利用超聲波處理液體介質以防止過度增殖或感染細胞生長的設備與方法

2023-05-09 23:22:01

專利名稱：利用超聲波處理液體介質以防止過度增殖或感染細胞生長的設備與方法
技術領域：
本發明涉及利用高頻、低能超聲波來處理液體介質。在具體實施方案中，本發明的設備和方法能夠顯著誘導懸浮在生理液體中的細胞凋亡。
背景技術：
細胞在暴露於超聲波中可引起損傷。例如，超聲波能夠引起不可逆的細胞損傷和誘導破壞性的細胞膜的改變。某些報導提出，由產生自聲壓場(acoustic pressure fields)的氣泡崩解引起的空穴作用可能是超聲波輻射作用後引起細胞損傷的原因。同時還提出，通過殘留的過氧化氫作用造成的空穴作用可誘導DNA單鏈的斷裂。
超聲波在癌症治療中的應用已經成為一個重要的方面。超聲波通常與高溫、以及光、放射和化療聯合使用。已知惡性細胞比其對應的正常細胞對這些聯合治療更加敏感。對某些分子(例如，經典的光敏劑和聲敏劑)的直接輻射作用(例如，超聲波、雷射、光照)產生諸如單線態氧、超氧自由基、過氧化氫和脂肪酸自由基的高活性氧類，其能夠選擇地作用於惡性細胞從而在癌症治療中發揮重要作用。
根據放射的來源，上述治療稱為PDT(光能治療)，或者如果通過超聲波或聲致發光則稱為SDT(聲能治療)。這兩種治療都預先需要光敏劑的加入。儘管在細胞生存能力方面通過SDT和PDT產生的總的作用不同，但SDT(特別是涉及超聲波空穴作用活性)和PDT均產生活性氧化類物質並導致細胞內硫醇水平的降低。在使用紫外線-A(UVA)的PDT時，單線態氧的產生能夠誘導T輔助細胞的凋亡，但是該作用必須依賴光敏劑(PS)的起始濃度和局部氧的含量。對於SDT，因有高能量參與，細胞裂解為主要的現象，這可能會掩蓋對活存細胞的其它作用。
Umemura等的美國專利第4,971,991號公開了利用超聲波治療腫瘤細胞，但其依賴較高的超聲波功率電平，並沒有描述微泡的應用。諸如D』Arrigo的美國專利第5,215,680號的其它專利描述了超聲波和微泡，其依賴於超聲波的空穴作用和熱作用來治療腫瘤，與治療單獨的癌症細胞相對比，由治療持續時間和數量來確定其治療的範圍。這種類型的治療使用高能量和長時間的輻射，主要產生細胞的裂解和壞死。參見Kondo，Cancer Letters 178(1)，63-70，(2002)。
附圖的簡要說明

圖1所示為本發明所述的超聲波處理設備的一個實施方案。
圖2所示為利用超聲波和微泡處理懸浮液中過度增殖細胞的設備的三種視圖。最左側圖為所述設備的俯視圖，中間圖為主視圖，及最右側圖為所述設備的側視圖。
圖3所示為超聲波處理對細胞穀胱甘肽水平作用的柱狀圖。數據以相對於未處理細胞表現出穀胱甘肽水平的細胞的百分比來表示。數值是3個獨立實驗的平均值±標準誤。
圖4所示為表示高頻超聲波對細胞caspase-3活性作用的柱狀圖。
圖5所示為輻射對K562細胞克隆效率作用的柱狀圖。結果以3個獨立試驗的平均值±標準誤表示。
圖6所示為經1次或3次超聲波處理後5小時K562凋亡細胞的百分率柱狀圖。用Annexin-V標記後由流式細胞計量儀測定凋亡比值，並且結果以7個獨立實驗的平均值±標準誤表示。
圖7所示為磷脂醯絲氨酸分布依據時間和連續的超聲波處理而變化的點圖。來自一個代表性實驗的結果以被Annexin-V-FITC標記的細胞的百分率表示。
圖8所示為超聲波處理對正常單核細胞(MNC)和白血病細胞(Nalm-6、KGla、HL-60細胞和來自5例患者的原代白血病細胞)凋亡作用的柱狀圖。結果為5個獨立實驗的平均值±標準誤。
發明的詳細描述凋亡或程序性細胞死亡是多細胞器官發育和健康的正常組成部分。凋亡保證了組織在發育、宿主防禦、衰老和對包括γ輻射和紫外暴露的多種信號產生反應過程中的自我平衡。細胞響應各種刺激而發生的死亡，特別是在凋亡過程中，這種死亡是以受控方式進行的。這使得凋亡不同於另一種稱為壞死的細胞死亡形式，在壞死中不能控制的細胞死亡導致細胞的裂解、炎症反應以及可能發生各種健康問題。相反，凋亡是細胞在其自我死亡的中能夠發揮活性作用的過程，這是為什麼凋亡常稱為細胞自殺的原因。
當接收到特異信號指示細胞發生凋亡時，通常在細胞中發生了一系列特殊的生化和形態學變化。例如，在凋亡早期通常有稱為caspases的蛋白家族被活化。這些蛋白分解或裂解正常細胞功能所必需的關鍵細胞底物，包括細胞支架中的結構蛋白和諸如DNA修復酶的核蛋白。Caspases也能活化其它的諸如裂解核中DNA的DNase酶的降解酶。通常，凋亡細胞的死亡以核膜的早期變化、染色質凝集以及DNA片斷化為特徵。這些生化改變導致細胞的形態學變化。
