茶鹼、PDE4抑制劑或PDE3/PDE4混合抑制劑)、白細胞三烯拮抗劑、白細胞三烯合成抑制劑、iN0S抑制劑、類胰蛋白酶和彈性蛋白酶抑制劑、0-2-整聯蛋白拮抗劑和腺苷受體激動劑或拮抗劑(如腺甘2a激動劑)、細胞因子拮抗劑(如趨化因子拮抗劑)或細胞因子合成抑制劑。活性成分的聯用可以同時或順次給予。同時給藥可以是以同樣單位劑量或單獨和各自的單位劑量同時或在類似時間給予所述化合物。順次給藥可以按所需的順序給予，在需要累積或協同效應時，當給予第二次或後續活性藥物時通常第一次或前一次給予的活性藥物還在發揮生理作用D優選所述製劑為口服製劑，更優選為膠囊製劑。優選所述膠囊製劑必須包含式(工)化合物和二氧化矽或由其組成。優選所述膠囊為HPMC膠囊。在另一實施方式中，所述製劑為栓劑或灌腸劑，可用於將活性成分引導到更接近身體的患病區域。優選本發明的口服組合物或其它含5mg/kg或更少，例如0.01-4mg/kg如0.5-3mg/kg患者體重的式(I)化合物。例如，每單位劑量製劑可含50-500mg式(I)化合物，更優選含200-400mg，如250mg。因此本發明提供一種或多種式(I)化合物和/或含所述化合物的組合物，用於治療或製備藥物。本發明還提供一種治療方法，包括給予需要的患者治療有效量的一種或多種式(I)化合物或含所述化合物的組合物。這些方法對上面列出的疾病特別有效。優選用本發明的化合物和組合物治療IBD，例如結腸炎如潰瘍性結腸炎、潰瘍性直腸炎、末端結腸炎；克羅恩病和/或預防結腸癌。另一優選方面，本發明的化合物和組合物可用於維持所述疾病尤其是IBD的緩解。最後，所述劑量和所述劑量的給藥間隔時間將由患者的主治醫師仔細考慮。式(I)化合物給藥的劑量範圍是例如50-500mg每天1到4次如每天1或2次。含所述式(I)化合物的化合物和組合物具有令人驚奇的低毒性。並且，它們的優點與類似結構的化合物相比，它們的選擇性更好、毒性較低和/或例如減少臨床症狀如體重減輕、胃腸道潰瘍等方面更有效。不希望受理論的束縛，認為本發明的化合物是選擇性血栓烷合酶的抑制劑。血栓烷(TX)在IBD中起主要致病作用。克羅恩病時不僅炎性腸黏膜過量生產TX，而且分離的腸內和外周血單核細胞以及未發炎的腸中也過量產生TX。這些異黃院-4-酮和異黃垸-4-醇及其衍生物用本領域已知的標準方法不難獲得。發表的國際專利申請W098/08503、W000/49009和WOO1/17986(均為NovogenResearchPtyLtd),以及本發明引用的參考文獻(其公開說明書納入本文中作為參考)，也提供了生產作為原材料的單體的異黃酮、異黃烷酮、異黃垸-4-醇和相關的異類黃垸酮的有用的合成方法。一種代表性的通用合成方案見以下方案1所示。complexformulaseeoriginaldocumentpage14方案l通過選擇相應取代的R5-R8苯酚和R2-R4苯酚醋酸原材料在異黃烷-4-醇的苯並吡喃環和懸垂苯環周圍實現了各種模式的取代。常規採用本領域技術人員已知的Rl取代的甲基磺醯氯試劑進行所述環的環化反應。在氫存在時用醇溶劑配製的Pd-C或Pd-鋁成功進行了此還原反應。該反應公式給出了還原反應的終產物。本領域技術人員明白可適當採用其它烷基化、環化、氫化和/或還原的標準方法。對本發明化合物和衍生物上的功能基團的保護可通過本領域公知的方法實現，例如見T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有機合成中的保護性基團)，JohnWiley&Sons,紐約，1981中所述。羥基的保護基團包括但不限於羧酸酯如醋酸酯、芳香酯如苯甲酸酯、乙縮醛/縮酮如丙縮酮化合物和苯亞甲基化合物、醚如正苯甲醯醚和對甲氧苯甲醯基醚、四氫吡喃基醚和矽烷基醚如四丁二甲基矽垸基醚。這種保護基團可通過例如酸或鹼催化的水解或還原去除，例如加氫去除。矽烷基醚可能需要用氟化氫或四丁銨切斷。具體說，式(I)化合物可通過以下方法製備。本發明另一優選的實施方式是8取代的化合物，然而，應理解，通過改變原材料不難獲得不同的其它實施方式。異黃垸酮和異黃垸-4-醇不難通過選擇性還原異黃酮來獲得(見NovogenW000/49009)。還原劑是本領域技術人員所公知的來源，並可包括氫化物如硼氫化物和鹼土金屬硼氫化物，但在催化加氫時可採用合適的催化劑如碳載鈀或氧化鉑來加氫。其它合適的氫化物源包括三乙氟硼氫化鈉和氰基硼氫化鈉。優選來氫化還原雙鍵。優選採用的催化劑為碳載鈀或氧化鉬。間苯二酚是上述方案1的關鍵原材料。取代的間苯二酚不難獲得或可按需要合成。例如，可通過在合適溶劑中用滷化劑處理間苯二酚將間苯二酚甲基化或卣化。合適的滷化劑包括碘、溴、氯或氟。可能必需在還原溫度，例如0'C下進行卣化步驟。也可加工本發明各方面的式(I)化合物和所有中間化合物來製備本文所述的所有化合物。化合物3，4-環氧-4'，7-二羥基異黃烷也顯示具有消炎活性。它是通過(PA)4'，7-二羥基異黃烷-4-醇脫水得到4'，7-二羥基異黃烷-3-烯而獲得。雙鍵的環氧化(,CPBA)提供了環氧化物。本發明人發現通過選擇性或非選擇性抑制血栓垸合酶(TXS)而抑制類花生酸血栓烷(TX)，具有以下多效功能1、消炎活性，表現為典型臨床症狀如疼痛、紅斑和腫脹的緩解，以及2、心腦保護活性，通過緩解高血壓、減輕血脂和/或具有抗動脈粥樣硬化活性或者消除或減輕C0X-2抑制導致的增加心血管風險的血栓前體形成作用。3、腸保護作用，通過對前列腺素產生增加或減少的抑制避免了NSAID的副作用。消炎活性前列腺素如PG&和PGl2和血栓垸(TX)如TXA2是稱為類花生酸的脂肪酸衍生物家族成員(Penglis等2000)。