用於改善繁殖效率的家畜管理的製作方法

2023-05-09 23:09:56

專利名稱：用於改善繁殖效率的家畜管理的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於控制家畜繁殖周期和斷奶的方法，具體而言涉及酪蛋 白衍生肽用於發情期的誘導和同步化而使懷孕率增加並且用於縮短非發
情期的間隔的用途，使得早期斷奶不會不利地影響家畜的健康(welfare )。
背景技術：
家畜群具體而言產肉家畜的繁殖力，極大地取決於群的繁殖效率，並 且其根據懷孕率、生產-能量攝入比(productivity-energy intake ratio )、分 娩前至分娩後身體狀況評分(body condition score )動態以及後代的體重值 來測量。對於任何有效的發情周期方案的關^t性的需求是可預計的以及高 程度的發情和排卵反應。對於單獨評估繁殖效率的最重要的參數是連續分 娩間的間隔。在經濟方面，例如在母牛中，產犢和產犢之間的周期不應超 過一年的最佳周期，即每頭母牛每年產犢一次。這種間隔的主要決定因素 是分娩-受孕間隔。對於高繁殖效率的主要限制是延長的產後非發情期。 產後間隔(PPI)定義為，分娩與下一次發情期之間的間隔。已顯示當分娩 -發情期間隔從60天增至120天時，懷孕百分比線性下降。而且，當產 後間隔增加時，產犢家畜和它們的後代的體重明顯下降。
在整年的產犢群中，據報導11 %至38 %的母牛在產犢後50或60天處 於非發情期。在季節性產犢奶牛群中，13%至48%的母牛在生殖期的初始 被診斷為處於不排卵的非發情期。當雌二醇對腦下垂體釋放黃體生成素 (LH)的正反饋效應和代謝激素例如胰島素和胰島素樣生長因子-I的循環 濃度被多種環境因素降低時，產犢後的排卵和發情期被延遲。主要因素是 有限的能量攝入、較低的身體儲備、分配給產奶的能量增加、哺乳以及產犢期間的疾病(圍產期疾病)。
從產犢至第一次產後排卵的間隔，其特徵在於一段期間增加的LH脈 衝式釋放，這與卵泡的生長和發育有關。為使這些卵泡能夠成熟和排放，
促性腺的支持作用必須足以刺激雌二醇產生的增加，這能夠誘導LH和促 卵泡激素(FSH)的排卵前的流。牛犢的出生與肉牛的第一次產後排卵的起 始時間延遲有關，而且通過由低頻率的LH脈沖式分泌引起的低濃度的 LH，哺乳對於發情期的起始具有抑制性影響。這種抑制性作用獨立於乳頭 或乳房內的感覺神經途徑，而且母-仔聯繫(maternal-offspring bonding) 被認為是家畜中哺乳誘導的延長PPI的主要因素。除去哺乳作用產生LH 脈衝頻率的快速增加，其足以刺激第一次排卵，這是一種不依賴於產後營 養水平的反應。已鑑定為影響PPI持續時間的其他因素是產犢前和產犢後 的營養，以及季節和圍產期疾病。產犢後第一個月期間發生的臨床疾病例 如乳腺炎、子宮炎、陰道炎、重度跛(severe lameness )以及酮病，據報導 都是延遲PPI的重要危險因素。簡要的說，當出現下述現象時觀察到延長 的PPI:在低能量攝入和/或低身體儲備情況下當LH釋放和/或代謝信號的 增加被哺乳延遲時，當為了產奶而出現能量的增加分配時，或者當家畜的 健康由於源自疾病的應激增高由於斷奶而產生乳腺/乳房壓力，或者高的環 境溫度而 一皮不利地影響時。
產犢後發情周期的早期恢復對於全年和季節性產犢群的高繁殖效率 具有重要性。對於基於牧草的繁殖系統，產犢的時間通常設定為，優化利 用春季和初夏的最大牧草生長速率。為維持季節中最佳的產犢分配，生殖
周期早期中的高的受孕率是重要的先決條件。為維持最大是365天的產犢 間隔，母牛需要在產犢後平均約80天受孕。排卵的起始以及發情期的表 現延遲，與降低的受孕和懷孕率以及產犢至受孕間間隔的增加有關。
對於PPI延長的母牛的治療選擇包括激素和管理的策略。激素治療包 括一段時間的例如孕酮的補充，其使治療動物的大多數表現出發情期，並 隨後具有正常持續時間的黃體期，並且與未治療對照相比其提高了懷孕 率。激素介入與管理變化(例如控制身體狀況或產犢後飲食攝入)相比更 有助於具有可預期的結果，並且通常具有一些發情期同步化的作用，因此促進了人工授精的使用。例如美國專利第6,939,558號公開了含有孕酮的 陰道內裝置，其能用作生物體內的發情期誘導劑，所述生物體例如牛、豬 和馬以及類4以動物。
然而，對於任何激素治療的反應是可變的並且取決於，卵泡波的階段 以及在調節卵泡連續發展中發揮作用的控制機制的複雜性。對於發情期同 步化，使用激素可以產生降低的受精以及次級效應，因此不會達到增加繁 殖效率的目標。
農業動物的健康是過去十年在現代社會中增加的公眾關注的問題 (Broom DM 1992 In: Phillips等，糹扁壽專.Farm Animals and the Environment CAB Wallingford UK第245-253頁)。在集約化繁殖系統中關於農業動物的 圈養(housing)和管理實踐的最近的發展，反映了對於動物健康的道德關 懷的增加(Fregonesi JA等.2001 Livestock Production Sci. 68:205-216; Fregonesi等.2002 Livestock Production Sci. 78:245-257 )。動物健康的改善 定義為痛苦的預防和積極情感出現的增加，通常稱作舒適或愉快(Broom, 上述)。削弱的生物功能的測量，特別是與健康下降和生理應激反應增加 相關的那些功能，被用於評估農業動物的健康狀況。
在牛業和乳業中，群中泌乳動物經歷泌乳和懷孕的控制周期，像這種 促進產犢和產奶量明顯增加的方案。乳畜群例如奶牛和山羊的當前管理 中，在泌乳期和懷孕期之間有明顯重疊，其中通過停止產奶，"幹乳期" 強加在分娩前的第50天至第70天之間。設置這種方案以平衡誘導退化 (involution)的需要( 一種用於下一個健康的泌乳期所必需的過程)與全 年高產奶量的需要。與控制繁殖效率的管理原則一致，牛業的牛犢在3至 5個月的年齡斷奶。早期斷奶的益處包括退化的誘導和繁殖力的增加，牛 犢飼養的控制以及母牛飼養所需食物數量和質量的降低。然而，早期斷奶 《會母牛以及牛犢強加了強烈的應激，導致身體狀況的整體下降，乳房壓力 的增加，漏乳和劇痛，所有這些導致易感於疾病並且不利地影響母牛的下 一個生殖周期，以及導致牛犢體重嚴重下降。因此，現代農業中控制泌乳 動物早期斷奶的當前實踐，相當大地妨礙了動物的健康狀況和繁殖性能。