本發明的教導涉及壓制、防止液體介質中存在的過度增殖細胞(例如，腫瘤細胞)生長或清除這些細胞的設備和方法。在更具體的實施方案中，本發明提供的方法和設備誘導諸如生理液體的懸浮液中過度增殖細胞的凋亡。可處理的生理液體包括血液、血漿、血清及腦脊液，其能夠從包括哺乳動物、人等等的動物中提取和/或給予該動物。
根據本發明教導的低能量、高頻率超聲波處理能夠誘導過度增殖細胞的凋亡作用。這些作用包括例如，對線粒體膜的作用(線粒體電位的降低)、磷脂醯絲氨酸不對稱性的喪失、激發膜脂質的氧化作用(細胞GSH水平的降低)、形態學改變、DNA片段化、漿膜缺失等等。此外，低能量超聲波誘導的凋亡可參與細胞中caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解，以及bcl-2/bax比值的調節。
特定的實驗(參見實施例)已經證實在快速誘導凋亡的同時產生有限的壞死數量。
設備與方法能夠用於實現本發明方法的所述設備的實施方案能夠在Cordemans等的美國臨時申請第60/423,368號、美國申請第10/358445號以及美國專利第6,540,922號中發現，其中的每一篇均全部引用作為本文的參考。處理過度增殖細胞方法可利用本發明公開的設備來進行。一個能夠用於處理諸如水性介質(例如，生理性液體)的液體介質設備的特定實施方案如圖1所示。在某些的實施方案中，所述被處理的液體含有過度增殖細胞。在其它的實施方案中，所述被處理的液體可以是例如診斷後懷疑含有過度增殖細胞的生理性液體。也可以處理諸如幹細胞的不完全分化細胞以及含有病毒和/或病毒感染的細胞的溶液。可處理的病毒的例子包括例如HIV、HCV、HBV、皰疹病毒、漢他病毒(hantavirus)、流感病毒及伊波拉病毒。
參照圖1，本發明所述的設備包括隔室2，優選呈圓柱形或矩形橫截面。在特定的實施方案中，所述隔室2與裝載待處理的液體介質儲存器(未顯示)連接。在其它的實施方案中(例如，當人或動物生理性液體被處理時)，本發明所提供的設備不含有直接與人或動物體連接的儲存器。這些實施方案包括那些其中包括在人和其它動物體的離體處理過程中所述生理性液體被提取和/或被給予(例如，再注射)的方案。據此，諸如人的動物能夠被本發明所指的任何「儲存器」所取代。
在其它實施方案中，如所示圖2的設備能夠處理過度增殖細胞懸浮液。在此實施方案中，空氣進入管3用作微泡發射器3來發射微泡5進入包含在隔室(或poach)20中的所述過度增殖細胞懸浮液22。可將含有所述細胞懸浮液22的所述隔室(或poach)20浸入諸如恆溫箱的水浴24中。
在進一步的實施方案中，所述隔室2含有(例如，沿其壁或在其底部附近)一種或多種高頻超聲波發射器1，其發射超聲波4進入所述的隔室2(有利地應朝向此隔室2的中央)。在其它的實施方案中，所述容器還具有一種或多種微泡發射器3來發射氣體微泡5，其被設計成發射所述氣體微泡5進入超聲波4發射到隔室2中的區域。
本發明所用術語「微泡」特指平均直徑小於1mm的氣泡。在一些實施方案中，所述直徑小於或等於50μm。而在其它的實施方案中，所述微泡直徑小於30μm。在某些的實施方案中，所述微泡選自空氣、氧和臭氧或其混合微泡。為了降低操作成本，能夠使用諸如空氣微泡的非臭氧微泡是有利的。本發明有利的實施方案不依賴於產生熱效應來處理細胞。儘管在特定的實施方案中使用穩定的微泡能夠有效地處理細胞，但在優選的實施方案中，使用的穩定的微泡不是必需的。穩定微泡的一個例子是脂質邊界(lipid boundary)微泡。
術語「過度增殖細胞」意指以相對較高水平分化、再生或增殖的細胞，並可包括癌症細胞(例如，白血病細胞)、前癌細胞、腫瘤細胞、骨髓細胞及全能細胞。
在某些實施方案中，術語「液體介質」涉及生理性液體，其可給予人或動物和/或從人或動物中提取。在具體的實施方案中，將生理性液體處理後進行再注射(例如，體外處理再回輸)。在某些實施方案中，所述術語「生理性液體」包括但不限於血液、血清、腦脊髓液、腦脊液、血漿等等。Tachibana等發表的美國專利第5,401,237號描述了提取和再給予生理性液體的步驟，其全部在此引用作為本文的參考。
在具體的實施方案中，本發明所述方法和設備包括用低能高頻超聲波處理過度增殖細胞。術語「高頻」意指高於100kHz並高達數MHz的頻率。在某些的實施方案中，所使用的高頻在200kHz與20MHz之間。在不同的實施方案中，所述的超聲波頻率選自200kHz與10MHz之間。在優選的實施方案中，所用頻率在200kHz與1.8MHz之間。
在本發明所述設備的多種實施方案中，將用來發射氣體微泡5的微泡發射器3置於隔室2的底部11(即在隔室2的基底部)，使得所述微泡通過自然上升或通過在所述液體流對氣體的夾帶來移動。