它們參與正常生理反應和炎症反應，但對細胞因子釋放和血小板凝聚等具有相反作用。膜磷脂釋放的花生四烯酸(AA)提供了類花生酸合成的主要底物。不論其同種型，環氧合酶(C0X)的活化可引起PGE2、PGl2和TXA2的共同前體，中間產物前列腺素PGH2的合成。本發明人發現抑制血栓烷本身就是一種消炎策略。1、類前列腺素通過與發炎器官中的白細胞和薄壁細胞發生複雜的相互作用在免疫應答中起著重要的調節作用。取決於炎性刺激、產生的主要類前列腺素、以及類前列腺素受體表達情況，它們能夠產生促炎作用和消炎作用(Tilley等2001)。2、血栓烷TXA2是一種類前列腺素，其作用看來主要是促炎(Thomas等2003)。TX產生的增加涉及各種免疫介導疾病如狼瘡性腎炎的發病。3、根據各種動物模型中的新的和選擇性作用模式，本發明人證明本發明的異類黃垸酮化合物和TXS抑制劑具有顯著的消炎活性。4、血栓烷在炎症性腸病(IBD)中起著重要的致病作用。不僅發炎的腸黏膜，而且克羅恩病的未發炎大腸和分離的小腸內以及外周血單核細胞都過量產生TX。其細胞源可能包括血小板、中性粒細胞、內皮及上皮細胞以及單核細胞(Hawkey等1985;Rampton和Collins1993;McCartney等1999;Carty等2000;Carty等2002)。TX的促炎症作用有直接作用(血細胞滲出和中性粒細胞活化、黏膜潰瘍、抑制T細胞活性的減弱)和間接作用(血管收縮、血小板活化)。認為PG對胃腸黏膜具有保護性(Carty等2000)。經常給藥治療慢性IBD的化合物磺胺水楊嗪，以及其主要代謝產物之一的磺胺吡啶，經證明能分別增強PGF2。或PGE2的合成同時抑制TXB2的合成(Hawkey等1985)。換句話說，它們看來具有某種水平的TX合酶抑制作用。5、TX合酶的抑制可導致TX形成減少，因為PG合酶的底物PGH2利用度增加，引起PG的合成增加(Carty等2000;Penglis等2000)。PGE2的增加能產生消炎作用。例如a.據報導，PGE2能減弱某些急性炎症反應，尤其是由肥大細胞脫顆粒引起的反應(Raud等1988)。b.PGE2抑制，而TXA2提高了TNF。和IL-10的產生(Caughey等1997)。對TXA2的抑制是抑制炎性細胞因子產生尤其是TNF產生的一種潛在方法。目前，抑制TNF水平的生物學療法(抗體或可溶性TNF受體)已成功用於治療難治的或對其它療法不再有反應的類風溼性關節炎。抑制TNF產生的可口服化學藥物已取得很大的進展。抑制TXA2形成即意味著抑制TNF(—種參與關節炎體症和症狀，表現為軟骨降解、關節腔縮小和最終關節功能失調的關節炎症性長期降解階段的細胞因子)的產生。c.PGE2可抑制廣泛的T和B細胞功能包括抑制T淋巴細胞的活化和增殖以及Ig產生(Tilley等2001)。相反，TX&可促進T細胞活化和增殖及促進溶細胞性T效應細胞(CTL)的產生。改變這種平衡幫助PG產生能促使"淬滅"自身免疫疾病中的不良免疫應答。d.哮喘中，PGE2促進血管舒張增加血管通透性(Tilley等2001)。隨著炎症發展，由於C0X-2和PGE合酶的表達增加，巨噬細胞的PGE2合成增強。PGE2抑制淋巴細胞活化並促進支氣管舒張。已開發了TXA2合酶抑制劑和血栓院類前列腺素受體拮抗劑作為抗哮喘藥物(Shi等1998)。e.腎小球腎炎中，PG和TX合成的AAC0X通路以及白細胞三烯合成的脂加氧酶通路同時活化。TXA2是腎小球腎炎中合成最豐富的類花生酸，TXA2合酶抑制劑(如Dazmegrel)目前已用於治療腎小球腎炎。在腎炎大鼠模型中，Dazmegrel能增加PGE2的合成，在腎小球腎炎中可與PGE2—樣用於保護腎臟功能(Lianos和Bresnahan1999)。f.C0X-2衍生的前列腺素與炎症消退相關。炎症損傷產生的PG類型在炎症發展過程中從PGE2佔優勢的促炎作用改變為炎症消退過程中環戊烯酮(cyPG)佔優勢的消炎作用(Gilroy等1999)。心臟保護活性與利用cox抑制的其它消炎藥物不同，抑制血栓垸本身是一種心臟保護策略。1.PG與TX的比率取決於存在的COX同工型(C0X-1或C0X-2)(Caughey等2001)。TXA2是主要的C0X-1衍生產物，但引入C0X-2可導致優先提高PG&和PGL的合成。相反地，當C0X-2受抑制時，TX的合成增加。2.TXA2為血小板凝聚的強效誘導劑。羅非考昔(Vioxx)病例的心血管風險升高是由於對C0X-2的選擇性抑制引起TX合成增加從而導致促血栓形成後果。非選擇性抑制C0X也可引起某些心血管風險，這是因為TX和PG的底物PGH2受COX-1或-2的抑制。3.因此，如果像特異性抑制TXS時發生炎症介質即TXA2受抑制那樣從消炎'等式'中完全除去對COX的抑制，則不會增加心血管風險。4.TXA2也有血管收縮作用，所以對它的抑制可能使這些化合物具有抗高血壓的效果。在心血管功能中血管緊張素II和TXA2之間有聯繫(Dogne等2004)。例如，TXA2和PGH2通過刺激血管平滑肌收縮參與了血管緊張素II依賴的高血壓。而且，一些常用的血管緊張素II抑制劑也是抑制血小板凝聚的血栓烷受體(TP)拮抗劑。胃腸保護活性由於抑制TXS可提高PG酶底物PGH2的利用度，有可能PGE2的增加或如果不增加受抑制的程度至少不會像COX受抑制的程度。由於對PGE2的抑制，採用能抑制C0X的NSAID與胃腸道潰瘍、穿孔和出血相關。雖然，PG包括在介導發炎標誌(疼痛、腫脹和紅斑)的類花生酸列表中，但它們在保護胃黏膜不受其產生的鹽酸傷害上有益(Vane和Botting2003)。