二穗短柄草抗白粉病基因快速鑑定的製作方法
2023-05-10 07:02:26
專利名稱：二穗短柄草抗白粉病基因快速鑑定的製作方法
技術領域：
本發明是藉助於二穗短柄草測序全基因組序列，利用植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學和候選基因策略等方法快速鑑定二穗短柄草白粉病基因；該發明主要涉及到二穗短柄草全基因組序列的下載，候選基因的鑑定，基因的比對，聚類等手段，進而鑑定出白粉病基因，屬於植物生物技術科學領域。
背景技術：
二M短WiKBrachypodiumdistachyon )是一種溫帶禾本科植物,其生長條件要求比較簡單，植株矮小，自花授粉、生長周期短、繁殖能力強、易轉化、基因組小、遺傳資源豐富，已有研究表明二穗短柄草與小麥、水稻擁有共同祖先，其中與小麥的親緣關係很近，兩 者基因組相似在95%以上，並且小麥易感染的各種細菌均能感染二穂短柄草，因此二穂短柄草是用於研究小麥、水稻作物的新型模式植物的理想植株。眾所周知，小麥白粉病是一種世界性病害，在小麥各個生育時期均可發病，嚴重時導致植株早枯，造成減產，甚至絕收，目前，國內外一些學者正致力於小麥抗白粉病性基因的分子標記的研究，通過尋找與抗病基因緊密連鎖的分子標記，直接或間接的定位抗病基因，通過抗病基因克隆、轉化和積累，加速抗小麥白粉病育種的進程。然而小麥基因組較大，複雜程度高，例如，栽培小麥的基因組大約為17000Mb，而且包含3個相互獨立的基因組，這就阻礙了對小麥進行基因組學及分子育種的研究。二穗短柄草與小麥同屬禾本科早熟禾亞科。目前，二穂短柄草的基因組測序及注釋已經正式完成，這是禾本科早熟禾亞科第一個被測序的物種。因此，系統總結二穗短柄草的抗白粉病基因的生物學特徵、基因表達模式和功能等，將有助於利用分子生物技術加速解決小麥和大麥等穀類作物上對白粉病的危害。MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發現MLOresistance locus 2)基因對白粉病抗性是始於1937-1938年，由德國人在衣索比亞採集了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌QUunwriei gremiriis f. sp. hordei)所有己知的生理小種都具有高效抗性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大麥對幾乎所有己知大麥白粉病菌的生理小種產生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發現很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因對植物抗白粉病育種具有重要的作用。目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉座子標籤等方法。但是由於二穗短柄草的基礎研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準確地克隆這些基因。因此，如何快速鑑定二穗短柄草中的MLO型抗病基因將成為二穗短柄草抗白粉病育種的重要前提。植物比較基因組學(Comparative Genomics)是基於基因組圖譜和測序基礎上,對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆其他植物基因，揭示基因功能和分子機制，闡明物種進化關係及基因組的內在結構。本專利所採用的方法及思路模式植物擬南芥基因組研究已經揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上的同源性克隆二穗短柄草MLO型抗病基因，根據模式植物擬南芥實驗系統上的優越性和已知MLO型抗病基因的特點，快速「捕捉」 二穗短柄草抗白粉病基因。近年來，二穗短柄草基因組測序的完成為我們快速挖掘二穗短柄草白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以二穗短柄草全基因組序列為前提，結合比較基因組學、遺傳學、基因組學、生物信息學和候選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。
發明內容
技術問題
本發明的目的是提供一種通過結合植物比較基因組學、植物遺傳學、基因組學和生物信息學等知識，快速挖掘二穗短柄草抗白粉病基因。其結果一方面可用於二穗短柄草白粉病基因緊密連鎖分子標記的開發，進行分子標記輔助向小麥等作物轉移抗白粉病基因，另一方面也為其他作物白粉病基因鑑定提供參考依據。技術方案
主要原理第一個植物抗白粉病基因(MLO)是從大麥中克隆的，研究發現此基因是一類特殊的抗病基因，不同於先前克隆的大多數NBS (nucleotide-binding site)類型抗病基因；隨後，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因，研究發現這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨後，眾多研究者通過多次試驗證實MLO型抗病基因已經成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發現，植物MLO類型基因是一個基因家族；而且對來源於不同物種的MLO基因家族進行系統發育關係分析發現，不同物種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的典型特徵。二穗短柄草基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以藉助於已經測序的二穗短柄草全基因組中MLO基因家族和已經克隆的MLO白粉病基因的系統發育關係以及對於維持白粉病基因MLO重要功能的胺基酸保守性來鑑定二穗短柄草白粉病基因。主要步驟如下
