提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法以及因此產生的植物的製作方法

2023-05-09 23:27:46

專利名稱：提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法以及因此產生的植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及提高植物中非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法，更特別地，涉及表達外源非生物脅迫耐受性基因的植物。
背景技術：
非生物脅迫(也稱為「環境脅迫」)條件，如鹽度，乾旱，洪水，次佳溫度和有毒化學物質汙染，對農業植物引起實質性的損害。大部分植物已經進化出策略來保護它們自身以對抗這些條件。然而，如果脅迫條件的嚴重程度和持續時間太大，對大多數作物的植物發育，生長和產量的影響是意味深長的。此外，大部分植物對非生物脅迫(ABQ非常敏感，並因此需要用於商業作物產量的最佳生長條件。連續暴露於脅迫引起植物代謝的主要改變， 其最終導致細胞死亡，並且隨後產量損失。因此，儘管大範圍的研究以及使用複雜而深入的作物-保護方法，由於非生物脅迫條件引起的損失每年仍然為數十億美元(1，2)。以下概述了示例性非生物脅迫條件的含義。與乾旱相關的問題。乾旱是一段時間的異常乾燥天氣，持續足夠長的時間以致產生了嚴重的水文不平衡(例如，作物損害，給水短缺等)。而我們經歷的大部分天氣是短暫的，乾旱是更漸進的現象，緩慢佔有區域和拉緊對時間的控制。在嚴重的情況中，乾旱可以持續很多年並對農業和水供給具有毀滅性的影響。隨著發展中的人口和可用新鮮水的慢性短缺，乾旱不僅是農業中天氣相關問題的數字，而且還列為全部時間的主要自然災難之一， 不僅引起經濟損失，而且引起人類生命的失去。例如，由1988年的US乾旱引起的損失超過 $400億元，超過1992年颶風安德魯，1993年的密西西比河洪水和1989年的舊金山地震引起的損失。在世界的一些區域，乾旱的情況更嚴重。在非洲的Horn，1984-1985年的乾旱導致饑荒，使750，000人死亡。對於植物由低的水可用性引起的問題包括由細胞水分離引起的機械應力。乾旱還使植物變得更易患上各種疾病(Simpson (1981)「The Value of Physiological Knowledge of Water Stress in Plants」(植物中水應力的生理知識的價值)(Simpson，G. M.編輯)， Praeger, N. Y. pp. 235-265)。除了對大部分否則全部作物太乾旱的世界許多陸地區域，可用水的過度使用和過度利用導致農業可用陸地的日益減少，該過程達到極端將導致沙漠化。土壤中日益增加的鹽累積進一步使問題複雜化，如上所述，這增加了土壤中可用水的損失。與高鹽水平相關的問題。五分之一公頃的灌溉地受到鹽的損害，古代耕地社會群落下降的一個重要歷史因素。預期這種情況只會惡化，進一步降低可耕地的可用性和作物生產，因為最常見的五種糧食作物(小麥，玉米，水稻，土豆和大豆)中沒有一種可以耐受過度的鹽。鹽對植物的有害影響是導致滲透應力(與乾旱脅迫相似)的缺水的結果和過量鈉離子對關鍵生化過程的影響。與冰凍和乾旱相同，高鹽導致缺水；高鹽的存在使植物根部難以從其環境吸取水(Buchanan 等(2000)在 Biochemistry and Molecular Biology of Plants ψ,American Society of Plant Physiologists，Rockville，Md.) 。
是決定哪裡植物可以茁壯成長的多個重要變量之一。在世界的許多部分，由於天然的高土壤鹽度，相當大的土地區域是無法耕作的。為了使該問題更複雜，用於農業生產的土壤的鹽化是主要依賴於農業的區域中的重要且日益增加的問題。過度利用，過度施肥和水短缺使後者複雜化，通常由氣候改變和遞增人口的需求引起。鹽耐受性在植物生命周期的早期特別重要，因為從土壤表面的蒸發引起向上的水移動，並且鹽累積在放置種子的上層土壤中。 因此，發芽通常發生在比整個土壤分布中平均鹽水平高得多的鹽濃度。與過度熱相關的問題。許多作物的發芽對溫度非常敏感。提高熱條件中發芽的基因對於種植於季節後期或熱氣候中的作物是有用的。當蒸騰作用不足以克服熱應力時， 暴露於過度熱的秧苗和成熟植物可能經歷熱休克，其發生於各種器官中，包括葉子，特別是果實。熱還損害細胞結構，包括細胞器和細胞骨架，並損害膜功能[Buchanan等，Q000) 在 Biochemistry and Molecular Biology of Plants 中，American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md.]。熱休克可以產生全部蛋白合成的降低，伴隨熱休克蛋白的表達。熱休克蛋白作為伴侶蛋白並涉及熱變性的重摺疊蛋白。熱應力通常伴隨低的水可用性的條件。將熱自身看作相關的應力並增加由缺水條件引起的有害影響。蒸發的需求隨著白天溫度的提高呈現出接近指數增加，並可以導致高的蒸騰速度和低的植物水勢[Hall等(2000)Plant Physiol. 123 :1449-1458]。對花粉的高溫損害幾乎通常結合乾旱脅迫發生，很少在充分灌水的條件下發生。因此，分離熱和乾旱脅迫對授粉的影響是困難的。結合的應力可以以新的方式改變植物代謝；因此理解不同應力之間的相互作用對於通過遺傳操作提高應力耐受性的策略研發是重要的。與過度激冷條件相關的問題。術語「激冷敏感性」用來描述在低溫但是高於冷凍溫度產生的許多類型的生理損害。大部分熱帶來源的作物，如大豆，水稻，玉米和棉花，容易受到激冷的損害。典型的致冷損害包括萎蔫，壞死，萎黃或從細胞膜滲出離子。還沒有完全理解激冷敏感性的基礎機理，但是可能涉及膜飽和度的水平和其他生理缺陷。例如，光合作用的光抑制(由於高的光強度引起的光合作用的破壞)通常發生在晚夏/秋夜冷之後的晴朗天氣條件下。例如，激冷可以通過玉米延遲的成熟導致產量損失和降低產品質量。生長差的另一個後果是春天玉米地相當差的植被，通常導致水土流失，提高的雜草叢生和降低的營養吸收。礦物質氮延遲的吸收還可能導致提高的硝酸鹽流失至地下水中。通過一些估算，激冷佔美國(UQ的金錢損失只在乾旱和洪水之後。缺水是許多植物脅迫的常見組成部分。當整個植物的蒸騰作用速度超過水吸收時，植物細胞中發生缺水。除了乾旱，其他脅迫，如鹽度和低溫，產生細胞脫水(McCue和 Hanson (1990)Trends Biotechnol. 8 :358-362)。鹽和乾旱脅迫信號傳導由離子和滲透體內平衡信號途徑構成。鹽應力的離子方面通過SOS途徑來發出信號，在該途徑中鈣-應答性S0S3-S0S2蛋白激酶複合物控制離子轉運者 SOSl 的表達和活性。Xiong 和 ZhiK2002)Plant Cell Environ. 25 :131-139 最近綜述了調節應答鹽脅迫的離子體內平衡的途徑。鹽脅迫的滲透組成部分涉及與乾旱和/或冷應力應答重疊的複雜植物反應。Xiong和am (2002)上文最近綜述了乾旱、冷和鹽脅迫應答的常見特徵。這些包括(a)在信號情況非常早的時候細胞質鈣水平的瞬時改變(Knight，(2000) Int. Rev. Cytol. 195 :269-324 ；Sanders 等(1999)Plant Cell 11 :691-706)；(b)通過促細胞分裂劑激活的和/或鈣依賴性蛋白激酶(⑶1 ;參見Xiong等， 2002)和蛋白磷酸酶(Merlot 等(2001)Plant J. 25 :295-303 ；Tahtiharju 和 Palva(2001) Plant J. 26 :461-470)的信號傳導；(c)應答應力的脫落酸水平的提高，該應力引發應答的子集(Xiong等O002)上文，並在此參考)；(d)作為信號分子的肌醇磷酸酶(至少對於應力應答性轉錄改變的子集(Xiong等 (2001)Genes Dev. 15 :1971-1984)；(e)磷酸脂酶的激活，其隨後產生不同陣列的第二信使分子，其中一些可能調節應力應答性激酶的活性(ABA獨立性途徑中的磷酸脂酶D功能，Frank等O000)Plant Cell 12 :111-124 ；
(f)胚胎發育後期豐富(LEA)型基因的誘導，包括CRT/DRE應答性C0R/RD基因 (Xiong 和 ZhiK2002)上文)；(g)提高的抗氧化劑和相容性滲透調節物質如脯氨酸和可溶性糖的水平 (Hasegawa 等(2000) Annu. Rev. Plant. Mol. Plant.Physiol.51 :463-499)；禾口