這以各種方式發生1.外源給予PG能防止胃黏膜屏障破壞，增強胃黏膜血流並刺激粘液和碳酸氫鹽分泌(Miller1983)。2.在體內，抑制PGE2將減少胃黏膜細胞的增殖(Levi等1990)。因此，可推導PGE2對維持黏膜完整性至關重要。3.內源PG通過溫和刺激在胃部引起的適應性細胞保護中起重要作用(Robert等1979)。用PGE2預處理培養的胃黏膜細胞能減輕乙醇引起的細胞傷害(Sakamoto等1993)。而用非選擇性C0X抑制劑卩引哚美辛預處理胃黏膜細胞增強了乙醇導致的傷害，提示內源PGE2參與了細胞保護。受PGE2活化的受體在藥學上可分成至少4種亞型(EP,、EP2、Eh和EP4)，而體內的適應性胃細胞保護作用由活化的EP,受體介導(Takeuchi等2001)。4.PGE2的保護性作用還包括調節胃黏膜的微循環。認為血管舒張劑如PGEz與血管收縮介質如內皮衍生肽內皮素-l(ET-l)局部釋放之間的平衡的破壞涉及到黏膜受損的病理機制(Whittle和Lopez-Belmonte1993)。PGE2能減少輻射誘導的小鼠小腸細胞凋亡，內源PGE2能增加小輻射後上皮隱窩的存活率(Cohn等1997)。該效應由通過EP2、AKT磷酸化和6s義易位抑制的信號傳遞通路所介導(Tessner等2004)。同樣令人驚奇的是，認為本發明的化合物是化療增敏劑，即它們能增加共同給予的一種或多種抗癌藥物的細胞毒性，和/或輻射增敏劑，意味著這些化合物可降低殺死癌細胞所需的Y射線量，或可使癌細胞從輻射抗性轉變為輻射敏感狀態。此外，本發明的化合物可用於治療和預防許多重要的人類疾病，包括癌症、炎症、自身免疫疾病、心血管疾病和與雌激素受體活化相關的疾病。本發明通過一下非限制性實施例及附圖作進一步闡述。實施例取代的異黃烷酮和異黃垸-4-醇的合成方法2－溴代間苯二酚與4－羥苯乙酸得縮合－合成1－(3－溴代－2，4－二羥苯基)－2－(4－羥苯基)-乙酮complexformulaseeoriginaldocumentpage19在配有冷凝器和磁力攪拌器圓底燒瓶內的2-溴代間苯二酚(5.0g，26毫摩爾)和4-羥苯乙酸(3.0g，26毫摩爾)的混合物中加入三氟化硼二乙基醚合物(30ml)。所述混合物攪拌加熱至100-11(TC1.5個小時。然後將混合物冷卻到室溫放入冰箱過夜。過濾得到沉澱的固體進行用乙醇重結晶獲得米色晶體狀的脫氧苯偶姻。然後收集晶體在乾燥器中千燥。lHNMR(CDC!3):S4.16(s，2H,CH2),6.61(d,1H,J9.0ArH),6.80(d,2H,J8.6Hz，ArH)，7.12(d,1H,J8.6Hz,ArH)，7.75(d,1H,J9,0Hz,ArH).產率5.2g，69%環化1-(3-溴代-2，4-二羥苯基)-2-(4-羥苯基)-乙酮-合成3-(4-羥苯基)-7-羥基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮complexformulaseeoriginaldocumentpage19在50。C保溫的1-(3-溴代-2,4-二羥苯基)-2-(4-羥苯基)-乙酮(2.5g)的無水二甲基甲醯胺(20ml)溶液中滴加三氟化硼二乙基醚合物(6ral)。然後在該溶液中加入甲硫醯氯(3.3ml)並加熱混合物至ll(TCl個小時。冷卻至室溫後，在反應混合物中緩慢加入鹽酸(2M,120ml)。過濾、用水徹底洗滌並乾燥得到黃色沉澱。〗HNMR(d6-DMSO):S6,79(d，2H，J8,7Hz,ArH),7.08(d,1H,J8.7Hz，H6),7.36(d,2H，JS.7Ife,A鄰，7.94(d，1H，J8.7Hz,H5),8.39(s,1H，H2).產率2.35g粗產物無需進一步純化即可用於下一步驟。乙醯化3-(4-羥苯基)-7-羥基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮-合成3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮complexformulaseeoriginaldocumentpage20往配有冷凝器和磁力攪拌器的圓底燒瓶內的3-(4-羥苯基)-7-羥基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮(2.35g)中添加乙酸酐(15ml)和吡啶(2.5ral)。加熱所述混合物至ll(TCl個小時。然後冷卻置於冷藏箱內結晶。過濾得到白色晶狀固體用水洗滌。粗產物用乙醇重結晶得到白色針狀晶狀的3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮。'HNMR(CDCl3):52.32,2.42(各s,3H，OCOCH3,7.17-7.22(m，3H,ArH),7.58(d，2H,J8.7Hz，ArH)，8.1(s,1H，H2),8.29(d，1H,J9.0Hz,H5).產率1.5g氫化3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮-合成3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-4-羥基-8-修帶-苯並二氫吡喃-4-酮和3(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-4-羥基-8-修帶-苯並二氫吡喃-4-醇complexformulaseeoriginaldocumentpage20將裝有3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並吡喃-4-酮(0.3g)的乙酸乙酯(80ml)懸液的250ml圓底燒瓶抽除空氣後充入氬氣以提供惰性氣體環境。