在進一步的實施方案中，本發明所述設備和方法誘導過度增殖細胞的凋亡。已發現，健康細胞比白血病細胞對高頻超聲波更加不敏感。這種健康與白血病細胞間的行為差異與內源性光敏劑的分布差異無關，但其可能是由例如p53狀態、信號途徑以及氧化應激的耐受性的基礎細胞機制改變所引起。特別地，能夠誘導癌症細胞(例如，白血病細胞)、前癌細胞、腫瘤細胞、骨髓細胞及全能細胞等等的凋亡。
雖然本發明的教導不能在任何方式上受其準確的作用機制的限制，但在更具體的實施方案中，本發明所述的設備和方法能夠產生諸如ROS(活性氧類)、H·、·OH及HOO·的自由基，其還可形成H2O2，該分子和/或這些自由基對過度增殖細胞具有毒性並因此使其失活和/或破壞。產生自超聲波狀態下的氧化應激作用的脂質過氧化產物也可能是此生物機制的潛在參與者。
儘管證據不支持在聲能治療中有單線態氧的形成，但這些數據僅符合長時間和「高能量」超聲波暴露狀況，其可直接由於高溫分解或者由於與水溶劑的高溫分解所形成的H·或·OH自由基反應導致敏化劑衍生的自由基的累積。
使用所公開的方法和設備產生的物質應理解為衍生自高頻超聲波對水分子作用引起的反應，最有可能的是如下的反應(特別是在氧的存在下)
，
有利地，如本發明所述，如果此過程有微泡存在，產生這些毒性物質所需的能量會降低。在確定的實施方案中，發生器被設計成能夠向所述超聲波發射器提供低於1W/cm2的能量。在優選的實施方案中，所提供的能量約為0.5W/cm2或更低，或者在許多更有利的實施方案中，所述能量約為0.25W/cm2或更低。在有利的實施方案中，此應用於發射器的功率電平在所述生理性液體體積中消耗的能量低於30mW/cm3。在一些實施方案中，所述能量消耗約為7mW/cm3。
儘管在某些實施方案中可連續給予所述超聲波，但在其它的實施方案中，所述超聲波以開/關循環間斷給予。根據細胞體積、細胞類型和其它相關變量，本領域所述技術人員可確定有效的開/關循環時間。
本發明教導的進一步實施方案涉及處理懸浮液中的過度增殖細胞，而不是腫瘤或瘤體。在這些實施方案中，本發明的教導不依賴微泡在特定的腫瘤位點來濃縮或匯集。這使得能夠處理沒有叢生在一起的不需要的過度增殖細胞。
本發明所提供方法和設備的另一個優點是在較短的時間內可有效處理所述的過度增殖細胞。在特定的實施方案中，在1分鐘內能夠處理過度增殖細胞。在更特定的實施方案中，所述細胞在30秒內被處理，例如包括5-20秒之間。
如本領域所公知，超聲波作用的生物物理方式分為具有熱、空穴作用或者具有非熱和非空穴作用。需要指出的是使用上述能量範圍和縮短處理時間可避免顯著的液體和/或細胞受熱，這使得不發生熱致細胞死亡。作為例子，非熱作用處理包括在低於40℃、35℃及30℃下進行的處理。所述功率電平同樣是不發生明顯程度的空穴作用的水平，從而基本避免由超聲波引起的細胞膜損失。
最近發現，在較高超聲波能量下微泡注入到超聲波區域通過微泡在超聲波誘導空穴泡上的疊加作用引起聲致發光現象的增加，可使激發和有毒的物質的數量增多。當超聲波處理協同結合適合大小的微泡存在下，能夠在宏觀水平觀察到此現象。
在另外的實施方案中，因為觀察到該處理系統通過將原位形成的產物(例如形成的自由基和H2O2)向待處理的水性介質的儲存器6的擴散來發揮功能，所以本發明提供的所述設備和方法具有不需將超聲波射入特定區域的優點。
在進一步的實施方案中，在本發明所述設備中的所述的一種或多種超聲波4發射器1定向成不產生任何駐波現象。例如，在某些實施方案中，一種或多種超聲波發射器相對於所述隔室2的軸9並相對於液體流和微泡流5斜向定向(不垂直於此軸9的銳角)(參見圖1)。這種特徵使在隔室2中的所有微泡5以統計學上一致的方式被處理，而不在隔室2中產生靜止帶。
本發明所述的設備和方法可包括發射具有平均直徑小於1mm的氣體微泡進入被處理液體介質的高頻超聲波區域。在一些實施方案中，所述微泡的直徑小於或等於50μm。在另外的實施方案中，所述微泡的直徑小於30μm。在某些的實施方案中，所述微泡選自空氣、氧和臭氧微泡。在其它的實施方案中，所述微泡是非臭氧微泡。
根據其它的實施方案，本發明所述設備和方法包括光發射器12(即電磁輻射發射器)，其發射主要為可見範圍頻率的輻射進入隔室2中的所述超聲波4區域。然而，對於特定的應用，為了去除某些特定的過度增殖細胞，發射主要為非可見頻率的電磁輻射是有利的，如紫外線(例如，UVA、UVB或UVC型)、紅外、雷射、微波等等。