(h)活性氧物質如過氧化物，過氧化氫和羥基自由基的累積(Hasegawa等Q000) 上文)。脫落酸生物合成在多個步驟受到滲透脅迫的調節。ABA-依賴性和-獨立性滲透脅迫信號首先在組成上修飾表達的轉錄因子，導致早期應答轉錄激活劑的表達，其然後激活下遊脅迫耐受性效應基因。基於冷，乾旱和鹽脅迫應答的許多特徵的共同性，可以推斷提高對冷或鹽脅迫耐受性的基因也可以提高幹旱脅迫保護。實際上，對於轉錄因子(在AtCBF/DRBl的情況中) 和其他基因如0sCDH(7(&iijo等(2000) Plant J. 23 :319-327)或AVPl (液泡焦磷酸酶-質子-泵，Gaxiola 等 Q001)Proc. Natl. Acad. ki. USA 98:11444-11449)已經證明了這種情況。產生耐脅迫植物是一種策略，其具有解決或調節這些問題中至少一些的潛能。然而，用來產生呈現出耐ABS的新植物系的傳統植物育種策略相對無效，因為它們是冗長而費時的，且結果是不可預測的。此外，用於耐脅迫的有限種質來源和關係遠的植物物種之間的雜交不相容性代表了常規育種中遇到的顯著問題。此外，導致ABS耐受性的細胞過程在性質上是複雜的並涉及細胞適應的多個機理和各種代謝途徑(4-7)。現有技術中已經描述了針對給予轉基因作物非生物脅迫耐受性的遺傳工程嘗試。Apse 禾口 Blumwald(Curr Opin Biotechnol. 13 146-150，2002)，Quesada 等(Plant Physiol. 130 :951-963,2002)，Holmstrom 等(Nature 379 :683-684,1996)，Xu 等(PlantPhysiol 110 :249-257,1996)， Pilon-Smits 和 Ebskamp(Plant Physiol 107:125-130， 1995)和Tarczynski等(Science 259 =508-510,1993)的研究都嘗試了產生耐脅迫植物。此外，幾個U. S.專利和專利申請還描述了與耐脅迫相關的多核苷酸及其在產生耐脅迫植物中的用途。U.S.專利No. 5，296，462和5，356，816描述了用編碼擬南芥 (Arabidopsis thaliana)冷適應中涉及的蛋白質的多核苷酸轉化植物，因此促進轉化植物中的耐冷性。U. S.專利No. 6，670，528描述了用編碼結合脅迫應答性序列的多肽的多核苷酸轉化植物，因此促進轉化的植物對非生物脅迫的耐受性。U. S.專利No. 6，720，477描述了用編碼信號轉導脅迫相關蛋白的多核苷酸轉化植物，能夠提高轉化的植物對非生物脅迫的耐受性。U. S.申請系列No. 09/938842和10/3422 描述了非生物脅迫相關的基因及其給予植物對非生物脅迫耐受性的用途。U. S.申請系列No. 10/231035描述了植物中鉬輔因子硫化酶的超表達，因此提高它們對非生物脅迫的耐受性。儘管上述研究在產生耐脅迫植物中至少部分是成功的，但仍然需要可以用來產生耐各種非生物脅迫條件的植物的耐脅迫基因。同時簡化本發明來實踐，本發明人已經通過生物信息和實驗室研究鑑定了幾個新的非生物脅迫耐受性基因，其可以用來提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或生物量，活
力和產量。

發明內容
根據本發明的一個方面，提供了提高植物對非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法包括在植物內表達編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQ ID NO =2,4,6,8,10,12, 13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90%同源的胺基酸序列，因此提高植物對非生物脅迫的耐受性。根據所述優選實施方案中的再一特徵，非生物脅迫選自鹽度，缺水，低溫，高溫，重金屬毒性，缺氧，營養不足，營養過剩，大氣汙染和UV照射。根據本發明的另一個方面，提供了提高植物生物量，活力和/或產量的方法，所述方法包括在植物內表達編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQ ID NO =2,4,6,8,10, 12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90%同源的胺基酸序列，因此提高植物的生
物量，活力和/或產量。根據所述優選實施方案中的再一特徵，通過以下來實現表達(a)用外源多核苷酸轉化植物的細胞；(b)從細胞產生成熟植物；和(c)在適於在成熟植物內表達外源多核苷酸的條件下栽培成熟植物。根據所述優選實施方案中的再一特徵，通過將核酸構建體引入植物細胞中來實現轉化，核酸構建體包括外源多核苷酸和至少一個能夠指導外源多核苷酸在植物細胞中轉錄的啟動子。根據本發明的再一方面，提供了核酸構建體，其包括與選自SEQ IDNO =1,3,5,7,9,
611，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287的核苷酸序列至少90%相同的核酸序列
和能夠指導核酸序列在宿主細胞中轉錄的啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，啟動子是組成型啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，組成型啟動子是CaMV 35S啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，組成型啟動子是At6669啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，啟動子是誘導型啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，誘導型啟動子是非生物脅迫可誘導啟動子。根據所述優選實施方案中的再一特徵，宿主細胞是植物細胞。根據所述優選實施方案中的再一特徵，植物細胞形成雙子葉植物細胞的一部分。根據所述優選實施方案中的再一特徵，植物細胞形成單子葉植物細胞的一部分。根據本發明的再一方面，提供了分離的多肽，其包括與由選自SEQID NO =1,3,5, 7,9,11，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287 的多核苷酸編碼的胺基酸序列至少 90%同源的胺基酸序列。根據所述優選實施方案的再一特徵，胺基酸序列與SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12， 13-56，58-63，66-121，141-156 或 157 至少 90% 同源。根據本發明的其他方面，提供了包括編碼多肽的外源多核苷酸的植物細胞，該多肽具有與 SEQ ID NO :2,4,6,8,10，12，13-56，58-63，66-121，141-156 或 157 至少 90% 同源的胺基酸序列，因此提高植物對非生物脅迫的耐受性。根據所述優選實施方案的再一特徵，植物細胞形成植物的一部分。通過提供利用新的耐非生物脅迫基因來提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或生物量的方法，本發明成功地解決了目前已知構造的缺點。除非另外限定，在此使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同意思。儘管與在此所述的那些相似或等價的方法和材料可以用於本發明的實踐或測試中，但以下描述了合適的方法和材料。在衝突的情況中，以專利說明書，包括定義為準。此外，材料，方法和實施例只是說明性的並不是用來限制。


在此參照