酪蛋白肽酪蛋白(CN)是人類和非人類哺乳動物乳中主要的蛋白質。依照它們
的電泳遷移率，其先前被定義為主要包括3個部分，a、 P和y。現在，依 照aSl、aS2、(3和k亞型中每種的胺基酸序列來定義酪蛋白(Engel等.1984. 丄Dairy Sci. 67:1607-1608)。
酪蛋白的酶解作用釋放促進幼仔健康和正常發育的肽，和充當乳腺功 能的局部調節劑的肽(Silanikove等.2000 Life Sci. 67:2201-2212; Shamay 等.2002 Life Sci. 70:2707-2719 )。美國專利第6,391,849號公開了酪蛋白衍 生的用7蛋白腖(充當鈣螯合劑)和其用途，所述用途用以控制乳腺中的生 理變化，包括暫時和永久的產乳停止，以及預防、治療和逆轉感染。麻蛋 白腖(PP)也已知為酪蛋白磷酸肽(CPP)，是一群耐煮淬的肽，其構成乳 清蛋白的約三分之一，乳清蛋白是纖溶酶作用於(3-酪蛋白和asl-以及as2-酪蛋白後的主要產物(Andrews 1983 J. Dairy Res. 50:45-55)。
酪蛋白磷酸肽已顯示擁有獨一無二的特性，其能夠結合大量元素例如 Ca、 Mg和Fe，連同微量元素例如Zn、 Ba、 Cr、 M、 Co和Se，這些元素 可溶解在小腸中而因此可以吸收穫得。像這樣，CPP被用作飲品和嬰兒食 物以及牙藥物(dental medicament)的添加劑(參閱例如,歐洲專利第EP 0090406號；美國專利第5,130,123; 5,227,154號)。
先前已顯示了得自纖溶酶作用於(3-酪蛋白(p-CN)的肽下調奶牛和山羊 的泌乳(美國專利第6,391,849號)。這種肽的活性與其阻斷乳腺上皮頂膜 中鉀通道的能力相關(Silanikove等，上述)。也顯示了注射酪蛋白水解物 (CNH)到山羊或奶牛的乳房，可模擬退化的自然現象，誘導了局部炎症反 應以及喪失緊密連接(TJ)的完整性，隨後迅速停止了乳腺分泌(Shamay等, 上述；Shamay等2003 J. Dairy Sci. 86:1250-1258 )。由CNH誘導的過程與 由自然停奶誘導相比更迅速更同步化。這些結果指示其可能明顯地降低了 所需用於退化的時間。本發明的發明人和同事也顯示了，其可能縮短或省 略千乳期而不會影響下一次泌乳的產奶量(國際專利申請公布第 WO2006/117784號)。
對於改善群的繁殖效率並且不會不利地影響家畜健康的方法和組合 物留有未滿足的需要。發明概述
本發明涉及用於改善家畜群的繁殖效率或繁殖力，以及用於誘導早期 斷奶而不會不利影響家畜健康的方法和組合物。具體而言，本發明公開了 用於在群中誘導發情期和同步化排卵的方法和組合物，其產生非發情期間 隔的縮短、受孕率的增加並且因此增加了繁殖率。本發明進一步提供用於
誘導早期和無應激斷奶(stress-free weaning)的方法，其產生群繁殖力的 增力口。
本發明部分基於意外的發現應用酪蛋白衍生肽(麻蛋白腖)到泌乳 家畜動物中，產生所述動物發情期的誘導。
因此，依照一個方面，本發明提供了一種用於在泌乳家畜動物中誘導 發情期的方法，其包括施用給所述動物有效量的衍生自酪蛋白的至少一種 肽。
依照某些實施方式，從施用肽後約2天至約120天，優選地從施用肽 後約2天至約50天出現發情期。依照其他的實施方式，所述方法進一步 包括授精所述泌乳動物。依照一個當前優選的實施方式，受孕率是至少70 %,優選約75%，更優選約80%或更高。
依照某些實施方式，誘導發情期的方法包括從分娩前約70天至分娩 後約150天施用本發明的至少一種酪蛋白衍生肽。依照其他的實施方式， 所述肽從分娩後立即至分娩後約150天施用，優選從分娩後立即至分娩後 90天施用，更優選從分娩後立即至分娩後60天施用，最優選從分娩後立 即至分娩後30天施用。
本發明的方法在任何泌乳動物的發情期誘導中均是有效的。依照某些 當前優選的實施方式，本發明的方法涉及誘導產肉或產奶家畜動物的發情 期，所述家畜動物包括奶牛、山羊、綿羊、豬、駱駝和水牛。
依照本發明方法的發情期誘導可以應用於單頭家畜動物，以及應用於 群中多頭泌乳動物以同步化所有接受治療動物的發情期。非常期望群中發 情期同步化，因為它使群的生活周期的隨後步驟包括授精、產犢、斷奶及 伺料程序等同步化，並且因而提高了管理效率。因此，依照某些實施方式，所述至少一種酪蛋白衍生肽應用於群中多 頭泌乳家畜動物，因而同步化了群中所述泌乳動物的發情期。依照某些實 施方式，所述群是肉牛群。依照其他的實施方式，所述群是奶牛群。仍舊 依照另外的實施方式，所述群是豬群。
依照其他的實施方式，群中發情期同步化能使授精同步化。依照某些 實施方式，群中發情期同步化的方法進一步包括授精所述動物。依照一個
實施方式，授精後的受孕率是至少70%,優選75%,更優選80%。仍舊 依照另外的實施方式，群中發情期同步化形成群中分娩的同步化。
仍舊依照另一個方面，本發明提供一種用於誘導群中至少70%受孕率 的方法，其包括施用給群中多頭泌乳動物有效量的衍生自酪蛋白的至少一 種肽。依照某些實施方式，受孕率是至少75%,優選80%或更高。
衍生自酪蛋白的肽能通過水解酪蛋白獲得，或其能是合成的肽。依照 本發明所教授內容，能使用任何天然的或合成的酪蛋白衍生肽的聯合。
依照某些實施方式，所述肽是酪蛋白衍生磷酸肽。依照一個實施方式， 所述磷酸肽衍生自酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:l闡述的胺基酸序列，和 其類似物、衍生物或片段。依照另外的實施方式，磷酸肽選自由下述磷酸 肽組成的組衍生自P-酪蛋白的磷酸肽、衍生自aSl-酪蛋白的磷酸肽 和衍生自aS2-酪蛋白的磷酸肽。依照某些當前優選的實施方式，磷酸肽 衍生自卩-酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:2闡述的胺基酸序列，和其類似 物、衍生物或片段。依照另外的當前優選的實施方式，磷酸肽衍生自aSl -酪蛋白，其包括如SEQ ID NO:3闡述的胺基酸序列，和其類似物、衍生 物或片段。仍舊依照其他的當前優選的實施方式，磷酸肽衍生自aS2-酪 蛋白，其選自含有如SEQ ID NO:4闡述的胺基酸序列的肽，以及含有如SEQ ID NO:5闡述的胺基酸序列的肽，以及其類似物、衍生物或片段。