最近意外地發現，包括微泡發射進入所述區域，結合有超聲波和可選擇的光輻射對失活和去除諸如生理性液體的液體介質中的過度增殖細胞特別有效。發光現象能夠促進超活化氧化物質諸如過氧化自由基或單線態氧的產生，其能夠導致對某些過度增殖細胞具有超毒性的一系列生化反應。在有利的實施方案中，所述的輻射以開/關循環間斷髮射。在更具體的實施方案中，所述開/關循環周期約為5.5ms/3ms。
已知在所謂敏化分子(例如，光敏劑和聲敏劑)的存在下能夠產生發光，使得在某些癌症細胞中產生抗腫瘤作用。這種分子包括卟啉、氯、四環素類、亞甲基蘭、螢光素、吖啶、若丹明(rhodamine)等等。可將這些活性試劑注射入有機體或口服給藥並隨後由聲致發光來活化。活化後，這些試劑產生單線態氧，其進而發揮基礎作用，特別是在由氧化應激產生的生化過程中發揮基礎作用。特別地，單線態氧能夠氧化各種細胞成分，例如蛋白質、脂質、胺基酸和核酸。
在其它的實施方案中，固體微粒和固體表面能夠用來協同增強輻射的發光和/或發射。這些固體包括例如TiO2、陶土和陶瓷。
許多實施方案涉及不需要附加化學產物的設備和方法，該化學產物諸如用來壓制、防止生理性介質中過度增殖細胞生長和/或去除該細胞的光敏劑和/或聲敏劑。由於意外地發現已經含有這些光敏分子的生理性液體(例如，血液)中的某些過度增殖細胞(例如白血病細胞)能夠原位產生發光，因此將光敏劑或聲敏劑加入到所述的液體介質中並不總是必要的。
儘管本發明所述的設備和方法能與其它諸如光敏劑、聲敏劑、化療劑、抗生素、抗病毒藥物的藥物聯合使用，但需指出的是，本發明所提供的處理過度增殖細胞的方法和設備的有效性並不依賴於其它化學藥品、反應試劑或藥物的使用。因此，本發明所述方法和設備能夠在沒有其它物質條件下使用，該物質包括化學藥品、反應試劑、激素、肽、蛋白質、核酸、碳氫化合物、DNA疫苗、血管生成刺激劑或藥物。在更多具體地實施方案中，本發明的教導不依賴於細胞對這些物質的吸收。
特別地，在不需要典型的光敏劑和聲敏劑的條件下可實現本發明教導所得到的效果。利用諸如PDT的技術獲得的生理作用同時依賴於所使用的輻射劑量、使用光敏劑的特性、它們的含量以及它們的分布。儘管進行傳統的處理需要敏化劑，但本發明提供的教導不需要敏化劑，因此相對簡化所述的方法和設備。
在某些實施方案中，超聲波作用的淨效果與結構中局部含有較高含量的內源性光敏劑相關聯。例如，內源性光敏劑主要分布在諸如溶酶體、線粒體、核膜、高爾基體及內質網的微粒體的膜結構中，其相對的表面佔細胞膜表面的接近50％。
在一些實施方案中，本發明所述設備和方法包括循環所述液體介質的泵，以及一種或多種優選通過過濾、離心或沉澱(例如旋轉等等)用於恢復所述液體介質中存在的過度增殖細胞的裝置。在某些實施方案中，將所述用於恢復的泵和/或恢復裝置被置於所述含有所述待處理液體介質的儲存器(或動物)與所述隔室2之間。
在某些實施方案中，本發明所述設備和方法能夠用來從懷疑患有(例如，診斷的)癌症(例如，白血病)的個體中提取生理性液體(例如，血液)。在提取後，能夠用高頻低能超聲波和直徑小於1mm的氣體微泡處理該生理性液體。在某些實施方案中，所述方法誘導所述癌性細胞(例如，白血病)的凋亡。在處理所述生理性液體使得所述過度增殖細胞被充分壓制、防止生長或被去除後，所述液體隨後能夠給予所述的個體。這些方法以與其它的體外處理再回輸的方法相似的方式進行，例如血液透析。
可將進行血液處理個體與本發明所述的設備中的一種相連接。根據某些實施方案，可通過所述個體手臂內部的瘻管將其血流連接到本發明所述的超聲波設備上。這包含了動脈與靜脈間的手術性連接。當它們連接後，從動脈而來的較強的血流會引起靜脈變粗。可將針插入增粗的靜脈中來將所述個體與所述超聲波設備連接起來。
提供進入血流的另一種方式是插入內在的移植物。在此步驟中，用放置在皮下的一段特殊的短管將動脈與靜脈手術連接，針能夠插入該短管。
在其它的實施方案中，當有必要快速到達所述的血流時，或者例如當所述手臂中的所述靜脈太小不能提供足夠的用於超聲波處理的血液時，可使用某些靜脈導管。在此步驟中，軟管被手術插入頸部或近鎖骨處的大靜脈中。在一些實施方案中，在持久的進入位點就緒之前該方法是臨時的。
能夠根據本發明所述的方法處理的個體包括任何動物，例如包括人小鼠、猴子、狗、豬等等的哺乳動物。
在進一步的實施方案中，本發明所述設備和方法利用低能、高頻超聲波通過誘導細胞(例如白血病細胞)的凋亡來預防、治療或壓制過度增殖細胞。誘導過度增殖細胞的凋亡能夠引起一系列特徵後果，包括線粒體電位的降低、磷脂醯絲氨酸不對稱性的喪失、形態學改變、DNA片段化、漿膜缺失等等。此外，低能超聲波誘導的凋亡能夠包含細胞中的caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解以及bcl-2/bax比值的調整。