了本發明，但只是舉例來說。現在詳細地參照附圖，其強調了所示的特定內容是舉例說明並只是用於本發明優選實施方案的說明性討論的目的，並且是為了提供認為是本發明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述而呈現的。在這點上， 沒有進行嘗試來顯示比本發明基礎性理解更詳細的本發明的結構細節，對附圖進行的描述使本領域技術人員更清楚本發明的幾個形式在實踐中怎樣具體進行。圖1是用來測量植物大小的方法簡圖。使用均勻的光照度和設定恆定距離的三腳架來拍取數碼照片。使用「基於綠色的」濾器處理獲得的數碼照片，該濾器除去照片的「非綠色部分」，只留下用於定量的植物玫瑰花結區域。玫瑰花結區域定量後，將結果輸出至表格處理軟體並使用統計軟體來分析。圖2A-B是給予非生物脅迫耐受性基因(SEQ ID 158)的代表性結果，該耐受性是根據本發明的教導未揭示的。圖2A-將在非脅迫條件下生長7-10天的植物轉移至高滲壓劑條件並使用數碼成像追蹤它們的生長12天。顯示了在第0天，第5天和第12天拍取的照片的處理過的圖像。注意每個平板上部中心中的對照植物和對照植物周圍的獨立轉基因情況。圖2B是描述了隨時間函數的植物生長面積的圖，使用圖A中所示的圖像。所示五個情況中的四個在相同條件下比野生型對照植物顯著生長得快。結果的統計學分析顯示於以下的表5中1-5行。
具體實施例方式本發明是通過利用新的非生物脅迫耐受性基因提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或生物量的方法以及呈現出提高的耐脅迫條件和/或提高的累積生物量能力的植物。參照附圖和附帶的描述可以更好地理解本發明的原理和操作。在詳細地解釋本發明的至少一個實施方案之前，理解本發明不限於對以下描述中列出的或附圖中說明的構建體和成分排列的詳細內容的應用。本發明能夠是其他實施方案或以各種方式實施或進行。此外，理解在此所用的措辭和術語是用於描述的目的並且不應當認為是限制。同時簡化本發明來實踐，本發明人同時使用生物信息技術，鑑定了編碼推定的非生物脅迫耐受性(ABST)蛋白的多核苷酸序列(實施例1)。分離選定的序列(實施例2)， 克隆至表達載體中(實施例3-4)並引入擬南芥植物中(實施例5-6)。將這些植物生長於鹽度脅迫條件下，或正常條件下，並檢測與沒有攜帶外源ABST基因的相似對照植物相比較提高的生物量。如從實施例8中所示的結果可明顯看出的，根據本發明的教導選擇的核酸序列顯示出與對照植物相比較能提高用其轉染的轉基因植物對非生物脅迫的耐受性。因此，根據本發明的一個方面，提供了提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或植物生物量的方法。該方法包括在植物內表達編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90%同源的胺基酸序列。根據本發明這方面的一個優選實施方案，所示的分離多核苷酸是SEQ ID NO :1，3， 5,7,9,11，158，159，160，161，162-204，206-211，214-287。或者，本發明的外源多核苷酸編碼具有如下進一步所述的胺基酸序列的多肽。與選自 SEQ ID NO :2,4,6,8,10，12，13-56，58-63，66-121，141-156 或 157 的胺基酸序列至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約81%，至少約82%，至少約83%，至少約84%， 至少約85%，至少約86%，至少約87%，至少約88%，至少約89%，至少約90%，至少約 91%,至少約92%，至少約93%，至少約93%，至少約94%，至少約95%，至少約96%，至少約97%，至少約98%，至少約99%，或更高即100%同源。在此所用的短語「非生物脅迫」指的是對植物的代謝，生長，再生和/或生活力的任何不利影響。因此，可以通過次佳環境生長條件，例如，鹽度，缺水，洪水，冷凍，低或高溫， 重金屬毒性，缺氧，營養不足，大氣汙染或UV照射，來誘導非生物脅迫。在背景部分中討論了非生物脅迫的意義。如在此所用的短語「非生物脅迫耐受性」指的是植物承受非生物脅迫而代謝，生長，生產力和/或生活力沒有遭受實質性改變的能力。優選，本發明的遺傳工程化植物呈現出比非轉基因植物至少高約2%，高5%，高10%，高20%，高30%，高40%，高50%，高 60 %，高70 %，高80 %，高90 %或甚至更高的耐受性。
如在此所用的，術語「外源多核苷酸」指的是不是在植物內天然表達的但以穩定或瞬時的方式引入植物中時產生至少一個多肽產物的核酸序列。可以使用任何同源性比較軟體測定同源性(例如，百分比同源性)，軟體包括例如國立生物技術信息中心(NCBI)的BlastP軟體，如使用預設參數。可以使用任何同源性比較軟體測定同一性(例如，百分比同源性)，軟體包括例如國立生物技術信息中心(NCBI)的BlastP軟體，如使用預設參數。本發明的多核苷酸指的是分離的單鏈或雙鏈核酸序列，並以RNA序列，互補多核苷酸序列(cDNA)，基因組多核苷酸序列和/或複合的多核苷酸序列(例如，以上的組合)的形式提供。如在此所用的，短語「互補多核苷酸序列」指的是使用逆轉錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶從信使RNA的逆轉錄產生的序列。隨後可以使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內或在體外擴增這樣序列。如在此所用的，短語「基因組多核苷酸序列」指的是源自(分離自)染色體的序列， 並因此表示染色體的鄰接部分。如在此所用的，短語「複合的多核苷酸序列」指的是至少部分互補和至少部分基因組的序列。複合序列可以包括編碼本發明的多肽需要的一些外顯子序列，以及插入其中的一些內含子序列。內含子序列可以是任何來源的，包括其他基因，通常將包括保守的剪接信號序列。這樣的內含子序列可以進一步包括順式作用的表達調控序列。可以將本發明多核苷酸的核酸序列最佳化來用於表達。在SEQ IDNO :158，159，160 和161中提供了這樣的最佳化序列。這樣序列修飾的實例包括，但不限於，改變G/C含量至更接近目標植物物種中通常發現的，和除去通常在植物物種中發現的密碼子，通常稱為密碼子最佳化。短語「密碼子最佳化」指的是選擇合適的DNA核苷酸用於接近目標植物內密碼子使用的結構基因或其片段內。因此，最佳化的基因或核酸序列指的是為了利用植物內統計學上優選或統計學上偏好的密碼子已經將其中天然或天然產生的基因的核苷酸序列進行了修飾的基因。通常在DNA水平檢測核苷酸序列並使用合適的方法測定植物物種中為了表達最佳化的編碼片段，這些方法如Sardana等(1996，Plant Cell Reports 15 :677-681)中所述的。在該方法中，可以計算密碼子使用的標準偏差，密碼子偏好的一種測量，首先發現天然基因每個密碼子的使用相對於高表達的植物基因的比例方差，接著計算均方差。所用的公式是1 SD⑶=η = IN[ OCn-Yn) Λη]2/Ν，其中fti指的是高表達植物基因中的密碼子使用頻率n，其中指的是目標基因中的密碼子使用頻率n，N指的是目標基因中的密碼子總數。使用Murray等的數據(1989，Nuc Acid Res. 17 :477-498)編輯了雙子葉植物的高表達基因的密碼子使用表。根據特定植物細胞類型的優選密碼子使用最佳化核酸序列的一種方法是基於密碼子最佳化表的直接使用，沒有進行任何額外的統計學計算，密碼子最佳化表如通過日本的NIAS (農業生物科學研究所)DNA庫在密碼子使用資料庫在線提供的那些(http://WWW. kazusa. or. jp/condon/)。密碼子使用資料庫含有用於各種不同物種的密碼子使用表，已經基於Genbank中呈現的資料庫在統計學上測定了每個密碼子使用表。使用以上的表來測定特定物種(例如，水稻)中每個胺基酸的最優選或最偏好的密碼子，編碼目標蛋白的天然產生的核苷酸序列對於該特定植物物種是密碼子最佳化的。 用關於胺基酸在統計學上更偏好的相應密碼子替代特定物種基因組中具有低統計學發生率的密碼子來實現這。然而，可以選擇一個或多個不太偏好的密碼子來刪除現有的限制位點，以在潛在有用的連接處形成新的限制位點(5』和3』端至添加信號肽或終止盒，可以用來切割或剪接片段來產生正確的全長序列的內部位點)，或消除負面影響mRNA穩定性或表達的核苷酸序列。在任何修飾之前，天然產生的編碼核苷酸序列可能已經含有多個對應於特定植物物種中統計學上偏好的密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子最佳化可以包括測定天然核苷酸序列內哪個密碼子對於特定的植物不是統計學上偏好的，並根據特定植物的密碼子使用表改變這些密碼子來產生密碼子最佳化的衍生物。