在該混合物中快速加入氧化鉑(67mg)輕柔攪拌所述混合物以保證催化劑完全被乙酸乙酯包裹。在室溫下標準條件下氫化所述混合物3天。用次乙醯塑料墊(padofCelite)過濾溶液除去催化劑抽真空蒸發所述溶液得到無色油。所述油的tic分析表明它是苯並二氫吡喃-4-酮和苯並二氫吡喃-4-醇的混合物。所述粗產物在矽膠柱上進行層析，採用二氯甲酸/乙酸乙酯(98:2)作為洗脫液。3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-4-羥基-8-溴代-苯並二氫吡喃-4-醇產量lOOmgiHNMR(CDCl3):□2.30，2.35(各s，3H，OCOCH3),3.32(dt,1H，J3.4Hz,J11.7Hz,H3),4.48(m，1H,H2);4.65(dd，1H，J10.5Hz,11.7Hz,H2)，4.78(bs,1H,H4),6.75(d，1H,J8.3Hz,H6),7.10(d,2H,J8.3Hz，ArH),7.25(d,1H,J8.3Hz，H5)，7,30(d,2H,J8.3Hz,A鄰.3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並二氫吡喃-4-酮產量170ragNMR(CDCl3):2.29，2.38(各s，3H,OCOCH3),4.02(dd,1H，J5.7和8.7Hz，H3),4.60(m,2H,H2),6.88(d，1H，J8.6Hz，H6),7.09(d，2H，J8.7Hz,ArH)，7.29(d,2H,J8.7Hz,H2),7.96(d，1H,J8.6Hz，H5).3-(4-羥苯基)-7-羥基-8-溴代-苯並二氫吡喃-4-酮complexformulaseeoriginaldocumentpage21往3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-8-溴代-苯並二氫吡喃-4-酮(0.17)的無水乙醇(7.0ml)的懸液中添加咪唑(0.50g)，在氬氣中回流所述混合物1小時。減壓濃縮所述溶液並往殘液中添加蒸餾水(5ml)和鹽酸(lM，5ml)。所述混合物在冷藏器中留置過夜，過濾、用水徹底洗滌並在真空乾燥器中乾燥得到的霜狀白色固體。產量130mg'H"NMR(d6陽丙酮)□3.93(t1H,J6.8Hz,H3),4.60(d,2H,J7.2Hz，H2),6.75-6,81(m，3H，ArH),7.13(d，2H,J8.7Hz，ArH)，7.72(d,1H,J8.6Hz,H5)，8.44(bs，1H,OH),10.2(bs,1H，OH).對乙醯氧基異黃烷-4-酮進行類似的脫保護產生相應的羥基化合物。通過改變原材料間苯二酚的取代模式，合成本發明的其它化合物。所有合成化合物均顯示與給定結構一致的光譜數據。化合物2的合成以4-羥苯乙酸與連苯三酚的縮合開始。進行上述反應得到化合物2。化合物3、4和5分別以2-甲基間苯二酚、4-氯代間苯二酚和5-甲基間苯二酚開始。消炎活性抑制人單核細胞誘生的類花生酸分離全血離心產生的棕黃層中單核細胞，方法是用淋巴細胞分離梯度液分離人外周血單核細胞，然後用反流離心淘洗(來自三個不同個體)(Demasi等2000)。將測試化合物溶於DMSO後加入到新鮮單核細胞中至0、10和100uM濃度。30分鐘後，加入脂多糖(LPS)至終濃度200ng/mL。在5%C02中37°〇培育18個小時後，除去上清液用放射免疫試驗(RIA)測定PGE2和TXB2(TXA2的穩定水解產物)產物。除化合物4隻檢測過一次外，每種化合物用三種不同的試驗檢測。用AN0VA然後用Newraan-Keuls比較檢驗來檢測劑量和對照值之間的差異。用0.05表示與對照值的差異具有統計學顯著水平(用星號(*)標示)。濃度為10uM時所得結果見圖1(PGE2)和圖2(TXB2)。由於測試化合物以劑量反應方式誘生PGE2或者對PGE2的作用很小，而通常抑制TXB2，因此這些結果可提示所述測試化合物是血栓烷(TX)合酶的抑制劑。為了直接檢測測試化合物對TX合酶(TXS)的作用，可採用不同的試驗系統。花生四烯酸(AA)是COX的底物，PG&是TX合酶的底物。為了直接檢測這些化合物對TXS的作用，將外源性PGH2添加到試驗系統中。Ecosatioid合成如下所示complexformulaseeoriginaldocumentpage22將0uM、1uM、10yM和100iiM(DMSO中)的測試化合物與未分化的U937細胞(6X106/ml)37。C培育30分鐘，然後加入PGH2(5uM)。培育10分鐘後，離心終止反應收集上清液用RIA—次三份測定產生的TXB2。用ANOVA然後用Newman-Keuls多重比較檢驗來檢測劑量與對照值之間的差異。用0.05表示與對照值的差異具有統計學顯著水平(用星號(*)標示)。結果如圖3所示。由於在初步試驗中這些化合物中沒有一種能抑制PGE2，可以認為這些試驗中顯示的抑制作用對TXS具有特異性。這些結果表明化合物1、2、4和5是選擇性血栓垸合酶的抑制劑，而化合物3顯示的對血栓垸合酶的活性特異性較差。抑制NFkB核因子kB(NFkB)是一種可調節重要的調控炎症和各種自身免疫疾病以及細胞凋亡、病毒複製和腫瘤生成的大量基因(包括COX-2)的表達的核轉錄因子。