附加的方法包括利用超聲波誘導的聲化學發光，通過直接的光輻射激發光敏性單線態氧產物來啟動凋亡。在典型的超聲波輻射條件下，所述直接的破壞性空穴作用在該聲致發光中起主導作用，其在所述介質中沒有介入空氣/液體界面時相當弱。據此，為增強空穴作用中的發光，聯合使用微泡與超聲波是有利的。
以下的實施例描述了利用高頻低能超聲波處理，以及顯示所述細胞凋亡存在的各種分析。
實施例1細胞的製備與高頻超聲波處理將從美國典型培養物貯藏中心(ATCC，Rockville，MD，美國)獲得的人白血病細胞株(K562、Nalm-6、KGla及HL-60)培育在含有10％胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY，美國)和1％L-谷醯胺(Gibco)的RPMI-1640(BioWhittaker，Walkersville，MD，美國)中。收集白血病細胞，以磷酸鹽緩衝液(PBS，pH＝7.2，Gibco)重懸，並立即用於實驗。從健康志願者和白血病患者中獲得肝素化的靜脈血液。通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心(International Medical Products，Brussels，Belgium)來分離單核細胞。
以下描述了對所述細胞的超聲處理。通過頻率為1.8MHz的超聲波、7mW/mL的聲能、以5.5ms/3ms的輻射周期(開/關)在不同暴露時間下處理人白血病細胞株(K562、HL-60、KGla及Nalm-6)、原代白血病細胞以及正常單核細胞。
在培養箱(37℃和5％CO2)中培養18小時後，通過臺盼藍排除分析可成功地檢測所述細胞的存活。在以下的實施例中將詳細描述對所述處理的細胞進行的其它實驗。通過細胞形態學、磷脂醯絲氨酸暴露及DNA片段化來評價細胞凋亡。通過流式細胞計量儀來檢測線粒體電位、谷醯胺含量、caspase-3活化作用、PARP降解以及bcl-2/bax比值。在甲基纖維素中評價克隆效率。
實施例2高頻超聲波對DNA片段化的作用DNA片段化與凋亡相關。根據Nicoletti，I.et al.J Immunol Methods139(2)271(1991)所述的方法及Apotarget Quick DNA Ladder檢測試劑盒(Biosource)對含有降解DNA的細胞進行定量。將細胞團(106細胞)重懸浮在20L的裂解緩衝液中並根據廠商說明書來抽提DNA。通過凝膠電泳(1％瓊脂糖)分離DNA後進行分析。作為陽性對照，將平板直接放置在UV發光器下10分鐘(強度為5mW/cm2)利用UV光照射細胞。隨後，在評價凋亡之前，將細胞培養在37℃、5和18小時。
在通透化後，將細胞在含有PI和RNAse(Coulter DNA-prep反應劑)溶液中孵育。在進行流式細胞計量儀鑑定與凋亡對應的亞G0峰之前，將該小管在4℃放置在黑暗中過夜。
在經紫外光(陽性對照)和超聲波處理細胞的DNA樣品中觀察到典型的核小體DNA梯狀帶形式。超聲波處理5小時後幾乎沒有可見的內部核小體DNA降解但在18小時以後變得清晰可見(結果未顯示)。此外，處理5小時後用PI染色可觀察到具有片段化DNA的核的數量的增加。具體地，15％的所述處理細胞具有片段化DNA，而2％未處理的細胞具有片段化DNA(數據未顯示)。
實施例3高頻超聲波對線粒體跨膜電位的作用在細胞凋亡的一些類型中，觀察到了早於發展的DNA片段化的線粒體跨膜電位(ΔYm)的早期中斷。通過以下的分析來測定高頻超聲波處理對ΔYm的作用。
根據A.Macho，et al.，Blood.86(7)2481(1995)發表的步驟在細胞處理後即刻利用與陽離子螢光染料DiOC6的結合來估計線粒體電位。
簡而言之，將K562細胞(106/mL)與2.5nmol/L的3，3′-二己基氧羰花青(DiOC6；分子探針，Eugene，OR)在37℃孵育15分鐘，隨後用流式細胞計量儀來分析。
超聲波處理伴隨著顯示較低的ΔYm的細胞群的增加(結果未提供)。在處理後30分鐘發現顯示與DiOC6結合減少的細胞群，並且在超聲波處理後5小時線粒體電位的降低非常清楚，超過50％的細胞具有較低的ΔYm。這些結果提供了細胞凋亡的證據。
實施例4高頻超聲波對細胞穀胱甘肽水平的作用已表明在凋亡過程中有穀胱甘肽的丟失。在超聲波處理後進行了測定細胞穀胱甘肽含量的分析。如D.W.Hedley et al.Cytometry 15349(1994)所述，使用細胞示蹤綠CMFDA(5-氯甲基螢光素二乙酸酯；分子探針)來測定細胞內穀胱甘肽水平。