改變的核苷酸序列對於植物密碼子使用可以是全部或部分最佳化的，只要以高於相應天然產生的或天然的基因編碼的蛋白質的水平產生由改變的核苷酸序列編碼的蛋白質。通過改變密碼子使用構建合成基因描述於例如PCT專利申請93/07278中。因此，本發明包括以上所述的核酸序列；其片段，與其雜交的序列，與其同源的序列，編碼具有不同密碼子使用的相似多肽的序列，特徵在於突變的改變序列，突變如一個或多個核苷酸的刪除，插入或置換，天然產生的或人工誘導的，隨機或以有目標的方式。上述的多核苷酸還編碼之前未表徵過的多肽。因此，本發明提供了具有如下進一步所述的胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與選自 SEQ ID NO :2,4,6,8,10，12，13-56，58-63，66-121，141-156 或 157 的胺基酸序列至少約70 %，至少約75 %，至少約80 %，至少約81 %，至少約82 %，至少約83 %，至少約84 %， 至少約85%，至少約86%，至少約87%，至少約88%，至少約89%，至少約90%，至少約 91%,至少約92%，至少約93%，至少約93%，至少約94%，至少約95%，至少約96%，至少約97 %，至少約98 %，至少約99 %，或更高即100 %同源。本發明還包括上述多肽和具有突變的多肽的片段，突變如一個或多個胺基酸的刪除，插入或置換，天然產生的或人工誘導的，隨機或以有目標的方式。使用本發明方法的合適植物可以是任何單子葉或雙子葉植物，包括但不限於， 玉米，小麥，大麥，黑麥，燕麥，水稻，大豆，花生，豌豆，扁豆和苜蓿，棉花，油菜，雙低油菜 (canola)，胡椒，向日葵，土豆，菸草，番茄，茄子，桉樹，喬木，觀賞植物，多年生禾草和飼料作物。可以通過用外源多核苷酸轉化一個或多個植物細胞，接著從轉化的細胞產生成熟的植物並在適於在成熟植物內表達外源多核苷酸的條件下栽培成熟植物來實現在植物內表達本發明的外源多核苷酸。優選，通過將核酸構建體引入植物細胞中來實現轉化，該構建體包括本發明的外源多核苷酸和至少一個能夠指導外源多核苷酸在植物細胞中轉錄的啟動子。下文中提供了合適的轉化方法的更詳細內容。如在此所用的，術語「啟動子」指的是位於基因轉錄啟動位點上遊的DNA片段，RNA 聚合酶結合該轉錄啟動位點來啟動RNA的轉錄。啟動子控制在哪裡(例如，植物的哪個部分，動物內的哪個器官等)和/或在什麼時候(例如，生物體生命周期中的哪個階段或條件)來表達基因。
可以通過本發明的核酸構建體來使用任何合適的啟動子序列。優選，啟動子是組成型啟動子，組織特異性的，或非生物脅迫-可誘導的啟動子。合適的組成型啟動子包括，例如，CaMV 35S啟動子(SEQ ID NO 122 ；Odell 等，Nature 313 :810-812,1985)；擬南芥 At6669 啟動子(SEQID NO :123 ；專利 No W02004/104162)；玉米 W^i 1 (Christensen 等，Plant Sol. Biol. 18 :675-689,1992)；水稻肌動蛋白(McElroy 等，Plant Cell 2 :163-171,1990) ；pRMU(Last 等，Theor. Appl. Genet. 81 :581-588,1991)；和 Synthetic Super MAS(Ni 等，The Plant Journal 7 661-76,1995)。其它組成型啟動子包括 U. S.專利 No. 5，659，026，5，608，149 ；5, 608, 144 ； 5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ；5，268，463 ；和 5，608，142。合適的組織特異性啟動子包括，但不限於，葉子特異性啟動子，如例如以下所述的，Yamamoto 等，Plant J. 12 :255-265,1997 ；Kwon 等，Plant Physiol. 105 :357-67,1994 ； Yamamoto 等，Plant Cell Physiol. 35 :773-778,1994 ；Gotor 等，Plant J. 3 :509-18,1993 ； Orozco 等，Plant Mol. Biol. 23 :1129-1138,1993 ；和 Matsuoka 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :9586-9590,1993。合適的非生物脅迫可誘導啟動子包括，但不限於，鹽可誘導的啟動子，如 RD29A(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331-340,1993)；乾旱可誘導啟動子，如玉米 rabl7 基因啟動子(Pla 等，Plant Mol. Biol. 21 :259-266,1993)，玉米 rab28 基因啟動子(Busk 等，Plant J. 11 :1285-1295,1999)；和玉米 Ivr2 基因啟動子(Pelleschi 等，Plant Mol. Biol. 39 =373-380,1999)；和熱可誘導的啟動子，如來自番茄的熱番茄 hsp80-啟動子(U. S.專利 No. 5，187，267)。本發明的核酸構建體優選進一步包括合適的選擇標記和/或複製起點。優選，所用的核酸構建體是穿梭載體，其可以在大腸桿菌(E. coli)(其中構建體包括合適的選擇標記和複製起點)中繁殖，並與細胞中的繁殖相容。根據本發明的構建體可以是，例如，質粒， bacmid,噬粒，粘粒，噬菌體，病毒或人造染色體。可以使用本發明的核酸構建體來穩定或瞬時轉化植物細胞。在穩定轉化中，將本發明的外源多核苷酸整合至植物基因組中，因此表示穩定且遺傳的特徵。在瞬時轉化中，通過轉化的細胞表達外源多核苷酸，但是沒有整合至基因組中，因此表示瞬時的特徵。存在多種將外源基因引入單子葉和雙子葉植物中的方法(Potrykus，I.， Annu. Rev. Plant. Physiol. ， Plant. Mol. Biol. (1991)42 :205-225 ；Shimamoto 等， Nature(1989)338 :274-276)。使外源DNA穩定整合至植物基因組DNA中的原理方法包括兩個主要的手段⑴農桿菌(Agrobacterium)介導的基因轉移:Klee 等(1987)Annu. Rev. Plant. Physiol. 38 :467-486 ；Klee 禾口 Rogers,在 Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plant(植物的細胞培養和體細胞遺傳學)，Vol. 6，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes (植物核基因的分子生物學)，編輯 khell，J.，和 Vasil，L. K.，Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)p. 2-25 ；Gatenby，在 Plant Biotechnology (植物生物技術)，編輯 Kung, S.禾口 Arntzen, C. J. , Butterworth Publishers, Boston, Mass (1989) p. 93-112。(ii)直接 DNA 吸收Paszkowski 等，在 Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants (植物的細胞培養和體細胞遺傳學)，Vol. 6，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes (植物核基因的分子生物學)，編輯khell，J.，和Vasil，L. K.， Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)p. 52-68 ；包括 DNA 直接吸收至原生質體中的方法，Toriyama，K.等(1988)Bio/technology 6:1072-1074。通過植物細胞的簡短電轟擊誘導的 DNA 吸收Zhang 等，Plant Cell Rep. (1988)7:739-384。Fromm 等， Nature (1986) 319 :791_793。