不希望受到任何特定理論或作用機制的限制，由酪蛋白衍生肽產生的 發情期同步化可以歸因於內源激素系統向分泌誘導發情期的激素變化。
本發明所教授的內容具有超過先前已知的用於發情期同步化的激素 方法的益處，提供沒有不利效應的應用簡單的方法。而且，本發明的方法有益於動物的整體健康、改善身體狀況以及減少應激因素，因而提供了舒 適度並且增強了動物的健康。
本發明的肽能以如本領域已知的任何適合的方法施用。依照某些實施 方式，施用方法選自由全身施用和直接施用到乳腺組成的組。依照某些當 前優選的實施方式，所述方法包括施用到泌乳動物乳腺的乳頭管中。至少 一種肽能施用到一個或多個乳腺，包括同時施用到動物的全部乳腺。施用
到乳頭能通過根管內注射(intracanal injection )，通過含有本發明肽的貼片 的施用，通過以含有至少一種肽及類似物的組合物浸泡乳頭施用。
考慮了單次施用以及多次施用。本發明現在公開了至少一種酪蛋白衍 生肽的單次施用，其足以誘導發情期同步化。依照其他的實施方式，所述 肽以從約6小時至約24小時的間隔施用1至5次。
依照另 一個方面，本發明提供一種用於誘導哺乳幼仔無應激斷奶的方 法，其包括在斷奶前，施用給泌乳動物至少一天的有效量的衍生自酪蛋白 的至少一種肽。
本發明斷奶的方法能使哺乳幼仔離開其母親，並且因此顯著地降低了 由斷奶給母親和哺乳幼仔強加的應激。年幼牛犢從飼育場被遷出後，其通 常的經驗是喊叫其母親並且在半驚恐和應激的狀態下在飼育場周圍不停 地行走。在這個應激的時間段，由於牛犢不熟悉周圍環境以及其不願意吃 傳統的飼料，因而牛犢經常是體重沒有增加。由於突然停止哺乳母親也遭 受痛苦，顯著地增加了行走和減少了躺下的時間。應激的狀況以及動物消 耗食物量的減少，通常導致所述動物生病以及整體的身體狀況評分下降。 通過使牛犢離開其母親而解除應激，導致牛犢體重沒有下降而且甚至會體 重增力口。
依照本發明所教授內容的斷奶能在哺乳的任何階段誘導，而不會不利 地影響母親的健康。不希望受到任何特定模式或作用機制的限制，本發明 首次公開的這種現象可以歸因於酪蛋白衍生肽對於泌乳動物向發情期的 激素平tf的作用。
依照某些實施方式，早期斷奶從分娩後約2周至約15周、優選地從分4免後約4周至約8周開始。
依照其他的實施方式，在所預定的斷奶以前約1天至約10天，優選
地在斷奶前約3天，施用至少一種酪蛋白衍生肽。
能應用單次劑量以及重複劑量的至少 一種酪蛋白衍生肽至乳腺中的
施用。通常，為獲得無應激斷奶施用重複至少一次，優選1至10次之間、 更優選1至3次；以選自由約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、 約20小時和約24小時組成的組的間隔；在1至10天、優選1至3天、 更優選1天期間施用。依照某些當前優選的實施方式，所述肽僅施用一次。 施用肽後幼仔可以與其母親分離短暫時間，以促進斷奶過程。不希望受到 特定作用機制或理論的限制，斷奶過程由於乳成分的改變而加強，其形成 幼仔哺乳願望的減少，所述乳成分的改變由酪蛋白衍生肽誘導。依照某些 實施方式，幼仔與其母親分離的時間從約5小時至約3天，優選從約5小 時至約2天，更優選從約5小時至約24小時。
仍舊依照另 一個方面，本發明的用於發情期同步化和早期斷奶的方 法，可以以用於飼養家畜群而且更具體指牛群的新穎方法使用，其中存在 起因於繁殖率(即每年出生的牛犢數量)增加的、群的繁殖力增加以及產 肉的數量和/或質量增加，而不會不利地影響、甚至會改善家畜的健康。依 照本發明所教授內容的家畜管理也可以產生在群的飼養過程中所包括的 整體花費的減少，其通過減少施用激素補充劑以獲得發情期同步化的實 踐，以及通過減少分娩後所需的特殊飼料(以保持牛分娩和生育後身體狀 況平衡)的花費來實現。即，本發明的這個方面將如本文公開的發情期同 步化和早期斷奶的用途結合在新穎的家畜管理計劃範圍內。這種新穎的家 畜管理也能夠確定季節性產犢計劃，以及家畜-農業領域計劃 (livestock-agriculture field planning )，淨爭另ll在乾旱和半乾旱;l也區。
本發明的其他目標、特徵和優點可從下述描述中清楚了解。 發明詳述
在詳細解釋本發明的至少一個實施方式之前，應理解本發明不受限於其所應用到的詳細內容，所述詳細內容在下述描述中提出或通過實施例的 例證闡述。本發明能有其他實施方式，或者以不同方式實施或進行。同樣， 應該理解本文使用的措辭和術語是為了描述的目的，而不應認為具有限制 作用。
定義
如本文使用的術語"酪蛋白"指非人類哺乳動物和人類乳中主要的蛋
白質，包括aSl、 aS2、 (3和K亞型。
如本文使用的術語aSl 、 aS2和|3 -酪蛋白指哺乳動物的aSl 、 aS2和 卩-酪蛋白，所述哺乳動物包括但不限於家畜哺乳動物(例如奶牛、綿羊、 山羊、豬、母馬、 一格駝、鹿和水牛)、人類以及海洋哺乳動物。
貫穿本說明書使用的術語"肽"指定為， 一個與另一個通過肽鍵連接 的線性系列的胺基酸殘基。依照本發明原理的肽與完整的蛋白不同。
如本文使用的術語"磷酸肽"指定為結合肽形式的磷酸化的肽，其中 非肽部分是磷酸殘基。具體而言，"酪蛋白磷酸肽"或"CPP"或"麻蛋 白腖，，的表述指定為含有酪蛋白片段的磷酸肽。
用於本發明方法的肽優選地具有從約1,000至約10,000道爾頓的平均 分子量，優選地從約1,000至約5,000道爾頓。具體而言本發明考慮共具 有10-50之間的胺基酸殘基的肽。本發明也考慮了蛋白質，其中其核心基 序(core motif sequence )例如SEQ ID NO:l闡述的胺基酸序列，被人工植 入到多肽序列中，所述多肽例如通過重組DNA技術或通過化學合成生產 的肽。通過水解酪蛋白產生肽的混合物能獲得肽。依照本發明教授的內容 能使用肽的混合物，或者所述混合物通過本領域已知的任何蛋白純化方法 能進一步純化，以獲得分離的肽。可選擇地或另外地，本發明的肽能^皮例 如化學劑裂解，例如CNBr或本領域已知的其他裂解劑(cleaving agent)， 以產生肽的混合物，其能被進一步純化而獲得分離的肽。