如圖3所示，與未處理細胞相比，在超聲波處理後直接出現顯示出較低GSH水平的亞群(＞50％的細胞顯示低水平GSH)。連續處理的結果顯示，5小時後較多的GSH丟失。這些結果與未處理細胞比較，以顯示GSH水平的細胞百分比來表示，清楚地表明高頻超聲波處理與GSH丟失相關。
實施例5高頻超聲波對細胞caspase-3活性的作用已表明Caspase-3在化療誘導的凋亡中發揮重要作用。具體地，caspases的活化作用通過諸如肌動蛋白、凝溶膠蛋白或PARP的細胞底物的降解可導致細胞死亡。為直接證實caspase-3在超聲波誘導凋亡中的參與作用，利用流式細胞計量儀和比色分析測定了caspase的活性。
具體地，利用具有抗caspase-3單克隆抗體活性的與藻紅蛋白(PE)結合的多克隆兔抗體(BD-Pharmingen，San Diego，CA，美國)，通過流式細胞計量儀來測定caspase-3。室溫下利用固定與通透試劑盒(Caltag，Burlingame，CA)固定和通透化細胞15分鐘。隨後用抗caspase-3抗體標記細胞並孵育15分鐘。洗滌細胞並通過流式細胞計量儀來分析。根據廠商建議，利用Apotarget的caspase-3/cpp32/比色蛋白酶分析試劑盒(Biosource)測定caspase-3酶活性。也可以通過PARP降解，利用兔抗PARP降解位點AB與FITC結合(Biosource)來間接評價Caspase-3活性。
如圖4所示，高頻超聲波處理導致caspase-3的活化。此外，在處理後1小時此蛋白酶的活性達最高。而且，在處理後2小時PARP的降解明顯，有40％的細胞被兔抗-PARP FITC標記，與之相比只有5％的未處理細胞被標記(結果未顯示)。
實施例6高頻超聲波對細胞BCL-2/BAX比值的作用已表明bcl-2家族的不同蛋白在啟動和防止凋亡中有作用。進行以下的分析來測定bcl-2家族的兩個主要成員bcl-2與bax是否參與了超聲波對凋亡的誘導作用。通透化後，細胞與同型匹配陰性對照、FITC標記小鼠抗人bcl-2(Dako，Glostrup，Denmark)、以及抗bax的多克隆兔抗體一同孵育。隨後將FITC標記的第二抗體(Dako)加入到bax。為確定bcl-2與bax的表達量，通過用已知含量的螢光染料標記的顆粒混合物(Dako)來標準化所述的細胞計量儀。隨後利用標準曲線將螢光強度平均值(MFI)轉化為等價的可溶性螢光染料的摩爾數(MESF)。
結果(數據未提供)顯示，未處理的細胞表達高水平的抗凋亡蛋白bcl-2蛋白((47±4)×103MESF)，並且此表達以螢光單峰的形式出現。超聲波處理1小時後，bcl-2蛋白的表達已被下調(用超聲波進行1或3次處理的K562細胞中分別為(40±0.9)×103MESF和(32±0.9)×103MESF)。處理後兩小時，bcl-2表達出現明顯的雙峰，所述細胞表現出或者高bcl-2(與未處理細胞比較)表型或者低bcl-2((11±2)×103MESF)表型。
與bcl-2相反，與未處理細胞比較，在超聲波處理的細胞中促凋亡蛋白bax的水平明顯增加(處理和未處理的K562分別為(85±0.5)×103MESF和(48±5×103MESF)。因此，高頻超聲波處理過程中bcl-2/bax比值顯著降低，以此提供了細胞凋亡的證據(對照細胞為0.98而超聲波處理細胞為0.38)。
實施例7高頻超聲波對細胞磷脂醯絲氨酸水平的作用在凋亡中，磷脂醯絲氨酸殘基從質膜的內面翻轉到外面，且此變化能夠利用結合PS殘基的Annexin-FITC來測定。以下描述了所進行的Annexin V結合分析。依照廠商建議，使用購買自Biosource International(Camarillo，CA，美國)的試劑盒，對用Annexin-V-螢光素異硫氰酸酯(FITC)-和碘代吡啶(PI)-標記的細胞進行流式細胞計量儀分析。數據以顯示Annexin-V-FITC/碘代吡啶的平均螢光強度變化的點圖表示(未顯示)。
結果表明，依據時間，磷脂醯絲氨酸分布隨時間的變化而不同。具體地，結果顯示細胞中經超聲波處理引發的質膜損傷呈現低百分比，這表明測試的超聲波處理的壞死作用是非常弱的。有意思的是，在處理兩小時後，觀察到了凋亡細胞的增加。處理五小時後，35％的細胞為Annexin-V-陽性，表明了超聲波誘導K562細胞凋亡的作用。
實施例8高頻超聲波對克隆形成的作用對細胞存活力起作用的重要證據是細胞增殖和形成克隆的不能。以下描述了克隆形成分析，其針對K562細胞株進行來測定高頻超聲波輻射對克隆形成效率的作用。簡而言之，培養基由含有20％FCS和終濃度為4％的甲基纖維素的IMDM構成。在37C、含5％CO2的空氣中進行培養，且5天後計數克隆(＞20個細胞)。K562細胞株的克隆形成效率為16％。如圖5所示，在1和3次處理後，觀察到K562細胞的克隆形成效率顯著降低(分別抑制25％和42％)，證明了白血病細胞對高頻超聲波的敏感性。