通過顆粒轟擊將DNA注射至植物細胞或組織中，Klein等，Bio/ Technology (1988) 6 :559-563 ；McCade 等，Bio/Technology (1988) 6 :923-926 ；Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79 :206-209 ；使用微量吸移管系統:Neuhaus 等，Theor. Appl. Genet. (1987)75 :30-36 ；Neuhaus 禾口 Spangenberg，Physiol. Plant. (1990)79 :213-217 ；細胞培養物，胚胎或愈傷組織的玻璃纖維或碳化矽晶須轉化，U. S.專利No. 5464765或用發芽的花粉直接孵育 DNA，DeWet 等，在 Experimental Manipulation of Ovule Tissue (胚珠組織的實驗操作)，編輯 Chapman, G. P.和 Mantell，S. H.和 Daniels，W. Longman, London (1985) p. 197-209 ；和 Ohta，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83 :715_719。農桿菌系統包括使用質粒載體，該載體含有整合至植物基因組DNA中的限定DNA 片段。接種植物組織的方法根據植物物種和農桿菌傳送系統而不同。廣泛使用的方法是葉圓盤方法，可以使用提供啟動整個植物分化良好來源的任何組織外植體來進行該方法。 Horsch 等，在 Plant Molecular Biology Manual A5 (植物分子生物學手冊似)，Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9。補充方法使用農桿菌傳送系統結合真空侵入。農桿菌系統在轉基因雙子葉植物的形成中特別可行。存在多種將DNA直接轉移至植物細胞中的方法。在電穿孔中，將原生質體簡短暴露於強烈的電場。在微注射中，使用非常小的微量吸移管將DNA直接機械注射至細胞中。在微粒轟擊中，將DNA吸收在微粒上，如硫酸鎂晶體或鎢顆粒，並將微粒在物理上加速至細胞或植物組織中。穩定轉染後，實施植物繁殖。植物繁殖的最常見方法是通過播種。然而，通過種子繁殖的再生具有由於雜合性引起的缺陷，作物缺少均一性，因為種子是由根據孟德爾規律控制的遺傳方差的植物產生的。基本上，每個種子在遺傳上是不同的，並且每個將具有其自身特定的性狀而生長。因此，優選可以產生轉化的植物，使得再生的植物具有相同的性狀和親本轉基因植物的特徵。因此，優選可以通過提供轉化植物快速，一致再生的微繁殖來再生轉化的植物。微繁殖是從已經從選定的親本植物或栽培植物切除的單片組織生長新一代植物的過程。該過程允許具有表達融合蛋白的優選組織的植物大量繁殖。產生的新一代植物在遺傳上與最初的植物相同，並具有最初植物的全部特徵。微繁殖允許優質植物材料在短期內大量產生並使選定的栽培植物快速繁殖並保持最初轉基因或轉化植物的特徵。克隆植物的優勢是植物繁殖的速度以及所產生的植物的質量和均一性。微繁殖是需要在階段中間改變培養基或生長條件的多步驟方法。因此，微繁殖方法涉及四個基本的階段階段一，最初的組織培養；階段二，組織培養繁殖；階段三，分化和植物形成；和階段四，溫室培養和加固。在階段一的過程中，最初的組織培養，建立組織培養並證實是無汙染的。在階段二的過程中，繁殖最初的組織培養直至產生足量的組織樣品來滿足生產目的。在階段三的過程中，分裂在階段二中生長的組織樣品並生長成單個的植物幼苗。在階段四，將轉化的植物幼苗轉移至用於固化的溫室，在那裡逐漸提高植物對光的耐受性，使得可以將其生長於自然環境中。優選，進一步選擇如上所述產生的成熟轉化植物的非生物脅迫耐受性。因此，將轉化和非轉化的(野生型)植物暴露於非生物脅迫條件，如缺水，次佳溫度，營養不足，或優選鹽脅迫條件。可以以各種方式來實現鹽脅迫，如例如，用高滲溶液灌溉植物，在高滲生長溶液(例如，Hoagland溶液)中通過水栽來栽培植物，或在高滲生長培養基(例如，MS培養基) 中培養植物。因為不同的植物對鹽度的耐受性非常不同，因此優選根據特定植物栽培品種或變種的特定特徵來調節灌溉水，生長溶液或生常培養基中的鹽濃度，使得對植物的生理和/或形態產生溫和或適度的影響(關於合適濃度的指導請參見，Bernstein和Kafkafi， Root Growth Under Salinity Stress (鹽度脅迫下的根部生長)，在Plants Roots, The Hidden Half (植物根部，隱藏的一半)，第 3 版，Waisel Y, Eshel A 和 Kafkafi U(編輯)， Marcel Dekker Inc. ,New ^rk，2002，和其中的參考文獻)。暴露於脅迫條件後，經常監控植物直至野生型植物中出現實質性的生理和/或形態影響。隨後，將沒有呈現出實質性生理和/或形態影響的轉化植物或呈現出生物量高於野生型植物的轉化植物鑑定為非生物脅迫耐受性植物。儘管目前優選穩定的轉化，但本發明也設想了葉細胞，分生細胞或完整植物的瞬時轉化。可以通過上述的任一種直接DNA轉移方法或使用修飾的植物病毒的病毒感染來實現瞬時轉化。已經顯示出對植物宿主的轉化有用的病毒包括CaMV，TMV和BV。使用植物病毒的植物轉化描述於U. S.專利No. 4，855，237 (BGV)，EP-A67, 553 (TMV)，日本公開申請 No. 63-14693 (TMV)，EPA194, 809 (BV)，EPA278, 667 (BV)；禾口 Gluzman, Y.等，Communication in Molecular Biology =Viral Vectors (分子生物學中的信息傳遞病毒載體)，Cold Spring Harbor Laboratory, New York，pp. 172-189 (1988)。用於在許多宿主包括植物中表達外源DNA的假病毒描述於W087/06261中。優選，本發明的病毒是無毒力的，因此不會引起嚴重的症狀，如降低的生長率，花葉病，環斑病，卷葉病，黃化病，條紋病，形成痘，形成腫瘤和斑點狀腐蝕。合適的無毒力病毒可以是天然產生的無毒力病毒或人造的減毒病毒。可以使用本領域公知的方法來實現病毒減毒，包括但不限於，亞致死的熱處理，化學處理或定向誘變技術，如所述的，例如， Kurihara禾口 Watanabe (Molecular Plant Pathology 4 :259_269，2003)，Gal—on 等(1992)， Atreya 等(1992)和 Huet 等(1994)。可以從可用的來源如例如美國典型培養物中心(ATCC)或從感染的植物分離來獲得合適的病毒株。可以通過本領域公知的技術實現從感染的植物組織分離病毒，如所述的，例如 Foster 禾P Tatlor 編輯,「Plant Virology Protocols :From Virus Isolation to Transgenic Resistance (植物病毒學實驗方案從病毒分離至轉基因抗性)(Methods in Molecular Biology (Humana Pr) ,Vol 81) ",Humana Press，1998。簡而言之，認為受感染植物的組織含有高濃度的合適病毒，優選幼葉和花瓣，在緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝溶液) 中研磨來產生病毒感染的漿液，其可以用於隨後的接種中。通過上述參考文獻以及Dawson，W. 0.等，Virology (1989) 172 :285-292 ；Takamatsu 等，EMBO J. (1987)6 :307-311 ；French 等，Science (1986) 231 :1294-1297 ；和 Takamatsu等，FEBS Letters (1990) 269 :73-76證明了用於植物中引入和表達非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的構建。當病毒是DNA病毒時，可以對病毒自身進行合適的修飾。或者，首先將病毒克隆至細菌質粒中，為了易於使用外源DNA構建所需的病毒載體。然後從質粒切除病毒。如果病毒是DNA病毒，可以將細菌複製起點連接病毒DNA，然後通過細菌來複製。該DNA的轉錄和翻譯將產生外殼蛋白，其將包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，通常將病毒克隆為cDNA並插入質粒中。