NFkB可因各種剌激包括生長因子、細胞因子、淋巴細胞、UV射線、藥物刺激和應激而活化。其測試化合物能抑制NFkB，提示所述化合物在體內具有消炎活性。將經過修飾的包含e內醯胺酶報導基因的人巨噬THP-1細胞接種入存在RPMI1640培養液(70u1)的96孔板孔(50乂103細胞/孔)。往各孔添加TNFa(7.5ng/ml)和人血清(終濃度為20%)。37匸培育板5小時讓NFKB刺激P內醯胺酶產生。然後添加LiveBLAzerTMFRETB/G底物(CCF4-AM)檢測P內醯胺酶的活性。一旦CCFA-AM進入細胞，被內源性酯酶轉變為帶負電荷的CCF4。所述底物受409nm光激發在香豆素和螢光素部分之間產生有效的FRET，導致產生530nm的可檢測綠色螢光。P內醯胺酶的存在引起CCF4斷裂並導致FRET喪失，產生460nm可檢測的藍色強螢光信號。因此，測到的e內醯胺酶(NFKB啟動子活性的標記)活性為產物與底物的比率(藍色/綠色螢光比率460nra/530nm)。如圖4所示，與運載體對照相比，化合物2、3和5顯著地(p〈0.001)抑制了NFkB。抑制一氧化氮一氧化氮(NO)在各種炎症中起著重要的調節/調控作用(Blantz和Munger2002)。大量的NO通過在浸潤淋巴細胞和活化的常駐組織細胞中均存在的誘導一氧化氮合成酶(iNOS)的作用在炎症部位產生(Evans1995)。它可以是血管舒張性的並幹擾黏附分子而防止嗜中性粒細胞粘附。NO釋放也可引起形成高活性物質如過氧化亞硝酸鹽和穩定的亞硝基硫醇，並可導致線粒體損傷和蛋白質酪氨酸殘基的硝化。在各種炎症和自身免疫疾病包括系統性紅斑狼瘡(SLE)、斯耶格倫(Sj5gren)症候群(SS)、血管炎、類風溼性關節炎和骨關節炎病程中會產生過量的NO(Clancy等1998)。因此認為對它的抑制是一種消炎策略。各種細胞接觸細菌LPS和促炎細胞因子時會誘生iNOS進而產生NO。可通過測量一種N0的穩定分解產物亞硝酸鹽(N02-)來直接定量N0產物。在添加有FCS、2mM穀氨醯胺和50U/ml盤尼西林/鏈黴素的DMEM中培養小鼠巨噬細胞系RAW264.7。用10uM(於0.125。/。DMS0中)測試化合物或單用空運載體與10ng/ralLPS—起處理細胞。培育24小時後，收集培養液立即用Griess反應分析NO濃度(Eigler等1995)。10uM化合物1、3a和3b抑制了N0合成而化合物2和4卻誘導其合成。化合物5未檢測。表1.測試化合物對NO合成的影響complextabelseeoriginaldocumentpage20這些結果表明這些化合物消炎的另一種機理。對鼠耳炎症的消炎活性檢驗化合物能否抑制周部施塗花生四烯酸(AA)所引起的小鼠耳腫脹。AA即類花生酸的直接前體可通過環氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)通路形成AA代謝產物誘導炎症反應(Young等1984)。AA誘導PGE2和LTC4合成增加繼而導致耳厚度增加(Opas等1985;Chang等1986)。將AA塗於耳部之前30分鐘或恰好在這之前，將劑量25rag/kg用聚乙二醇(PEG)400:鹽酸緩衝生理鹽水(PBS)1:1配的化合物2經腹膜內(i/p)注射重15-21g的雌性BALB/c小鼠(ARC、WA、澳大利亞)中。用異氟垸麻醉小鼠並用彈簧微米計測量雙耳的基線厚度。給每隻小鼠每一耳廓的內和外表面施塗總量為20"L的AA乙醇(50mg/nil)溶液(g卩，每隻耳朵0.5mgAA)。施塗AA後1小時再次麻醉小鼠測量耳厚度。計算每隻耳朵施塗AA前後耳朵腫脹的差異，計算每隻小鼠雙耳平均值。用雙尾不配對t檢驗(Prism4,GraphPad軟體)計算各實驗組與單用空運載體的組相比的平均腫脹的差異。所有化合物均減輕了AA誘導的耳炎。用化合物2、3a和3b處理的耳厚度顯著小於單用運載體處理組。表2.對施塗AA反應的耳厚度變化_化合物耳厚度的增加(平均值土SD，xO.Olmm)試驗組和運載體之間的差^運載體14.5±4.7化合物19.5±2.3p=3221化合物26.5±2.9p=0.0440化合物3a6.7士2.1p=O.0362化合物3b7.1±3.0p=O.0268化合物49.2±3.6p=0.3381這些數據證明測試化合物在體內具有消炎活性。在UV射線誘導的皮膚水腫小鼠模型中的抗消炎活性將哺乳動物皮膚急性暴露於UV射線引起紅斑和水腫的炎症反應。該反應部分受促炎前列腺素(PGD2、PGE2、PGF2a和可能的PGl2)和白細胞三烯、以其產生的反應性自由基和反應性氧所介導(Sondergaard等1985;Go腿lez和Pathak1996;Widyarini等2001)。用1x3MEdD(最小致水腫劑量)的模擬日光UV射線(SSUV)照射各組4-5隻雌性Skh:hr-l白化病小鼠。模擬日光紫外線照射(SSUV)由一平排6個UVA管(Hitachi40WF40T10/BL,黑色)和1個UVB管(PhilipsTL40W/12RS)提供，射線濾過0.125mm乙酸纖維素片層(EastmanChemical產品，Kingport，田納西州，美國)發出2.96xl(TW/cn^UVA和1.59xlO-5W/cra2UVB。照射過程中，將鼠籠在光線下轉動以減輕不同位置處射線密度不同帶來的差異。照射後30分鐘、2小時和4小時將測試化合物(0.2ml的20yM溶液)或運載體(丙二醇/乙醇/水l:2:l)施塗到經照射的背側皮膚。