實施例9去氧劑對凋亡的作用進行以下步驟來測定由高頻超聲波產生的活性去氧劑對凋亡的誘導作用。用L-組氨酸(10mM)和/或甘露醇(100mM)孵育K562細胞。一些細胞用高頻超聲波處理而另一些不用。通過Annexin-V/PI分析測定細胞凋亡。結果見表1，表明在組氨酸和甘露醇存在下超聲波誘導的細胞凋亡明顯減少(通過3次連續處理誘導的凋亡分別抑制43％和47％)。
表1活性去氧劑對超聲波誘導的細胞凋亡的作用

結果以處理5小時後顯示磷脂醯絲氨酸表面化的細胞百分比來表示(來自4個獨立實驗的平均值±標準誤)。
甘露醇與組氨酸聯合可導致超過60％的凋亡抑制。這些試劑在降低由超聲波處理誘導的凋亡方面的有效性為超聲波誘導的單線態氧自由基和氫氧自由基是誘導凋亡的重要介導劑提供了證據。
實施例10連續高頻超聲波處理對細胞的作用對超聲波處理後培養0.5、2和5小時的K562細胞重複進行了流式細胞計量儀的分析。一次處理後，觀察到凋亡細胞的水平是對照的三倍(處理和未處理細胞培養5小時後分別為26％和8％)。還觀察到有5-10％的壞死作用，其顯著低於利用藥物處理和光能處理(PDT)時所觀察到的。通過連續的輻射，在相同的條件(7mW/mL，20秒)以及在不同的間隔下，在1和3次連續的處理後，K562細胞的凋亡分別增加至37±3％(p＜0.02)和49±5％(p＜0.02)(圖6)。連續處理後還觀察了形態學的變化(例如，細胞皺縮、膜出泡、染色質凝集)(結果未顯示)。圖7顯示，在連續高頻超聲波處理後通過Annexin-V分析檢測的細胞磷脂醯絲氨酸含量增加。
實施例11高頻超聲波對不同細胞株的作用除K562之外，檢測了超聲波處理對其它正常和惡性細胞株的作用，包括KGla(最小分化幼稚急性髓性白血病母細胞)、HL-60(前髓白血病細胞)和Nalm-6(ALL細胞株)。結果如圖8所示，表明對超聲波的敏感性依賴於細胞類型，但連續的處理導致所評價的所有細胞株的凋亡細胞數量的顯著增加。
還用超聲波處理了來自5例患者的單核細胞(1例有過量母細胞的難治貧血[RAEB]、1例繼發性急性髓性白血病[AML]、以及3例分類為M3、M4和M4Eo的AML法國-美國-英國[FAB])，並參照以往F.Lacombe，F.etal.Leukemia 111878(1997)的描述，根據其CD45的表達可從汙染了正常的細胞中區分母細胞。也可以通過FITC-Annexin對這些細胞中暴露的磷脂醯絲氨酸的識別對其進行標記。此方法使得經超聲波處理的白血病母細胞和正常細胞的各自凋亡行為的比較成為可能。如圖8所示的結果表明，原代白血病細胞對超聲波處理敏感，3次處理後5小時觀察到的凋亡細胞超過37±18％。
以上描述詳細闡述了本發明教導的某些實施方案。然而應理解，雖然無論上文出現的描述有多詳細，本發明所述的設備和方法能夠以多種方式來實施。同樣如上所述，應指出的是，在描述本發明教導的某些特徵或方面所使用的特定名詞術語不應視為本發明中的再定義，用來限制與該術語相關的包含本發明教導的特徵和方面的任何特定的特性。因此本發明教導的範圍應根據附具的權利要求及其任何等價物來解釋。
權利要求
1.處理細胞懸浮液的設備，包括含有液體的隔室，所述液體含有過度增殖、未分化或病毒感染的細胞；設計成以不引起顯著空穴作用或顯著加熱所述液體的功率電平和持續時間，發射具有高於100kHz的頻率的超聲波的發射器；及設計成向所述隔室中的所述超聲區域發射平均直徑小於1mm的微泡的微泡發射器。
2.如權利要求1所述的設備，其中所述氣體微泡選自空氣微泡和氧氣微泡。
3.如權利要求1所述的設備，其中所述隔室含有從哺乳動物中提取的生理性液體。
4.如權利要求1所述的設備，其中所述生理性液體選自一種或多種血液、血漿、血清或腦脊液。
5.如權利要求1所述的設備，其中所述氣體微泡的平均直徑小於50μm。
6.如權利要求1所述的設備，其中所述氣體微泡的平均直徑小於30μm。
7.如權利要求1所述的設備，其中所述微泡發射器位於所述隔室的底部。
8.如權利要求1所述的設備，其中所述隔室包括被設計成連續或間斷髮射超聲波的多個超聲波發射器。
9.如權利要求1所述的設備進一步包括電磁輻射發射器。
10.如權利要求9所述的設備，其中所述電磁輻射發射器以一種或多種選自紫外線(UVA、UVB或UVC)、紅外線及微波的頻率發射連續或間斷的輻射。