然後使用質粒來製備所有的構建。然後通過轉錄質粒的病毒序列來產生RNA 病毒，並且病毒基因的翻譯產生包裹病毒RNA的外殼蛋白。通過以上的參考文獻以及U. S.專利No. 5，316，931證明了用於植物中引入和表達非病毒外源多核苷酸序列如本發明構建體中包括的那些的植物RNA病毒的構建。在一個實施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已經從病毒多核苷酸刪除了天然外殼蛋白編碼序列，插入了非天然植物病毒外殼序列和非天然啟動子，優選非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因啟動子，能夠在植物宿主中表達，包裝重組植物病毒多核苷酸，並確保通過重組植物病毒多核苷酸的宿主系統感染。或者，可以通過在其內插入非天然多核苷酸序列使外殼蛋白基因失活，使得產生蛋白。重組植物病毒多核苷酸可以含有一個或多個其他的非天然亞基因啟動子。每個非天然亞基因啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰接的基因或多核苷酸序列，並且不能相互重組或與天然亞基因啟動子重組。如果包括多於一個的多核苷酸序列，可以鄰接天然植物病毒亞基因啟動子或天然和非天然植物病毒亞基因啟動子插入非天然(外源)多核苷酸序列。非天然多核苷酸序列在亞基因啟動子的控制下可以在宿主植物中得到轉錄或表達以產生所需的產物。在第二個實施方案中，和第一個實施方案一樣提供了重組植物病毒多核苷酸，除了鄰接非天然外殼蛋白亞基因啟動子放置天然外殼蛋白編碼序列，替代了非天然外殼蛋白編碼序列。在第三個實施方案中，提供了重組植物病毒多核苷酸，其中天然外殼蛋白基因鄰接其亞基因啟動子，並且已經將一個或多個非天然亞基因啟動子插入病毒多核苷酸中。插入的非天然亞基因啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰接的基因，並且不能相互重組或與天然亞基因啟動子重組。可以鄰接非天然亞基因植物病毒啟動子插入非天然多核苷酸序列，使得序列在亞基因啟動子的控制下在宿主植物中得到轉錄或表達來產生所需的產物。在第四個實施方案中，和第三個實施方案一樣提供了重組植物病毒多核苷酸，除了由非天然外殼蛋白編碼序列替代天然的外殼蛋白編碼序列。通過由重組植物病毒多核苷酸編碼的外殼蛋白包裹病毒載體，來產生重組植物病毒。使用重組植物病毒多核苷酸或重組植物病毒來感染合適的訴諸植物。重組植物病毒多核苷酸能夠在宿主中複製，在宿主中全身傳播，並在宿主中轉錄或表達外源基因(外源多核苷酸)，來產生所需的蛋白。將病毒接種於植物的技術可以在以下找到，！^ster和I^atlor編輯，「Plant Virology Protocols :From Virus Isolation to Transgenic Resistance (植物病毒學實驗方案從病毒分離至轉基因抗性)(Methods in Molecular Biology (Humana Pr)，Vol 81)，，,Humana Press, 1998 ;Maramorosh 禾口 Koprowski 編輯，「Methods in Virology，，(病毒學中的方法)，7vol，Academic Press,New York 1967-1984 ；Hill, S. A. "Methods in Plant Virology"(植物病毒學中的方法)，Blackwell, Oxford, 1984 ；ffalkey, D. G. A. "Applied Plant Virology」(應用植物病毒學)，Wiley，New York，1985 ；以及 Kado 和 Agrawa 編輯，"Principles and Techniques in Plant Virology」(植物病毒學中的原理和技術)， VanNostrand-Reinhold, New York。除了以上的，也可以將本發明的多核苷酸引入葉綠體基因組中，因此能夠葉綠體表達。將外源多核苷酸序列引入葉綠體的基因組的技術是已知的。該技術涉及以下的程序。首先，將植物細胞化學處理，使得將每個細胞的葉綠體數目降低至約一個。然後，通過顆粒轟擊將外源多核苷酸引入細胞中，目的在於將至少一個外源多核苷酸分子引入葉綠體中。選擇外源多核苷酸使其通過同源重組可整合至葉綠體的基因組中，這可以通過葉綠體內在的酶容易地實現。為此，除了目標基因，外源多核苷酸包括至少一個源自葉綠體基因組的多核苷酸片段。此外，外源多核苷酸包括選擇標記，其通過連續的選擇程序來起作用，以確定所有或基本上所有的葉綠體基因組拷貝在這樣的選擇後將包括外源多核苷酸。關於該技術的更多詳細內容在U. S.專利No. 4，945，050 ；和5，693，507中找到，在此將其引入作為參考。因此，可以通過葉綠體的蛋白表達系統來產生多肽，並變得整合至葉綠體內膜中。因為植物中的非生物脅迫耐受性可以涉及多個累積或協同作用的基因(參見，例如，在Quesda等，Plant Physiol. 130 :951_063，2002)，本發明還設想在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸，因此獲得優良的非生物脅迫耐受性。可以通過將多個核酸構建體共同引入單個植物細胞中來實現在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸，每個構建體包括不同的外源多核苷酸。然後可以使用上文中所述的方法將轉化的細胞再生成成熟植物。或者，可以將包括多個不同外源多核苷酸的單個核酸構建體共同引入單個植物細胞中來實現在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸。可以用單個啟動子序列來設計這樣的構建體，該啟動子序列可以轉錄多順反子信息，包括所有不同的外源多核苷酸序列。為了使由多順反子信息編碼的不同多肽能夠共同翻譯，可以通過內部核糖體進入位點(IRES) 序列內部連接多核苷酸序列，該內部核糖體進入位點促進置於IRES序列下遊的多核苷酸序列的翻譯。在這種情況中，上述編碼不同多肽的轉錄的多順反子RNA分子將從多順反子 RNA分子的加帽5』端和兩個內部IRES序列開始翻譯，因此在細胞內產生所有不同的多肽。 或者，構建體可以包括幾個啟動子序列，每個連接不同的外源多核苷酸序列。用包括多個不同外源多核苷酸的構建體轉化的植物細胞可以再生成成熟植物，使用上文中所述的方法。或者，可以通過將包括不同外源多核苷酸的不同核酸構建體引入多個植物中來實現在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸。然後使用常規植物育種技術，將再生的轉化植物雜交，並選擇所得到後代的優良非生物脅迫耐受性和/或生物量性狀。因此，本申請提供了以安全且成本效率的方式使用新的非生物脅迫耐受性基因來提高各種經濟植物對非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法。使植物接受各種環境挑戰。這些中的幾種，包括鹽脅迫，一般的滲透脅迫，乾旱脅迫和冷凍脅迫，具有影響整個植物和細胞水可用性的能力。因而沒有出人意料，植物對這組