用於本發明方法的肽也能使用本領域公知的方法，包括化學合成和重 組DNA技術來合成。合成能在溶液中進行或通過如Merrifield描述的固相 肽合成法進行(參閱J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1964 )。通常，肽合成方法包括連續加入一個或多個胺基酸或適當保護的或衍 生的胺基酸到增長狀鏈上。通常，第一個胺基酸的氣基或羧基被適當的保 護基保護。然後能將被保護的或衍生的胺基酸連接到惰性固體支持物或者 在溶液中利用，其是通過在適合形成醯胺鍵的條件下，在含有適當保護的 互補(氨基或羧基)基團的序列中加入下一個胺基酸。然後從這個新加入 的胺基酸殘基中除去保護基，並且隨後加入下一個胺基酸(適當保護的)，
等等；傳統上這種方法也通過洗滌步驟完成。所有想要的胺基酸以正確的 順序連接後，連續地或同時地除去任何殘留的保護基(以及任何固體支持 物)，以提供最終的肽。通過對這種一般程序的簡單修改，可能在增長鏈 上一次添加多於一個胺基酸，例如通過偶聯(在不外消旋手性中心的情況 下)被保護的三肽與適當的被保護的二肽，在去保護後形成五肽，等等。
如本文使用的術語"發情期'，指除人以外大多數雌性哺乳動物性衝動 的周期狀態，其剛好在排卵前並且在此期間雌性最接受交配。發情周期由 下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸管理的激素相互作用調節。
發情周期能分為三個時期1)卵泡或黃體退化期(發情前期)；2) 排卵前期(發情期和發情後期)；以及3)黃體期(發情間期)。發情周期 的第0天是發情日，即發情期能被看出的那天。然而，從生理學觀點看， 發情周期以黃體(corpus luteus)的破壞起始，並且以下一個周期黃體的破 壞結束。發情前期通常持續3天，以前一個周期的黃體退化起始，並以發 情期的表現結束。當黃體^^皮壞時，出現孕酮水平的下降，並且稍後喪失 黃體組織；在這個過程中，子宮來源的前列腺素F2a (PGF2a)是家畜和大 多數齧齒動物中主要的黃體裂解劑。作為孕酮水平下降的結果，在下丘腦 水平這種激素的負反饋也下降，並且促性腺激素(FSH和LH)的搏動頻率開 始增加，刺激卵泡生長形成大的卵泡並且增加雌二醇水平。當雌激素到達 某一水平時，對雄性的接受性被刺激並且起始了發情周期。
發情期和發情後期起始於對雄性的接受性，並且包括實現排卵和黃體 形成初始的所有變化。在持續約16小時至約24小時的發情期期間，母牛 通常顯示不安和焦慮，頻繁地吼叫以及喪失胃口。在奶牛情況下產奶量會 受影響。母牛出現陰道粘液性排除物，其味道對於公牛具有吸引力和興奮作用(存在信息激素)，以及通過直腸指檢容易檢測的陰門水腫和子宮的 子宮肌層緊張性升高。
在這個期間，高濃度的雌激素達到下丘腦周期中心(hypothalamic cyclic center)的刺激閾，刺激下丘腦神經元產生促性腺激素釋放激素 (GnRH)的峰並且因此產生LH峰。關於FSH，它的分泌下降是雌激素和抑 制素負反饋的結果，除了當LH排卵前的峰出現時能出現FSH峰的那個時 刻外。隨後，在LH波後4至12小時，基礎濃度和FSH脈沖寬度增加， 並且這個過程涉及卵泡生長的首波。
發情期開始後12至24小時，母牛的神經系統變得抗拒雌二醇，並且 發情期的精神表現(psychic manifestation)趨於停止。
緊隨發情期結束的時期稱為發情後期(6天)。在這個時期，母牛發生 排卵(不像其他的物種在發情期排卵)，產生細胞組織並且形成黃體。發 情期開始後28至32小時發生排卵而且通過LH排卵前的峰釋放。排卵後 產生深度流血而且卵泡充滿了血而成為血性體(hemorrhagic body)。
當黃體形成時(黃體化)，發生一系列形態學和生物化學改變，允許 卵泡細胞轉化成黃體細胞。這些改變在第7天以功能性黃體的形成結束。
發情間期的特徵在於黃體的優勢。黃體的維持以及孕酮的合成涉及孕 酮營養的(progesterotrophic )和促黃體的LH激素。
參與孕酮合成的其他激素是FSH和前列腺素2 (PG2)。 FSH激素明顯
加入位於黃體內的受體中並且引起孕酮分泌的增加。關於PG2，除了刺激
黃體細胞產生孕酮外，其可以增加在卵巢水平的血流量，對於孕酮的合成 和分泌具有積極作用。
如果卵子沒有受精，黃體保持功能性直至第15-20天，之後其開始 退化以準備新的發情周期。
如本文使用的術語"非發情期"指循環生殖的雌性哺乳動物中，兩個 發情期之間的性活動的間隔。
如本文使用的術語"產後間隔(PPI)"指分娩至發情期開始(發情前 期)之間的時間。本文使用的可互換的術語"產犢至首次產後排卵"和"分娩-受孕間 隔"指，分娩至發情期後期(發情後期)之間的時間。
如本文使用的術語"產後期"指恰在剛分娩後的時期，即從分娩持續
至恢復正常子宮大小的約6周的時期。
如本文使用的術語"哺乳"指非常年幼哺乳動物的餵養行為，而且是 從乳腺的乳頭吸乳到年幼哺乳動物的口中。依照當前使用的實踐，能隨時 哺乳，或限制到每天的特定次數或整天限制。
如本文使用的術語"千乳期"或"奶牛幹奶期"指分娩前停止產奶的 時期。依照當前使用的實踐，為完成退化過程應用幹乳期是必需的，在此 之後泌乳能力恢復到接近分娩時的水平。
本文使用的可互換的術語"斷奶"和"牛犢遷出"，指當母親處於泌 乳期時將哺乳幼仔與其母親分開。
如本文使用的術語"早期斷奶"指自然停乳過程之前的斷奶而且發生
退化。具體地，術語"早期斷奶"指從分娩後約2周至約15周斷奶。從 分娩後約2周至少於約8周的斷奶也稱為"超早期斷奶"。如本文使用的 術語"家畜-農業領域計劃"指農用地的管理，其包括改變生長農作物與 作為牧場用地之間的土地用途。
如本文使用的術語"身體狀況評分"指代表在某一時間點家畜動物(具 體是母牛)身體儲備的分數。身體狀況評分由目視觀察母牛的臀部區域來 評分-主要是由髖骨分隔的區域(髖骨結節)、臀角(坐骨結節)和尾根。 背部脊推上"覆蓋物，，的量也用來評分。通常母牛的評分等級是1至5。 極瘦的母牛評1分以及極肥的母牛評5分。