11.如權利要求1所述的設備進一步包括恢復存在於處理的生理性液體中的過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的裝置。
12.如權利要求11所述的設備，其中所述的用來收集過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的裝置選自過濾器和旋力分離器。
13.如權利要求1所述的設備進一步包括被設計成向所述超聲波發射器提供低於1W/cm2能量的發生器。
14.如權利要求13所述的設備，其中所述能量以低於30mW/cm3的水平向所述生理性液體傳送。
15.壓制、清除和/或防止懸浮在生理性液體中的過度增殖、未分化或病毒感染細胞的生長的方法，包括向含有所述待處理生理性液體的隔室內發射頻率高於100kHz的超聲波；及向含有所述生理性液體的所述隔室中的所述超聲波區域發射平均直徑小於1mm的氣體微泡。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述氣體微泡不是臭氧微泡。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述氣體微泡選自空氣微泡和氧氣微泡。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述生理性液體被給予哺乳動物和/或提取自哺乳動物。
19.如權利要求15所述的方法，其中所述生理性液體選自血液、血漿、血清和腦脊液。
20.如權利要求15所述的方法，其中所述氣體微泡的平均直徑小於50μm。
21.如權利要求15所述的方法，其中所述氣體微泡的平均直徑小於30μm。
22.如權利要求15所述的方法，其中向所述隔室內發射的所述超聲波不產生駐波場現象。
23.如權利要求15所述的方法進一步包括發射具有主要在可見光譜區的電磁輻射的光進入所述超聲波區域。
24.如權利要求15所述的方法，其中所述過度增殖細胞選自腫瘤細胞、骨髓細胞、腫瘤幹細胞及前癌細胞。
25.如權利要求15所述的方法，其中所述過度增殖細胞為白血病細胞。
26.如權利要求25所述方法，其中所述方法通過體外處理再回輸實施。
27.如權利要求15所述方法進一步包括向所述超聲波發射器提供低於1W/cm2的能量。
28.如權利要求27所述方法，其中所述能量以低於30mW/cm3的水平向所述生理性液體傳送。
29.處理存在於生理性液體中的過度增殖、未分化或病毒感染細胞的生長的方法，包括向含有所述待處理生理性液體的隔室內發射頻率高於100kHz的超聲波；及向含有所述生理性液體的隔室中的所述超聲波區域發射平均直徑小於1mm的氣體微泡，使得所述超聲波和微泡的發射誘導所述過度增殖、未分化或病毒細胞的顯著凋亡。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述氣體微泡不是臭氧微泡。
31.如權利要求29所述的方法，其中所述氣體微泡選自空氣微泡和氧氣微泡。
32.如權利要求29所述的方法，其中所述生理性液體被給予哺乳動物和/或提取自哺乳動物。
33.如權利要求29所述的方法，其中所述生理性液體選自血液、血漿、血清和腦脊液。
34.如權利要求29所述的方法，其中所述氣體微泡的平均直徑小於50μm。
35.如權利要求29所述的方法，其中所述氣體微泡的平均直徑小於30μm。
36.如權利要求29所述的方法，其中向所述隔室內發射的所述超聲波不產生駐波場現象。
37.如權利要求29所述的方法進一步包括發射具有主要在可見光譜區的電磁輻射的光進入所述超聲波區域。
38.如權利要求29所述的方法，其中所述過度增殖細胞選自腫瘤細胞、骨髓細胞、癌細胞及前癌細胞。
39.如權利要求29所述的方法，其中所述過度增殖細胞為白血病細胞。
40.如權利要求39所述方法，其中所述方法通過體外處理再回輸實施。
41.如權利要求29所述方法進一步包括向所述超聲波發射器提供低於1W/cm2的能量。
42.如權利要求41所述方法，其中所述能量以低於30mW/cm3的水平向到所述生理性液體傳送。
全文摘要
本發明公開了利用高頻、低能超聲波處理、防止生長及壓制液體介質中過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的設備和方法。
文檔編號A61K41/00GK1741822SQ200380102757
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月4日 優先權日2002年11月4日
發明者埃裡克·D·科爾迪曼斯·德莫伊勒內爾, 鮑德溫·阿內卡爾, 伊夫·卡尼韋 申請人:阿什蘭公司