O 二穗短柄草全基因組序列的下載及其MLO型基因的採集
首先從二穗短柄草測序基因組資料庫(http://www. phytozome. net/search, php)下載二穗短柄草全基因組序列；使用「DNAT00LS」軟體對獲得的二穗短柄草全基因組胺基酸序列數據建立資料庫，然後用pfam資料庫(蛋白家族資料庫，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾可夫模型(HMM)對MLO結構域的胺基酸序列與已建立的二穗短柄草全基因組胺基酸序列資料庫進行Blastp (E-value=0. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經公布的MLO型基因序列，對二穗短柄草基因組資料庫進行BLAST比對，獲得候選基因序列。2) 二穗短柄草MLO型基因家族的鑑定
將上述結果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進行分析，去除無『ML0』結構域的基因序列(圖I)。再將抗病基因序列通過MEGA3. I軟體提供的Clustalff工具(多序列比對程序)進行多序列比對，去除重複序列。
3)通過植物MLO型基因系統發育關係鑑定二穗短柄草MLO型白粉病基因
由於先前的研究已經證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位於植物MLO基因系統發育樹同一區組，因此在系統發育關係研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其他作物的MLO型抗白粉病基因和二穗短柄草MLO型基因一起聚類分析，以獲得二穗短柄草抗白粉病基因(圖2)。4) 二穗短柄草白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
利用BioXM 2.6軟體將二穗短柄草候選的MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO白粉病基因的胺基酸序列轉換成Fasta格式的文件，將這些文件導入BioEdit7. O軟體，運用此軟體中Clustal軟體進行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要胺基酸殘基及區域的保守性。從而進一步鑑定二穗短柄草白粉病基因(圖3)。本發明的積極效果
O縮短了二穗短柄草白粉病基因挖掘周期，有利於白粉病基因的快速鑑定。採用常規方法(圖位克隆、轉座子標籤等)挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本發明基於植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學方法快速挖掘二穗短柄草白粉病基因，不僅可以縮短時間，還可以提高白粉病基因鑑定效率。2) 二穗短柄草屬於禾本科短柄草屬。與水稻、小麥 具有較近的親緣關係，是研究單子葉植物的模式植物。由於二穗短柄草遺傳基礎狹窄，種質資源多樣性低，因此通過常規的分子標記(RAPD、ISSR、SSR、AFLP等)鑑定二穗短柄草白粉病基因比較困難。通過鑑定的候選白粉病基因開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，可以快速的用於抗病基因的分子標記輔助選擇，準確性高。3)多抗性育種材料的創製。基於新鑑定的白粉病基因開發的功能性分子標記，結合已經定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創製，可以縮短育種年限，提聞育種效率。4)為闡述二穗短柄草抗白粉病分子機制奠定了基礎。二穗短柄草抗白粉病基因的鑑定，通過轉基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技術等研究抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利於快速闡述二穗短柄草抗白粉病的作用機理。
圖I 二穗短柄草MLO基因的鑑定；
本圖顯示的是12個MLO型基因鑑定結果，每一個基因都含有一個『ML0』保守結構域。圖2植物MLO基因家族的系統發育關係分析及其二穗短柄草MLO型白粉病基因的鑑定；
擬南芥是植物科學研究的模式植物，在構建系統發育樹中，擬南芥的15個MLO型基因(其中3個基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因(SlMLO)、大麥白粉病基因(HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因(PsMLO)被選擇用來和二穗短柄草MLO型基因聚類分析。共鑑定出I個二穗短柄草候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標記的基因就是候選二穗短柄草白粉病基因。圖3 二穗短柄草MLO型白粉病基因的比對分析；I個二穗短柄草白粉病基因與大麥(HvMLO)、番茄(SlMLO)、豌豆(PsMLO)、擬南芥白粉病基因(AtML002，AtML006和AtML012)進行比對，鑑定白粉菌侵染有重要作用的胺基酸殘基和區域的保守型。圖中TM1-TM7表示二穗短柄草MLO型白粉病基因的7個轉模區域；黑色圓點表示白粉菌侵染重要的胺基酸殘基；CaMBD表示鈣調蛋白結合區；1和II表示對白粉菌侵染重要的胺基酸區域。