如本文使用的術語"家畜"指動物，例如肉牛、奶牛、綿羊、山羊、 馬、豬、水牛和駱駝，其被飼養來用作食物或者用以產生家庭所用的食物 或者用於大規^莫生產和或用於獲利，尤其對於農場而言。
如本文使用的術語"家畜健康"或"農場動物的健康"或"家畜舒適 度"指預防痛苦並且增加積極情感的出現，其通常稱為舒適或愉快，其尤 其是下述因素的結果休息時間、躺下時間和反芻時間的增加，以及代謝需要、乳房壓力、乳頭漏乳、乳房炎發生率和其他疾病和高產奶量導致的 ^皮4亍影響的減少。
本發明的方法可以應用於雌性即將進入發情周期的任何哺乳家畜動 物。作為一個例子，並且預期不受限地，本發明指的是牛群。依照某些當 前優選的實施方式，本發明指的是肉牛群。
牛群的管理能針對產肉和/或產奶。生殖母牛的繁殖周期能劃分為4個
時期奶牛幹奶期；分娩準備期；分娩期；和泌乳期。這些時期的每個時 期都有特定的營養需求和激素特徵。動物懷孕涉及大量花費，因為懷孕最 後一個月的需求高於應用到未懷孕動物的需求。群中分娩時間同步化是非 常有益的。如果產犢被定為日曆年的第0天，群中第O天越同步，越容易 應用有益的管理方案。伺料供應能調整達到群的營養需求，而且其結果是， 改善了牛的生理狀態並且同時解決了經濟問題。分娩同步化直接取決於發 情期同步化。
然而，在奶牛產犢後通過控制營養和通過激素治療，試圖控制PPI、 發情期和卵泡的連續發展和排卵反應，^L證明是不可靠的。施用酪蛋白衍 生肽後奶牛的加速退化，在千乳期和緊隨千乳期後其導致較少的乳房胂脹 和乳房內感染的危險，在產犢和產後期間產生較好的動物舒適度和身體狀 況。在不受限於特定作用^^式時驚奇地發現，施用酪蛋白衍生肽控制了奶 牛的PPI,最主要是通過縮短PPI，並且緊隨其迅速開始的排卵和發情期表 達。
因此，依照一個方面，本發明提供一種用於在泌乳動物中誘導發情期 的方法，其包括施用給所述動物有效量的衍生自酪蛋白的至少 一種肽。
依照某些實施方式，至少一種酪蛋白衍生肽應用於群中多頭泌乳家畜 動物，因此同步化多頭泌乳動物的發情期。
如本文使用的用語"衍生自酪蛋白的肽"或"酪蛋白衍生肽"指下述 肽其是酪蛋白的裂解產物(本文指的是衍生自天然酪蛋白的肽)，相應 於酪蛋白單位的胺基酸序列化學合成的合成肽(本文指的是衍生自酪蛋白 的合成肽)，以及與酪蛋白相似的(同源的)肽，例如特徵在於以下的肽含有一個或多個胺基酸的置換、插入或刪除，例如但不限於保留置換，條
件是只要其保留至少70%、優選至少80%、更優選至少90%的相似性，
以及其功能同系物。如本文使用的術語"同系物"和"功能同系物"指肽， 所述肽含有任何插入、刪除和置換但其不會影響如本文描述的肽的生物活性。
依照本發明教授的內容能使用酪蛋白衍生肽的任何組合。術語"組合" 被定義為任何上文提及的天然的或合成的酪蛋白衍生肽，與 一 種或多種添 加劑及非相同肽結合於混合物中。如本文使用的術語"混合物，，被定義為 肽的非共價組合，所述肽以彼此間各種比例存在。
依照某些實施方式，衍生自酪蛋白的肽是磷酸肽，其包括活性基序
Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu Glu (SEQ ID NO: 1)，及其類似物、衍生物或片段。 應該理解任何含有這種基序的肽，無論是衍生自酪蛋白，衍生自酪蛋白以 外的蛋白，還是合成性合成或通過重組技術產生，只要其保持了如本文描 述肽的生物活性，那麼其也包括在本發明的範圍內。本發明的磷酸肽通過 含有如SEQ ID No. 2-5中任一項所闡述的胺基酸序列的肽舉例說明，列表 如下
SEQ ID NO序 歹'J來 源殘基號
SEQIDNO:2RELEELNVPGEIVES(P)LS(P)S(P)S(P)EESITRp-酪蛋白1—25
SEQ ID NO :3QMEAESIS(P)S(P)S(P)EEIWDSVEQKaSl -酪蛋白59—79
SEQ ID N04KNTMEHVS(P)S(P)S(P)EESIISNETYKaS2 -酪蛋白1一21
SEQIDNO:5NANEEEYSIGS(P)S(P)S(P)EESAEVATEEVKaS2 -酪蛋白46—70
術語"類似物"包括，含有本發明肽通過胺基酸置換、添加、刪除或 者化學修飾而改變的序列，並且保有所述肽的生物活性的任何肽。"氨基 酸置換"是指用功能等同的胺基酸殘基置換序列內的殘基而產生沉默突變
(silent change )。例如，序列內 一個或多個胺基酸殘基能^皮相似極性的另 一個M酸置換，其充當功能等同物而產生沉默突變。用於置換序列內胺基酸的胺基酸可以選自所述序列內胺基酸所屬類的其他成員。例如，非極 性(疏水)胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電(鹼性)胺基酸包 括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨 酸。這種置換已知為保守置換。另外地，能在胺基酸中使用對肽的生物活 性沒有影響的非保守置換。應理解本發明包括了肽類似物，其中至少一個 胺基酸-故另一個氛基酸置換，與本文列舉的肽相比、其產生了具有穩定性 增強或較長半衰期的本發明肽的活性類似物。
當SEQ ID NO:l至5闡述的肽序列的胺基酸殘基都是"L"異構形式 時，只要肽類似物保持其活性，"D"異構形式的殘基能置換任何L氬基酸 殘基。產生逆反D胺基酸肽類似物的方法是本領域公知的，其中所述肽用 所公開的同樣的胺基酸製成，但至少一個或多個胺基酸(包括全部胺基酸) 是D胺基酸。當肽類似物中所有的胺基酸是D胺基酸，並且肽類似物的 N-和C-末端被反轉時，產生與L胺基酸形式的肽在相同位置具有相同結構 基團的類似物。然而，肽類似物對於蛋白水解的降解作用更穩定，而因此 在本文敘述的許多應用中都有用。
術語"衍生物"指含有胺基酸序列的肽，其包括本發明肽的胺基酸序 列，其中一個或多個胺基酸殘基通過側鏈或官能團的反應遭受了化學衍生 作用，其中這種衍生作用沒有破壞肽衍生物的活性。胺基酸殘基的化學衍 生作用包括但不限於，糖基化、氧化、還原、十四烷基化、硫酸化、醯化、 乙醯化、ADP核糖基化、醯胺化、環化、二硫鍵形成、羥基化、碘化和甲 基化。