在暴露UV之前和之後24小時和48小時用彈簧微米計測量背側皮膚褶皺。計算每隻小鼠暴露UVR前後皮膚厚度的差異，用不配對雙尾t檢驗來檢測試驗化合物和運載體對照之間的差異。皮膚褶皺厚度在UV照射後24小時出現而在最後測量時間點48小時時最明顯。即使UV照射後僅施用3次試驗化合物，且在首次測量到皮膚褶皺之前20小時劑量已用完，大多數的化合物仍然具有減輕UV誘導的炎症的活性，如下表和下圖中所示。局部施用所有化合物證實了其減輕UV誘導的炎症的趨勢。化合物3a在兩個時間點均顯著抑制皮膚水腫。化合物1和2在第48小時顯著抑制。表3.照射24小時後背側皮膚褶皺厚度的變化_化合物皮膚厚度的增加(平均值士SD，x0.01mm)試驗組和運載體之間的M^運載體78±231化合物154±20;^0.0579化合物268±24f0.4275化合物3a32±18;^0.0023化合物3b56±14屍O.0671化合物463±22f0.2407表4.照射48小時後背側皮膚褶皺厚度的變化_化合物~~皮膚厚度的增加(平均值士SD，x0.Olmm)試驗組和運載體之間的差異運載體化合物1化合物2化合物3a化合物3b147±37-91±7.60041105±22p=0.029969±24/=0.0011113±25f0.0746化合物4145±11p=O.9055這些結果清楚地證明了化合物1、2和3a的消炎活性。即使是在炎症發生後短時間內局部施用，它們的效果在48小時以後仍然明顯。在大鼠氣囊試驗中的消炎活性可用來測定消炎效果的另一種試驗為氣囊模型，其包括反覆皮下注射空氣到大鼠背部，24小時之後，往氣囊內注射炎性刺激物(Gilroy等1998)。氣囊隆起於約7周大的雌性DarkAgouti大鼠的背部。在初次注射空氣後第2和第5天通過再次充氣維持氣囊以促進每一氣囊內側形成內層細胞膜襯層。進行再次充氣時，將2mL無菌空氣充入氣囊前，先對氣囊抽氣以保證針頭的位置正確。採用這種方法，使氣囊維持充氣狀態直到要用的第7天時被注射入0.5ml100"M試驗化合物或運載體對照。15分鐘後，往氣囊內注射血清處理過的酵母聚糖(STZ-500iig)。4小時時灌洗氣囊(4x2ml灌洗)並進行白細胞計數，之後將大鼠處死，切下氣囊置於福馬林中作組織學研究。計數人員對該切片情況完全無知。採用100格量板和40x物鏡，對氣囊內襯層10個不同的非毗鄰位置的多形性細胞進行計數。每組5-6隻大鼠。採用不配對t檢驗分析各實驗數據有無統計學顯著性。總體上，對炎性細胞滲出程度的兩次不同測定(灌洗液中的白細胞數目和組織切片中的多形性細胞)相一致。對測試化合物的效果的兩次測定結果也相一致，其加強了各數據組的有效性。大多數測試化合物顯示具有消炎活性。lmM用量時，所有化合物(除了化合物1和3a夕卜)顯著抑制了灌洗液中的白細胞數。化合物2、3a和4抑制了組織切片中多形性細胞數。表5.將測試化合物滴入發炎大鼠氣囊中的效果灌洗液中的白細胞組織切片中的多形性細胞(xl(T)(每100格)化合物l運載體0.89±0.4231.0±7.250.87±0.2831.1±10.9f0.9181/=0.9921化合物2運載體a0.68±0.3614.3±5.71.41±0.2528.9±6.6/=0.002b風002化合物3a運載體0.47±0.417.9±14,21.72±1.327.0±17.9f0.1124風2196化合物3b0.66±0.23complextableseeoriginaldocumentpage27a對照是DMS0/PBS，測試化合物的運載體。DMS0/PBS的比為1:100。b不配對t檢驗；2尾(除非另有說明)這些結果清楚地證明化合物2、3a、3b和4具有體內消炎活性。在DSS-誘導結腸炎小鼠小鼠模型中的消炎活性方法在實驗工作開始之前，飼養6-7周齡的雌性BALB/c小鼠至少1周。每天通過飲用水新鮮給予濃度為4.5-5。/。的硫酸葡聚糖鈉(DSS-分子量為40kD，TdBConsultancyAB，Uppsala，瑞典(Dieleman等1994))5天以誘導結腸炎(0kayasu等1990)，此後，僅給予清水。該方法誘導輕度結腸炎，症狀為腹瀉和直腸出血(對其嚴重程度評分)以及結腸長度縮短。組織學上，結腸炎表現為潰瘍和中性粒細胞滲入黏膜，也對此評分。結腸炎的全身性影響引起體重減輕，也對其進行監測。結果一系列實驗中，口服給予化合物l、化合物2、化合物3a、化合物3b或化合物4減輕了結腸炎症。重要的是，這些化合物具有活性的劑量較低-每天一次口服劑量為1.0-1.25mg/kg。實驗1在整個實驗中，給予lmg/kg劑量的運載體(PEG400:PBS1:1)、化合物1或4直到第17天處死小鼠。兩種化合物均減輕了結腸炎。此試驗中，化合物l的消炎活性比化合物2更佳(結腸漬瘍減輕、臨床症狀出現延遲、臨床評分降低、臨床症狀的發生和嚴重性減輕、體重減輕減少和恢復時間減少)。平均組織學評分如圖5所示，表明用化合物1和4治療的小鼠結腸炎較輕。給予化合物1的小鼠比只給予運載體的小鼠結腸上皮潰瘍的減輕具有統計學顯著性0^=0.0135)。由攝食DSS誘導的結腸炎可引起結腸縮短，測試藥物給予的此種保護作用得到結腸縮短減少的證明。給予化合物1(p=0.1922)或化合物2(p=0.0542)的小鼠結腸傾向於比只給予運載體的小鼠更長。見圖6。被給予運載體組中的多個小鼠第5天出現臨床症狀，但被給予化合物1和4的組直到第6天仍無症狀，提示那些化合物能延遲結腸炎的發生。到第11天，給予化合物1或4的組平均臨床評分顯著(f0.017和；7=0.043)低於只給予運載體的組。