具體實施例方式抗病基因的鑑定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本方法可以快速鑑定出二穗短柄草白粉病基因。具體實施過程如下
O 二穗短柄草MLO型基因的採集及鑑定 為了獲得二穗短柄草全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番茄、豌豆、辣椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構建HMM模型，從二穗短柄草基因組序列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已經發表的MLO基因序列作為靶序列(來自 DFCI 資料庫TC171015, TC267529, DFCI: TC327983, TC289653, TC312087,TC132500, TC133436, TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912,TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383,TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441, TC281428, TC285118,TC285090;來自 GenBank 資料庫AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315,AY029317-AY029319, Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF369576，Z83834, Z95496, AY581255),對二穗短柄草資料庫(http://www. phytozome. net/search,php)進行BLAST比對，選擇相似度最高的序列進行下載，共獲得了 12條候選的MLO型基因(Bradilg36172; Bradilg76500; Bradi2g25190; Bradi2g33517; Bradi2g57317;Bradi3g07150; Bradi3g32230; Bradi3g46070; Bradi4g08740; Bradi4g23887;Bradi5gll205; Bradi5g26435;)。2) 二穗短柄草MLO型基因家族的鑑定
為了進一步驗證這些MLO基因準確性，我們對這12個MLO基因進行保守結構域「ML0」的鑑定。以每一個候選的MLO型基因的胺基酸序列為基準,在PFAM(http://pfam. sanger.ac.uk/)網站上進行『ML0』保守結構域的鑑定，具體結果見圖I。3) 二穗短柄草MLO型基因的系統發育關係分析
在先前的研究中，發現雙子葉植物白粉病基因聚合成一個區組；因此，在構建系統發育樹中，我們選擇了模式植物擬南芥的15個MLO型基因(其中3個基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtMLOl2 )、番茄抗白粉病基因、大麥白粉病基因和豌豆的白粉病基因和二穗短柄草MLO型基因聚類分析一起聚類分析。將二穗短柄草MLO型基因和其他作物白粉病基因蛋白質序列進行多序列聯配(採用Clustal X I. 83軟體進行)，並利用Genedoc軟體(http://www. nrbsc. org/gfx/genedoc/index, html)顯不多序列聯配的結果。將Clustal多序列聯配的結果輸出到MEGA 4.0軟體中，並利用此軟體分別構建了鄰接樹(neighbor-joining, NJ),利用Bootstrapping方法對這些進化樹進行了評估。結果發現在雙子葉植物抗白粉病基因區組內，存在I個二穗短柄草MLO型白粉病基因(見圖2)。4) 二穗短柄草MLO型抗病基因的比對在大麥MLO型白粉病基因研究中，研究中相繼發現了一些重要區域和單個胺基酸，它們對大麥白粉菌侵染有著不可替代的作用。為了鑑定I個二穗短柄草白粉病基因序列中，這些重要區域和胺基酸是否高度保守，我們對來自擬南芥的3個抗白粉病基因(AtML002、 AtML06和AtML012)、番茄白粉病基因(S1ML0)、豌豆白粉病基因(PsMLO)進行了比對分析。發現二穗短柄草I個白粉病基因與已知的MLO型白粉病基因的7個跨膜區，30個重要的胺基酸，I個鈣調蛋白結合區(CaMBD)和兩個重要的區域(I和II)高度保守(圖3)。
權利要求
1.二穗短柄草抗白粉病基因，其特徵在於選自下列I個基因 基因編號Bradilg76500 胺基酸序列MAGPAVGRELPQTPTffAVAVVCLVMILLSLALEHALHKLGHffFQKRQKKAVAEALEKIKAELMLMGFISLLLTVGQTPISKICISKEAGSVMLPCKLSVAAEDADDEGKDNGRRRLLWFQEEIHRRFLAAAPGVDPCASQGKVALMSASSMHQLHIFIFVLAVFHVFYSVTTMALGRLKMKKWKKWESETTSLEYQFANDPSRFRFTHQTSFVKRHMGLSSTPGVRWIVAFFRQFFGSVTKVDYLTMRQGFINAHLSQNSKFDFHKYIKRSLEDDFKVVVGISLPLWFVAVLTLFLDINGIYTLIWISFVPFVILLLVGTKLEIVIMEMAQEIQDRASVIKGAPVVEPSNKFFWFKRPDWVLFLIHLTLFQNAFQMAHFVWALFTPGLKKCYHQNMGLSIMKVVVGVALQVLCSYITFPLYALVTQMGSNMKRAIFDEQTAKALTNWRNTAREKKKTRDADAFMAQMIGDATPSQGSSPVHLLHKNRMRSEDPQSIPTSPRAEHEAMDMYPVAQVVHTSHPHPPHRLDPSDRRRSASSSALDTDIASADFSFSMQR 