依照本發明原理的肽衍生物也包括鍵的修飾，包括但不限於CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S=0、 OC-NH、 CH2-0、 CH2-CH2、 S=C-NH、 CH-CH和CF=CH， 以及骨架修飾。肽內的肽鍵(-CO-NH-)可以被置換，例如由N-曱基化的鍵 (-N(CH3)-C0-);酯鍵(-C(R)H誦C-O-O-C(R)-N);亞甲基酮(ketomethylene) 鍵(-C0-CH2-); a-氮雜(a-aza)鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基例 如甲基；碳醯(carba)鍵(-CH2-NH-);羥乙基鍵(-CH(0H)-CH2-);硫代醯胺鍵(-C二S-NH-);烯烴雙鍵(-CI^CH-);以及肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)來 置換，其中"R"是天然出現在碳原子上的"正常"側鏈。這些修飾能夠 沿肽鏈發生在任何4建上，並且甚至在幾處(2-3)同時發生。
本發明也包括那些肽，所述肽中的自由氨基被衍生而形成胺鹽，其包 括但不限於鹽酸化物、對甲苯磺基、千氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙醯基或 曱醯基。自由羧基可被衍生形成例如，鹽、甲酯和乙酯或其他類型酯或醯 肼。自由羥基能被衍生形成例如，O-醯化或O-烷化衍生物。組氨酸的咪唑 氮能一皮衍生形成N-內-千基組氨酸(N-im-benzylhistidine )。
也包括作為化學衍生物的那些肽，其包括一個或多個天然存在的具有 20個標準胺基酸殘基的胺基酸衍生物。例如4-鞋脯氨酸能置換脯氨酸； 5-羥賴氨酸能置換賴氨酸；3-曱基組氨酸能置換組氨酸；高絲氨酸能置換 絲氨酸；以及鳥氨酸能置換賴氨酸。肽也能含有非天然胺基酸。非天然氨 基酸的非限制性例子是正亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高絲氨 酸、高半胱氨酸、異丙基Lys、 3-(2'-萘基)-Ala、煙醯Lys、氨基異丁酸和 3-(3'-吡咬基-Ala)。肽也可以含有非蛋白質側鏈。除了上述內容之外，本發 明的肽也能包括一個或多個非胺基酸單體或寡聚體(例如脂肪酸、複合糖 及類似物)。也包括任何含有一個或多個添加的胺基酸殘基的肽，所添加 的胺基酸殘基涉及在上文中列舉的肽的序列，只要必要的活性而且優選分 子量糹皮保持。胺基酸殘基能加入到氨基端和/或羧基端和/或沿肽序列加入。
依照本發明的肽衍生物也能是環肽。例如通過形成醯胺鍵能獲得環 化，例如通過在鏈中不同位置(-CO-NH或-NH-CO鍵)摻入Glu、 Asp、 Lys、 Orn、 二氨基丁(Dab)酸和二氨基丙(Dap)酸進行。通過合併式 H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2的修 飾的胺基酸，也能獲得骨架與骨架的環化，其中11=1-4,並且進一步，其 中的R是任何天然或非天然的胺基酸側鏈。也可考慮骨架與側鏈以及側鏈 與側鏈的環化。
通過摻入2個Cys殘基形成S-S鍵也可能形成環化。經由式 -(-CH2-)n-S-CH2-C-(其中n = 1或2 )的相互作用鍵(interaction bond )的
形成，能獲得另外的側鏈與側鏈的環化，這是可能的，例如通過摻入Cys或同型Cys,以及將其自由的SH基與例如溴乙醯化的Lys、 Orn、 Dab或 Dap反應。
如本文使用的術語"片段"指相對於本文列舉的肽序列含有一個或多 個胺基酸殘基刪除的肽，只要其保持必要的活性。氣基酸殘基可從氨基端 和/或羧基端和/或沿肽序列刪除。
通過化學合成、重組DNA技術，或者通過將本文列舉的肽經受至少 一種裂解劑處理能產生肽片段。裂解劑能是化學裂解劑例如溴化氰，或者 酶例如外蛋白酶或內蛋白酶。能用於裂解本發明肽的內蛋白酶包括胰蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或者產生蛋白水解片段的本領 域已知的任何其他的酶。
如在上文中所描述，本發明的肽能通過水解酪蛋白獲得，或者所述肽 能合成地獲得。
酪蛋白的水解能以本領域技術人員已知的任何方法進行。用於水解酪 蛋白的酶包括衍生自動物的酶例如，胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 中性蛋白酶(neutrase )、鹼性蛋白酶(alcalase )、胃蛋白酶、羧肽酶、組 織蛋白酶及類似物；衍生自植物的酶例如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及類似 物；衍生自微生物例如乳酸桿菌、酵母、真菌、枯草桿菌、放線菌、麴黴、 溶酪微球菌及類似微生物的酶。通常，用胰蛋白酶消化進行酪蛋白的水解。 然後從含肽溶液中分離未消化的酪蛋白，通過本領域已知的適當方法將其 從其他雜質中進一步純化。
如本領域技術人員已知，有計劃的繁殖管理計劃具有許多優點和益 處，並且通常能描述為包括下列方面其允許計劃產犢的時間和日期-在 早年授精的母牛與晚年產犢的那些相比，在季節早期具有較長的產犢有效 期(lifetime);能使家畜-農業領域計劃用於本領域的適當用途並且改善 輪流放牧，確保飼料的有效分配以滿足群中個體的生理飼養需要，其中母 牛達到產犢時具有的良好身體狀況(2.75-3.50的身體狀況評分)，顯示較 好的發情期誘導並且變為在限定的生殖季節懷孕；能設計產犢和授精，最 佳化人的工作和受孕率；降低每個群中公牛數量，允許投資具有優秀遺傳 基因和特性的公牛；改善牛犢有關的工作，允許其在同族群中分散；增加發情期系統的耐受能力，因此避免對自然周期的依賴；促進對於接種疫苗 程序的依/人性並且改善其效力。
應用依照本發明誘導發情期的方法，允許在產後期的末尾立即出現發 情期，並且因此縮短了產後間隔(PPI)。縮短PPI是非常期望的。已顯示當