這些結果提示化合物1和化合物2均具有消炎性。見圖7。化合物4的最大平均體重減輕僅為1%，化合物1為％，而只給予運載體的組為5%。特定組的平均體重減輕轉變為平均體重增加，部分提示了該組發生了結腸炎消退。這在給予化合物1的組中發生於第10天，化合物4發生於第12天，而運載體直到第15天仍未發生。見圖8。實驗2在飲水中加入DSS誘導結腸炎之前連續10天給予劑量lmg/kg的化合物1和2或運載體，之後停用測試化合物。給予DSS5天並在8天後(第23天)處死小鼠。即使只在誘導之前而非誘導期間服用了兩種化合物，仍能減輕炎症。見圖9。黏膜潰瘍的量和嚴重性比運載體治療組要好，但並不顯著。同時有一種趨勢，就是結腸長度在試驗組和運載體組之間不存在顯著差異。結腸長度在未被給予DSS的小鼠和運載體組之間具有顯著差異G^0.0414)。然而，化合物1治療組的結腸與對照組的結腸在長度上不具有顯著差異提示化合物1僅在一定程度上保護不受攝食DSS帶來的炎症的影響。見圖10。在運載體處理的組中有一隻小鼠在第18天死亡，而治療組均未有小鼠死亡。儘管當與運載體治療組比較時沒有統計學顯著性差異，但有可靠證據表明該兩組治療組減輕結腸炎的臨床表徵。見圖ll。施用化合物2和化合物l(效力程度較輕)減少DSS誘導的結腸炎相關的體重減輕。第22天，接受化合物2的小鼠比接受運載體的那些顯著更重G^0.0291)。見圖12。實驗3在整個實驗過程中服用1.25mg/kg化合物3的順式或反式異構體(分別為化合物3a和化合物3b)或運載體，直到第17天小鼠被殺死。根據臨床指標、結腸長度和組織學變化判斷給予化合物3a以及給予化合物3b(效力程度較輕)能夠減輕結腸炎症並促進其消退。在給予化合物3a的組中未見後部結腸潰瘍，而在給予化合物3b的小鼠中僅見到1/8。然而，在給予空運載體的小鼠中減到3/8的潰瘍。給予化合物3a的小鼠的黏膜損傷程度顯著(f0.018)低於運載體治療組。見圖13。給予化合物3a的組的小鼠結腸顯著(屍0.039)長於給予空運載體的組的結腸。28見圖14。接受化合物3a的組的平均評分在第8天(f0.0078)、第9天(/=0.0326)、第10天(/=0.0386)和第11天(巧O.0252)始終顯著低於運載體組的評分。然而，當運載體處理小鼠中的結腸炎開始消退時，差異較不明顯，並且不存在統計學上的顯著。然而，在本試驗最後幾天，接受化合物3a的組的平均臨床分數在第15天0=0.0033)和第16天(/7=0.0016)再次顯著較低。這提示化合物3a發揮了消炎作用並促進炎症的消退。同樣，接受化合物3b的組的平均分數在第8天(p=0.0055)、第9天(f0.0057)和第11天(/K).0252)顯著低於運載體組。接受化合物3b的組的平均臨床分數在第17天(pi.0177)再次顯著較低。這提示口服給予化合物3b也具有消炎效果並促進炎症的消退。見圖15。儘管趨勢很明顯，化合物3的異構體組和給予運載體組之間的體重變化不具有統計學上顯著的差異。給予化合物3a的組的最大平均體重減輕小於29&，而給予空運載體組為接近5%。化合物3a相對運載體組較快但並不顯著地在第4天發生從平均體重減輕到平均體重增加的變動。見圖16。試驗4整個試驗中，每天給予小鼠組(/7=5)—次lmg/kg化合物1或運載體，並在第6天、第9天或第13天將其殺死。取出結腸，縱向切開並用含有兩性黴素B(2.5ug/ml，Invitrogen)的青/鏈黴素(100U/ml/100Ug/ml,Invitrogen)的PBS洗滌。然後將它們切成小塊，並將約lOOmg的結腸放入存在或不存在含有ConA(10ug/ml，Sigma)的lml改良RPMIc(青/鏈黴素和兩性黴素B)的的24孔板的一個孔中18-24小時。收集上清液，離心後於-8(TC保存。用ELISA(CaymanChemical)—式三份測定培養物上清液中的PGE2和TXB2。通過在不存在促有絲分裂刺激物下培養結腸，評估目前產生的炎性介質。接觸DSS的小鼠發炎結腸比健康不發炎結腸傾向於產生更多的炎性介質(Dieleman等1998;Tomoyose等1998;Morteau等2000;Micallef等2002)。在此實驗中攝食DSS小鼠的結腸比無結腸炎健康小鼠的結腸在第9天(/X0.05)產生了顯著更多的PGE2，第6天0X0.05)更多的TXB2。在整個實驗過程中，尤其在早期，給予DSS小鼠的結腸傾向於產生更多的PG&和TXB2。通過比較給予DSS並用化合物1治療的小鼠與給予DSS並只用運載體治療的小鼠，評估化合物1對減輕這些炎症反應的作用。化合物治療小鼠的結腸傾向於在第9天和第13天產生較少的PGE2，而在第6天和第9天產生較少的TXB2(p＜0.05)-見圖17。在存在促有絲分裂原的條件下培養結腸以評估能否對炎性/促有絲分裂剌激物反應。當攝食DSS時，結腸在第9天(p＜0.05)和第6天對ConA反應中比無結腸炎健康小鼠的結腸產生了顯著更多的PGE2。在整個實驗中，尤其在早期，給予DSS的小鼠的受刺激的結腸傾向於產生更多PGE2和TXB2。到第13天，健康和發炎的結腸之間已無差異，提示DSS引起的急性炎症開始消退。用化合物l治療傾向於減輕(儘管不顯著)這些反應。見圖18。這些結果證明了結腸炎動物模型口服化合物1的消炎作用可能是由於它的作用減弱了炎性結腸合成類花生酸。心腦保護活性大鼠主動脈環試驗的血管舒張活性利用大鼠主動脈環離體試驗檢測測試化合物的血管舒張能力。在試驗槽中加入去甲腎上腺素引起主動脈環收縮，如果血管收縮受測試藥物的抑制，該藥物能拮抗去甲腎上腺素的作用，提示則表明該藥物具有血管舒張抗高血壓活性。