15脅迫的應答是相關的。在最近的綜述中，Zhu注意到「對水脅迫信號的大部分研究聚焦於鹽脅迫，主要是因為植物對鹽和乾旱的應答是密切相關的並且是機制重疊的」(ZhiK2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53 :247-273)。已經證明了對該組脅迫的相似應答和途徑的許多實例。例如，已經表明CBF轉錄因子能調節對鹽，冷凍和乾旱的抵抗力(Kasuga等(1999) Nature Biotech. 17 :287-291)。應答鹽和脫水脅迫誘導了擬南芥rd29B基因，這是很大程度上通過ABA信號轉導過程介導的過程(Uno等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11632-11637)，導致結合!·業98啟動子內上遊序列的轉錄因子的活性改變。在冰葉日中花 (Mesembryanthemum crystallinum) ( ^Kit)中，Patharker 禾口 Cushman Bln^:BJfflii^M 於乾旱和鹽脅迫誘導了鈣依賴性蛋白激酶(McCDHQ) (Patharker和CushmanQ000)Plant J. 24 :679-691) 0脅迫誘導的激酶還顯示出磷酸化轉錄因子，大概改變了其活性，儘管目標轉錄因子應答鹽或乾旱脅迫的轉錄水平沒有改變。相似地，Saijo等證明了水稻鹽/乾旱誘導的鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(0sCDH(7)在超表達時給予了水稻提高的鹽和乾旱耐受性(Saijo 等(2000)Plant J. 23 :319-327)。暴露於脫水在植物中引起了相似的存活策略，冷凍脅迫也是如此(參見，例如， Yelenosky (1989)Plant Physiol 89 :444-451)，並且乾旱脅迫誘導了冷凍耐受性(參見， 例如，Siminovitch 等(1982)Plant Physiol 69 :250-255 ；和 Guy 等(1992)Planta 188 265-270)。除了冷適應性蛋白的誘導，允許植物在低水條件下存活的策略包括，例如，降低的表面積，或表面油或蠟產生。將認識到對一種脅迫的抵抗力中涉及的一些途徑(如上所述)，也將涉及對其他脅迫的抵抗力，受到相同或同源基因的調控。當然，全部的抵抗途徑是相關的，不是相同的， 因此不是所有控制對一種脅迫的抵抗力的基因將控制對其他脅迫的抵抗力。儘管如此，如果基因調節對這些脅迫之一的抵抗力，本領域技術人員將清楚測試對這些相關脅迫的抵抗力。以下的實施例部分進一步提供了測定脅迫抵抗力的方法。本發明的多核苷酸序列能夠提高植物的生物量。將認識到本發明的多肽提高植物產量/生物量/活力的能力是它們促進植物細胞大小提高的能力固有的(如實施例8和圖 2中所示的)。因此，本發明還設想提高植物生物量/活力/產量的方法(松柏類植物，苔蘚， 藻類，單子葉植物或雙子葉植物，以及http//www. nationmaster. com/encyclopedia/ Plantae中所列的其他植物)。如在此所用的，短語「植物生物量」指的是從生長季節中植物產生的組織量或質量，其還可以決定或影響植物產量或每生長面積的產量。如在此所用的，短語「植物活力」指的是從給定時間的植物產生的組織量或質量。 因此，提高活力將決定或影響植物產量或每生長時間或生長面積的產量。如在此所用的，短語「植物產量」指的是作為植物產生的產物產生和收集的組織量或質量。因此，提高產量將影響從特定生長區域和/或特定生長時間的植物獲得的經濟效益。優選，本發明的遺傳工程植物呈現出比非轉基因植物至少約高2 %，高5 %，高 10%，高20%，高30%，高40%，高50%，高60%，高70%，高80%，高90%或甚至更高的生物量，活力和/或產量。
測定植物活力，產量和生物量的方法是本領域公知的(參見實施例10)。因此，本發明對於促進商業所需作物的產量是高農業價值的(例如，營養體器官如白楊木質部的生物量，或生殖器官的生物量，如種子的數量或種子生物量)。如在此所用的，術語「約」指的是士 10%。本領域技術人員在檢驗以下的非限制性實施例時將清楚本發明的其他目的，優勢和新的特徵。此外，如上所述以及如以下權利要求部分中所要求的本發明的每個實施方案和方面在以下的實施例中找到了實驗支持。實施例現在參考以下的實施例，這些實施例和以上的描述一起以非限制性的方式說明了本發明。通常，在此所用的術語和本發明中所用的實驗方法包括分子，生化，微生物和重組 DNA技術。這樣的技術在文獻中得到了徹底的解釋。參見，例如，「Molecular Cloning =A Laboratory Manual 」(分子克隆實驗室手冊)Sambrook 等(1989) ；"Current Protocols in Molecular Biology」(分子生物學中的通用實驗方案)，John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1989) ；Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning，，(分子克隆實踐指南)John Wiley & Sons，New York (1988) ；Watson 等 「Recombinant DNA"(重組 DNA), Scientific American Books, New York ;Birren 等(編輯)"Genome Analysis A Laboratory Manual kries」(基因組分析實驗室手冊系列)Vol. 1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998) ；U.S.專利 No. 4，666，828 ;4，683，202 ； 4，801，531 ;5，192，659 和 5，272，057 中所列的方法；「Cell Biology =ALaboratory Handbook」(細胞生物學實驗室手冊)，I-III 卷，Cellis, J. E.編輯(1994) ；"Current Protocols in Immunology」(免疫學中的通用實驗方案)I-III卷Coligan J. E.編輯 (1994) Jtites 等(編輯)，「Basic and Clinical Immunology」(基礎和臨床免疫學) (第 8 版)，Appleton &Lange, Norwalk, CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (編輯)，『Selected Methods in Cellular Immunology」(細胞免疫學中選擇的方法)，W. H. Freeman 和 Co. , New York(1980)；可用的免疫測試在專利和科學文獻中有大量描述，參見，例如， U. S.專利 No. 3，791，932 ；3，839，153 ；3，850，752 ；3，850，578 ；3，853，987 ；3，867，517 ； 3，879，262 ；3，901，654 ；3，935，074 ；3，984，533 ；3，996，345 ；4，034，074 ；4，098，876 ； 4，879，219 ；5，011，771 和 5，281，521 ；"Oligonucleotide Synthesis」 (寡核苷酸合成) Gait, Μ. J.編輯，(1984) ；"Nucleic Acid Hybridization」(核酸雜交)Hames，B. D.和 Higgins S. J.編輯(1984) ；"Animal Cell Culture」(動物細胞培養)Freshney，R. I.編輯(1986) ；"Immobilized Cells and Enzymes」(固定細胞和酶)IRL Press, (1986) ；"A Practical Guide to Molecular Cloning」(分子克隆實踐指南)Perbal，B. (1984)和 "Methods in Enzymology"(g|'^^^^^)Vol. 1-317,Academic Press ；"PCR Protocols A Guide To Methods And Applications」(PCR 實驗方案方法和應用指南)，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak "Strategies for Protein Purification and Characterization-Α Laboratory Course Manual」(蛋白純化和表徵的策略-實驗室過程手冊)CSHL Press (1996)；將所有的引入作為參考，如同在此全部列出一樣。在該文件中提供了其他常規的參考文獻。認為其中的方法是本領域公知的並給閱讀者提供了方便。