分娩-發情期間隔從60天增至120天時，懷孕百分比線性下降。此外， 當這個間隔延長時，這種分娩-首次發情期關係顯示相當大千克的牛犢體重 的下降。發情期誘導和同步化的結果是，更多的母牛在下一年的早期產犢 並且在下一年的同步化與管理效率一致。
自然地，管理決策和程序對於分娩-受孕間隔有一些影響，但是後者 主要由下列因素決定產犢後排卵周期的重建；在周期的適當時間出現的 發情期；配種後的懷孕率。當發情期受精增加時，懷孕率幾乎呈線性增加。 斜率取決於分娩-發情期間隔並且當這個間隔縮短時其會增大。
不希望受到任何理論或作用^^莫式的限制，通過施用依照本發明方法的 衍生自酪蛋白的至少一種肽而獲得的發情期誘導，可以歸因於激素分泌的 類型和時間的變化。在產犢後期間，泌乳的雌性在開始正常的排卵周期之
前經受其能量平衡中的重要變化。這種負能量平衡主要由泌乳產生的能量 損失引起，並且其大於在食物中重獲得的能量。這種負平衡與激素血漿分 布有關，其決定了卵泡動態的較低活性並且產生缺乏發情期和排卵的結 果。機體狀況評分低於2.5的母牛具有降低的LH脈衝頻率、降低的卵巢 活動並延遲返回分4免後發情期。產犢後LH脈衝式分泌的重建，產生正常 卵泡動態的重新開始。發情周期的早期開始成為早期受孕的決定因素。首 次排卵的時間決定和限制了發情周期的數量，首次排卵很可能在首次授精 前出現，在產犢後60天期間以前發情次數越多，首次授精受孕的機會越 高(例如在產犢後60天期間以前，對於0次發情期和4次發情期的母牛， 每次受孕分別要進行2.60和1.75次授精嘗試)。生產者的目標應該是使母 牛在第一次或第二次授精時受精；另外，開放母牛天數增加以及產犢-受 孕期延長，導致受精率的下降以及形成繁殖的減少。酪蛋白衍生肽提供了 一種誘導所需發情期，並且控制產後間隔以及改善上文描述的負能量平衡 的方法。群的繁殖不僅取決於幼仔的數量，而且取決於屠宰前增加的體重。決 定牛犢體重的一個參數是如在上文中描述的產後間隔(PPT);另一個重要的
參數是斷奶期強加給牛犢的應激。自然地，牛斷奶發生在產犢後約6至7 個月。肉牛群的現代管理實踐採用在4至8周斷奶。早期斷奶有不多的益 處，包括下列方面
-其幫助控制繁殖周期。
-牛犢能根據其遺傳潛力生長而不用顧及其母親的產奶量。
-在乾旱期間或食物短缺的其他時期，對於更有效的飼養利用可能是 關鍵的。
-其降低了飼料消耗，與母牛養育其牛犢相比，早期斷奶牛犢和其母 親飼養只需15至20%的較少的能量，並且早期斷奶牛犢具有較佳的伺料 轉化率。
-其適合於秋季產犢，其中大量的冬季飼養則另有要求。
-早期斷奶允許對更多的母牛進行限制性飼料供給。
然而，早期斷奶給牛犢和其母親強加了嚴重的應激，形成繁殖力和利 益的減少。為避免嚴重體重損失，應使用高質量和高價的牛犢營養品；應 激降低了母親的身體狀況評分並且不利地影響下一個生殖周期。而且，預 期增加的高產奶量由於早期斷奶可能會損失，由於處於應激的母親產生下 降的產奶量，以及由於母親和幼仔身體狀況普遍下降。
本發明現在公開了 一種用於誘導哺乳幼仔無應激早期斷奶的方法，其 包括施用給泌乳動物有效量的衍生自酪蛋白的至少一種肽。
本發明方法的益處在於其能決定斷奶所需的時間，從產犢後幾天至幾 個月，而且幼仔有選擇留在其母親身邊，這樣對於幼仔和其母親的斷奶過 程變得無應激，並且觀察到體重和普遍狀況沒有下降。
此外，本發明現在公開了，施用酪蛋白衍生肽到泌乳動物(具體而言 母牛)的乳腺，以減少乳房壓力，已知乳房壓力是對於母親引起嚴重應激、 缺乏舒適度，易感於疾病和健康下降的另一個因素。突然停止產奶的過程和之後的乳房退化，引起泌乳動物的痛苦並且導 致其行為改變。後者由增加了行走和減少了躺下時間而顯示。用酪蛋白衍 生肽治療後的快速退化，其在約6小時至4天內降低了乳的合成而預防這 種不適。這通過增加的躺下行為和反芻時間來顯示。不希望受到任何特定 模式或作用機制的限制，這種現象可以歸因於酪蛋白衍生肽對於乳房壓力 的作用，施用本發明肽後乳房壓力極大地減小。
因此，由於後代體重的增加而且通過避免攝食過度，本發明的方法提 供了增加的收益率。
依照本發明的方法酪蛋白衍生肽能以本領域技術人員已知的任何適 當的藥物組合物和製劑施用。
如本文4吏用的"藥物組合物"指如本文描述的酪蛋白衍生肽，與其他 化學組分(例如生理學上適合的載體和賦形劑)的製劑。藥物組合物的目 的是促進化合物到生物體的施用。如本文使用的術語"活性成分"指負責 生物效應的化合物。可以交換使用的術語"生理學上可接受的載體"和"藥 學上可接受的載體"指載體或稀釋劑，其對於生物體不會引起明顯的刺激， 並且不會破壞所施用肽的生物活性和特性。術語"賦形劑"指添加到藥物 組合物中以進一步促進化合物的施用的惰性物質。賦形劑不受限的例子包 括各種糖和類型的澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
關於配製和施用藥物的#支術可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa.,最新版中發現，其內容通過引 用併入本文。
依照本發明方法使用的藥物組合物可以以傳統的方式配製，使用一種 或多種含有賦形劑和輔劑的生理學上可接受的載體，其促進活性成分加工
成能在藥學上使用的製劑。適當的製劑取決於所選擇的施用途徑。
對於注射，本發明的肽可以在含水溶液中配製，優選地在生理學上相 容的緩沖液例如Hank's液、Ringer's液或生理鹽水緩沖液中配製。
以本發明方法使用的肽的製劑，可為腸胃外的(乳房內)施用而配製， 例如通過快速注射或連續輸注。用於注射的製劑可以以單位劑量形式存在，例如以含有可選擇地添加防腐劑的安瓿或多劑量容器形式。組合物可 以是油性或水性媒介中的混懸液、溶液或乳劑，並且可以含有配製劑例如 助懸劑、穩定劑和/或分散劑。
以本發明的方法適合使用的藥物組合物包括，其中包含有效量活性成 分而獲得預期目的的組合物。更具體地，有效量指有效誘導發情期同步化 和早期斷奶的量。
實施例
實施例l:肉牛中發情期的誘導和同歩化
目的
本研究的主要目的是誘導和同步化產犢後肉用母牛返回發情期，其通 過根管內施用酪蛋白衍生肽到每個乳頭區域。第二個目的是施用肽後在不 超過60天內獲得成功的受精，以及在母牛中有效地達到高的身體和性能 評分。