核苷酸序列ATGGCGGGGCCGGCGGTAGGGCGGGAGCTGCCGCAGACGCCGACGTGGGCGGTGGCGGTCGTCTGCCTCGTCATGATACTCCTCTCCCTCGCCTTGGAGCACGCGCTCCACAAGCTCGGCCATTGGTTCCAGAAGCGGCAGAAGAAGGCCGTGGCCGAGGCGCTCGAGAAGATCAAAGCAGAGCTGATGCTGATGGGTTTCATTTCCCTGCTCCTCACCGTGGGGCAAACGCCAATCTCCAAGATATGCATCTCCAAGGAGGCCGGCAGCGTCATGCTACCGTGCAAGCTGTCAGTGGCAGCCGAGGACGCCGACGACGAAGGCAAGGACAACGGCCGCCGGAGGCTACTCTGGTTCCAGGAAGAAATCCACCGTCGGTTCTTGGCCGCCGCGCCCGGAGTTGACCCCTGTGCGAGCCAGGGCAAGGTGGCGCTGATGTCTGCAAGCAGCATGCACCAGCTGCACATATTCATCTTCGTGCTCGCCGTCTTCCATGTCTTCTACAGCGTCACCACCATGGCTCTAGGGCGTCTCAAGATGAAGAAATGGAAGAAATGGGAGTCGGAGACAACCTCACTGGAGTATCAGTTCGCAAATGATCCTTCGCGGTTCCGTTTCACGCACCAGACGTCCTTCGTGAAGCGGCACATGGGCCTCTCCAGCACTCCTGGCGTCAGATGGATCGTGGCGTTCTTCAGGCAGTTCTTCGGGTCAGTCACCAAGGTGGACTACCTGACCATGCGCCAAGGCTTCATCAATGCGCATTTGTCGCAGAACAGCAAGTTCGACTTCCACAAATACATCAAGAGGTCACTCGAGGACGACTTCAAAGTAGTCGTCGGTATCAGCCTCCCGCTGTGGTTCGTGGCGGTTCTCACGCTCTTCCTTGATATTAACGGGATCTACACGCTCATCTGGATCTCTTTCGTCCCTTTCGTCATCCTGTTGCTGGTTGGAACCAAGCTAGAGATTGTGATCATGGAGATGGCCCAGGAGATCCAGGATCGGGCAAGCGTCATCAAGGGGGCTCCTGTCGTTGAACCAAGCAACAAGTTCTTCTGGTTCAAACGGCCTGATTGGGTCCTGTTCCTCATACATTTGACACTGTTCCAGAACGCGTTTCAGATGGCGCATTTCGTCTGGGCACTGTTCACACCCGGTTTGAAGAAATGCTACCATCAAAACATGGGACTGAGCATCATGAAGGTCGTGGTGGGGGTAGCTCTTCAGGTTCTGTGCAGCTACATCACCTTCCCACTCTATGCACTAGTCACACAGATGGGCTCAAACATGAAGAGGGCCATCTTCGATGAGCAGACGGCCAAGGCACTGACGAATTGGAGGAACACAGCAAGGGAGAAGAAGAAGACCCGGGATGCAGACGCATTCATGGCGCAGATGATCGGTGACGCAACACCAAGCCAAGGCTCATCGCCGGTGCATCTGCTCCACAAGAACAGGATGCGGTCAGAAGATCCCCAAAGCATACCAACCTCGCCAAGGGCCGAGCACGAGGCTATGGACATGTATCCGGTTGCGCAGGTTGTGCACACATCGCATCCACATCCACCCCACAGACTAGACCCTTCTGACAGGAGGAGGTCCGCCTCATCGTCAGCCCTTGACACTGATATAGCCAGTGCTGATTTTTCCTTCAGCATGCAACGGTGA。
2.權利要求I所述快速鑑定二穗短柄草白粉病基因的應用，包括 O向禾本科作物抗白粉病基因的轉移。
.3.2)向禾本科作物抗白粉病基因的轉移育種實踐。 . 4.3)抗白粉病基礎理論研究。
全文摘要
本發明是快速鑑定二穗短柄草抗白粉病基因；涉及到植物比較基因組學，遺傳學和生物信息學等學科知識，屬於植物生物技術科學領域。該發明主要步驟為1)二穗短柄草全基因組序列的下載及MLO型基因的採集；2)MLO型基因的鑑定；3)MLO型基因系統發育關係；4)MLO型白粉病基因的比對。該發明有效的縮短了二穗短柄草白粉病基因挖掘周期，有利於白粉病基因的快速鑑定；通過鑑定的白粉病基因開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用於抗白粉病基因的分子標記輔助選擇，準確性高；結合其它抗病基因分子標記可進行多抗性育種材料的創製，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述二穗短柄草抗白粉病分子機制奠定了基礎。
文檔編號C07K14/415GK102703462SQ20121009503
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者錢孝英 申請人:常熟市支塘鎮新盛技術諮詢服務有限公司