方法用80%C02和20%02將雄性Sprague-Dawley大鼠(250士50g)安樂死。取出胸主動脈並迅速固定在器官槽(Chin-Dusting等2001)中。獲得有和沒有1μg/ml遞送的測試化合物時對去甲腎上腺素(O.lnM-10mM)反應產生的整個濃度-收縮反應曲線。用5隻不同動物的n=5個動脈環重複此實驗。任何一種測試濃度時只有一種化合物對每隻動物的動脈環具有影響。擬合與數據匹配的乙狀結腸劑量反應曲線並計算出logEC50(Prism4,GraphPad軟體)。用雙尾配對t檢驗計算存在與不存在測試化合物時這些值之間的差異。檢測β-雌二醇和單用運載體的作用分別作為陽性和陰性對照。結果本實驗檢測了化合物l、2、4、5和化合物3的異構體混合物。化合物1和3比只用運載體顯著抑制了主動脈環對去甲腎上腺素的收縮性反應(logEC50)這些數據表明這些化合物除具有消炎活性外，還具有心血管活性。見圖19。無胃腸毒性化合物l每天口服化合物l，ll天以研究其毒性。4隻SpragueDawley大鼠(每種性別2隻)口服化合物1的CMC0.1%溶液，高劑量300mg/kg和限制劑量誦mg/kg。第三組服用運載體。見圖20。化合物1的CMC0.1%製劑在4'C、25。C和4(TC可穩定經過7天時間。第7天後提供新鮮批次的化合物l。測量給藥前刻，然後第8天和挑選的第12天時的體重。整個實驗過程中，每天觀察所有大鼠有無中毒跡象。屍體解剖時，肉眼檢查屍體的外表面，檢查所有孔洞和胸腹腔及其內容物。稱量肝臟、腎臟、腎上腺、脾和生殖腺重量。檢測終末血液學(Terminalhaematology)、血清生物化學和肝、脾和骨髓的組織學。沒有發現任何毒性證據，具體是胃腸紊亂、體重減輕、凝血紊亂、貧血或提示胃腸出血的其它血惡液質。化合物2將5mg/kg(/f3)的化合物2或運載體(PEG400:PBS1:1;/=2)通過管飼連續10天給予雌性BALB/c小鼠。沒有一組出現不良臨床症狀，體重變化相似。屍體解剖未發現肉眼可見的病理變化。盲腸和結腸的組織學分析均正常。見圖21。化合物3將化合物3a和3b用PEG400:PBS1:1配稱非對映異構體混合物通過管飼以每天20mg/kg給予7周齡雌性BALB/c小鼠(/7=8)10天。無用於比較的運載體對照組。然而，此組所有小鼠均維持體重10天後平均比原體重增長5%，這在該年齡小鼠中屬於正常。見圖22。化合物4將5mg/kg(^3)的化合物4或運載體("=2;PEG:PBS1:1)通過管飼連續10天給予雌性BALB/c小鼠。沒有一組出現不良臨床症狀，體重變化相似。屍體解剖未發現肉眼可見的病理變化。盲腸和結腸的組織學分析均正常。這些數據確證了這些化合物不會引起胃腸毒性，證據是長時間和常以極高劑量接受這些化合物的那些動物的體重增加正常、無臨床症狀以及無組織病理學改變。本說明書中使用的詞語包含的含義，應理解為本發明也可擴展至由所述要素或整數的組合或由其基本組成。本說明書中對任何現有技術的參考並非，或不應該認為是承認或以任何方式暗示該現有技術形成本領域公知技術的一部分。本領域技術人員知道，可對本文描述的本發明具體所述的那些進行其它的改變和修飾。但應該理解，本發明包括所有這類改變和修飾。本發明也包括所有本說明書中以個別或集合方式提到的步驟、特徵、組合物和化合物，以及所述這些步驟或特徵的任何以及全部組合。參考文獻Carty,E.等.(2000)."Ridogrel,adualthromboxanesynthaseinhibitorandreceptorantagonist:anti隱inflammatoryprofileininflammatoryboweldisease(禾!j多瑞爾,雙重血栓烷合酶抑制劑和受體拮抗劑:在炎性腸病中的消炎屬性)".AlimentaryPharmacology&Therapeutics14(6):807-17.Carty，E.等.(2002)."Thromboxanesynthaseimmunohistochemistryininflammatoryboweldisease(炎性腸病中的血栓垸合酶的免疫組織化學)".JournalofClinicalPathology55(5):367-370.Caughey,G.E.等.(2001)."Rolesofcyclooxygenase(COX)-landCOX-2inprostanoidproductionbyhumanendothelialcells:selectiveup-regulationofprostacyclinsynthesisbyCOX-2(環加氧酶(COX)-l和COX-2對人內皮細胞產生前列腺素類產物的作用:通過COX-2選擇性上調前列環素的合成)".Journaloflmmunology167(5):2831-8.Cohn,S.M.等.(1997)."Cryptstemcellsurvivalinthemouseintestinalepitheliumisregulatedbyprostaglandinssynthesizedthroughcyclooxygenase-l(小鼠腸上皮中存活的隱窩幹細胞受環加氧酶-1合成的前列腺素的調節)".JournalofClinicalInvestigation.99(6):1367-79.Dogne,J.M等.(2004)."Newdevelopmentsonthromboxaneandprostacycl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