除非另外指出，在此所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同意思。儘管在本發明的實踐或測試中可以使用與在此所述的那些相似或等價的方法和材料，但以下描述了合適的方法和材料。實施例1鑑定來自單子葉植物的推定非生物脅迫耐受性基因按照屬於本發明專利受讓人的之前所述的W02004/104162，在體內鑑定並證實非脅迫耐受性(ABST)基因。從雙子葉植物鑑定各種ABS基因和由此編碼的多肽(各自為 SEQ ID NO.和129-133)。在單子葉植物基因組資料庫，玉米，高粱，水稻和大麥的 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)和 TIGR(http://www. tigr. org)資料庫中進行直系同源(orthologous)序列的篩選。使用LEADS 軟體(Compugen)將表達序列標籤(EST)和cDNA序列成簇和裝配，並與上述單子葉植物的TIGR(http:www. tigr. org/)資料庫進行比較。總地，372，000個玉米 EST的成簇形成41，990個簇，其中19，870個是單個的。在高粱中，約190，000個EST成簇成39，000個簇，而在大麥中，370，500個EST產生50，000個不同的簇，每個表示不同的基因。在水稻基因組資料庫中發現相似數量的序列和成簇的基因。根據包括簇的序列記錄中的所有關鍵部分編輯每個簇的數字表達特徵概述。數字表達，也稱為電子RNA印跡，是基於形成基因簇的EST序列呈現出實際表達特徵的工具。就植物解剖學(基因在哪個組織/器官中得到表達)，發育階段(可以在哪個發育階段找到基因)和處理特徵(提供在哪個生理條件下基因得到表達，如乾旱，冷，病原體感染等)而言， 該工具可以提供簇的表達特徵。假定不同簇中EST的隨機分布，數據表達提供了概率值，該概率值描述了具有總N EST至含有來自特定文庫集合的X EST的簇的概率。對於概率計算， 將考慮a)簇中的EST數量，b)涉及的和相關文庫的EST數量，c)表示物種的可獲得EST 的全部數量。因此用來自表示特定表達的目標文庫組的EST高度富集具有低概率值的簇。已經將直系同源(orthology)和旁系同源(paralogy)的概念應用於整個基因組比較規模上的功能表徵和分類。直系同源物和旁系同源物構成兩個主要類型的同源物第一個通過特化從共同的祖先演化而來，後者通過複製情況而相關。假定由老式的複製情況產生的旁系同源物很可能在功能上已經分叉了，而真實的直系同源物隨著進化的時間很可能保持相同的功能。為了進一步研究和鑑定來自單子葉植物物種的ABST假定直系同源基因，結合了兩個計算方法(i)直系同源序列比對的方法-通過構建覆蓋多個真核分類群的直系同源組，使用改進的Markov簇算法將推定的直系同源物和旁系同源物分組。將這些推定的直系同源物依據系統演化樹來進一步組織，系統演化樹是假定為基因系統發育估算的分支圖(樹)。(ii)產生基因表達特徵「數字表達」的方法-本發明人已經針對annotating序列相當多的工作。分析表達數據並使用俗語的固定詞彙如實驗處理將EST文庫分類。通過比較它們在簇中的頻率與資料庫中的豐度在統計學上分析來自所有成簇的EST對基因的注釋，允許構建該基因的數字和圖像表達特徵，將這稱為「數字表達」。使用這兩種互補方法的基本原理是基於真實的直系同源物很可能隨著進化的時間保持相同功能的假設。這兩種方法(序列和表達模式)對兩個同源基因之間的功能相似性提供了兩組不同的指示，序列水平的相似性-蛋白質結構域中相同的胺基酸和表達特徵的相似性。同時比較了來自單子葉植物的序列與番茄ABST基因，番茄基因及其來自單子葉植物的最佳直系同源基因之間的同源性水平顯著不同，為45%至88%。此外，單子葉植物基因的in Silico表達特徵通常與ABS耐受性中涉及的基因不匹配。因此，對每個番茄基因(SEQ ID NO :124-133)的單子葉植物功能直系同源物進行了廣泛的研究。嘗試鑑定番茄ABST基因的最佳直系同源物，進行了兩組分析。首先，將5個番茄 ABST基因的序歹Ij (SEQ ID NO =124-128)及其推導出的多肽序列(SEQ ID NO :129-133)與上述基因簇的DNA序列編碼的所有單子葉植物的推定蛋白相比較。在蛋白質水平上進行比較，沿著整個蛋白質序列尋找高於45%的同一性。以下的表1顯示了最佳的同源基因及其與番茄ABST蛋白的同一性水平。接著， 基於它們在幾種單子葉植物物種的發育過程中的表達模式篩選源自不同單子葉植物物種 (大麥，高粱和玉米)的這些單子葉植物蛋白。該篩選是基於基因的數字表達，如上所述。 數字表達表示包括每個in Silico基因的EST的分布以及實際分布與隨機分布的偏差。基於三個標準選擇了基因在根部具有較高表達的基因，根部和葉子和/或由表示土壤脅迫條件(乾旱，鹽度，土壤貧瘠)的處理誘導的基因。只在高於2倍的情況中認為是表達提高的(相對於隨機EST分布)，具有低於0.05顯著性概率時提高是明顯的。以下的表2概括了不同器官或組織中的基因表達特徵，以及引起表達水平顯著升高的處理。表1 番茄ABST基因及其來自單子葉植物的同源基因之間的同源性水平
權利要求
1.提高植物對非生物脅迫的耐受性、生物量、活力和/或產量的方法，所述方法包括在植物內表達編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽包含與SEQ IDNO :12、4、6、8、10、13-119、 127-131、139-154、155或SEQ ID NO :2至少80%同源的胺基酸序列，因此提高植物對非生物脅迫的耐受性、生物量、活力和/或產量。
2.權利要求1的方法，所述方法還包括在非生物脅迫下生長表達所述外源多核苷酸的植物。
3.核酸構建體，所述構建體包含核酸序列以及能夠指導所述核酸序列在宿主細胞中轉錄的啟動子，所述核酸序列編碼與SEQ ID NO :12、4、6、8、10、13-119、127-131、139-154、155 或SEQ ID NO :2具有至少80%同一性的多肽。
4.權利要求3的核酸構建體，其中所述核酸序列與選自SEQID N0:ll、3、5、7、9、 122-126、156-285和SEQ ID NO :1的核酸序列具有至少90%同一性。
5.提高植物的生物量、活力、產量或對非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法包括用權利要求3或4的核酸構建體轉化所述植物的細胞，因此提高植物的生物量、活力、產量或對非生物脅迫的耐受性。
6.權利要求5的方法，所述方法還包括從所述轉化的細胞產生成熟的植物。
7.分離的多肽，其包含與選自以下的胺基酸序列至少80%同源的胺基酸序列SEQID NO :12、4、6、8、10、13-119、127-131、139-155 和 SEQ ID NO :2。
8.植物細胞，其包含編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽包含與SEQIDN0:12、4、6、8、 10、13-119、127-131、139-154、155 或 SEQ ID NO 2 至少 80% 同源的胺基酸序列。
9.植物細胞，其包含外源多核苷酸，所述多核苷酸包含與選自SEQID N0:ll、3、5、7、9、 122-U6、156-285和SEQ ID NO :1的核酸序列至少90%同源的核酸序列。
10.權利要求3或4的核酸構建體，其中所述啟動子是組成型啟動子。
11.權利要求3或4的核酸構建體，其中所述啟動子是誘導型啟動子。
12.權利要求1、2、5或6的方法，其中所述非生物脅迫選自鹽度、缺水、低溫、高溫、重金屬毒性、缺氧、營養不足、營養過剩、大氣汙染和UV照射。
13.權利要求1、2、5或6的方法，權利要求3、4、10或11的核酸構建體，權利要求7的分離的多肽，或權利要求8或9的植物細胞，其中所述多核苷酸或所述核酸序列選自SEQ ID NO :11、3、5、7、9、122-126、156-285 和 SEQ ID NO :1。
14.權利要求1、2、5或6的方法，權利要求3、4、10或11的核酸構建體，權利要求7的分離的多肽，或權利要求8或9的植物細胞，其中所述多肽選自SEQ ID N0:12、4、6、8、10、 13-119、127-131、139-155 和 SEQ ID NO :2。
15.權利要求8或9的植物細胞，其中所述植物細胞形成植物的一部分。
全文摘要
本發明涉及提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法以及因此產生的植物。提供了多核苷酸序列和使用其提高植物對非生物脅迫的耐受性和/或提高植物生物量，活力和/或產量的方法。
文檔編號A01H5/00GK102260703SQ20111010427
公開日2011年11月30日 申請日期2006年8月15日 優先權日2005年8月15日
發明者G·羅南, H·卡奇, L·拉比諾維克, R·耶林 申請人:伊沃基因有限公司