治療的成功的結果被認為是，施用狀後至少80%的母牛被誘導的發情 階段達到20天，以及達到第三脈沖的被治療母牛至少有70%受孕。
研究設計
臨床試驗設計為兩個方案(分組(arm))的案例-對照研究。"分組 30"指產日後30天斷奶的牛犢。"分組60"指產後60天斷奶的牛犢。
"案例"和"對照"是預產期前至少14天登記的肉用母牛。對於依 照所計劃的分組(產後30或60天)的這兩個組按計劃地斷奶。案例接受 酪蛋白衍生肽的乳房內施用，而對照不接受任何乳房內施用。案例和對照 母牛生活在相同的群，處於產犢後(相同的出生日土60天)相同的時期(± 180天)，並且泌乳相同時間(± 90天)，並且至少平行14天。對於每個方 案，總共登記30頭母牛，15頭案例和15頭對照。
酪蛋白衍生肽的治療是在一天期間每天施用1-2次。
參加這項研究的母牛的選入標準是:預產期前2周的晚妊娠階段母牛；有健全四肢(four functional quarters )的母牛；懷孕母牛-首次或多次懷孕； 有或沒有確認的乳房內感染的母牛，其接受或未接受先前的治療；沒有明 顯外部乳頭損傷的母牛；在過去8周內沒有全身治療；在過去8周內沒有 以抗生素添加劑飼養；缺乏並存病，其被認為對於研究者判斷治療結果具 有潛在影響。
參加這項研究的母牛的淘汰標準是研究開始的8周內有先前的免疫 治療；在研究開始前8周內，有全身性或通過餵養的，先前的抗生素、激 素、抗炎症和合成代謝的治療；共存交替治療；有研究者能判斷的活性結 核或其他感染性疾病的母牛；全身性或通過餵養而並發地使用了促同化激 素(anabolic steroid);全身性或通過餵養而並發地使用了激素。
臨床試驗的總持續時間是120天(17周)左右，包括對現場(群)的 二十二 (22)次探視，如下述
第一個階段基線/篩選探視過程包括從產犢前15天至產犢後30天， 對於所有參加研究母牛進行至少6次探視。對於研究場所的探視是在產犢 前第15和第7天進行，在產犢日探視和在治療前探視3次。
第二個階段取樣，從分組30開始，授精和跟蹤觀察分組30，包括 至少7次探視-從產犢後第30天直到第52天在第30天探視一次以取 樣和斷奶，斷奶後連續3天探視(第31 、 33和34天)，以及3次探視(第 38天、第45天-授精日和第52天)直到分組60開始。
第三個階段分組60開始並且跟蹤觀察分組30,包括至少4次探視 -從產犢後60天直到第64天(在第60天探視一次以取樣和斷奶分組60, 斷奶後連續3天探視(第61 、 63和64天))。
第四個階段分組30跟蹤觀察的結束以及分組60的授精，包括至少 2次探視(第68天，及第75天-授精日)。從產犢日第75天，結束對於 分組30的案例和對照的跟蹤觀察。授精登記在分組60的母牛。
第五個階段分組60跟蹤觀察的結束以及臨床試驗的結束，包括3 次探視(第82、 91和105天)。
在研究期間對案例和對照進行臨床檢查，包括乳房檢查、具體的臨床系統、體重和懷孕狀況。採乳樣化驗脂肪百分比、蛋白百分比、乳糖百分
比、體細胞計數以及細菌學檢查。採血樣主要化驗雌激素、孕酮、LH、 FSH 和前列腺素。
安全性量度包括生命徵象、體格;險查、偶發疾病、評估不良事件和細 菌檢驗。
在本研究的末尾，測量了下述終點乳腺分泌；通過脈沖的受孕率； 受精率；產犢和/或斷奶後受精用時；斷奶後母牛體重；感染性疾病的出現。
施用酪蛋白衍生肽後停止泌乳的效率如下衡量非常成功1-4天內 停止；5-8天、成功；9-15天、小成功；停止泌乳需要16或更多天、 不成功。
從酪蛋白衍生肽的施用日直到排卵日來測量PPI長度。PPI少於12至 20天被認為非常成功；21至24天、成功；25-29天、小成功；30或更 多天的PPI長度、不成功。
成功的受孕率按下述內容衡量80%或更高、非常成功；70%至79 %、成功；50%至69%、小成功；49%或更低、不成功。
出現下迷情況任一項時停止臨床試驗完成研究；篩選失敗；被群的 主人拒絕；母牛遭受無法忍受的不良事件；牛犢遭受無法忍受的不良事件； 違反選入/淘汰標準；研究者認為需要停止本研究的任何因素或情況。
實施例2:牛犢斷奶
乳房壓力的增加與突然停止哺乳有關，其形成漏乳以及對於泌乳動物 的劇痛。因此母親和幼仔的應激與牛犢斷奶有關，這種應激導致體重下降 並且易感於疾病。
目的
不分離牛犢和母牛的早期斷奶的本研究的主要目的是，測定肉用母牛 和其牛犢間接觸的、斷奶後連續不哺乳的程度，以降低終止餵奶對於母牛 和牛犢行為和生長的不利影響。第二個目的是在斷奶後通過行走和躺下時間以及通過其體重變化測
量(直到斷奶後15天)母牛和牛犢的不良應激行為(behavioral distress )。 研究設計
試驗_沒計為二個方案(分組)的案例-對照研究。"分組30"指產後 30天斷奶的牛犢。"分組60"指產後60天斷奶的牛犢。
"案例"和"對照"是預產期前至少14天登記的肉用懷孕母牛，並 且設法早期斷奶(在產後30天或60天)。取樣的案例接受酪蛋白衍生肽 的乳房內施用。對照不接受任何乳房內施用。
對於母牛以及研究條件的選入和淘汰標準如上文中實施例l所描述。 酪蛋白衍生肽的治療是在一天期間每天施用l-2次。
參加這項研究的牛犢的選入標準是晚妊娠階段出生的牛犢-至少 230天；能立即行走的牛犢；無明顯外部損傷的牛犢；體重至少50Kg的 牛犢；用抗寄生蟲藥治療和抗呼吸道疫苗治療的牛犢；缺乏並存病，其對 於研究者判斷治療結果具有潛在影響。
參加這項研究的牛犢的淘汰標準是在研究期間發生閹割；有共存交 替治療的牛犢；有研究者能判斷的活性結核或其他感染性疾病的牛犢。
臨床試驗的總持續時間是120天(17周)左右，包括對現場(群)的 二十(20)次探視，如下述
基線/篩選探視過程包括從產犢至產犢後30天，對於本研究中所有參 與者進行至少4次探視。對於研究場所的一次探視是在產犢日進行並且在 治療前進行3次探視。跟蹤觀察探視(如上文中實施例1所描述)直到第 五個階段的結束。
在產後15天，母牛隨機地以奇偶數和年齡被分批到2個斷奶日組(在 產犢後30或60天)中的一個，並且接受(案例)或不接受(對照)酪蛋 白衍生肽的乳房內施用。稱重母牛和牛犢，並且在產犢後和斷奶前立即評 估其身體狀況評分。身體狀況評分採用0-5的等級評估，其中0代表嚴 重消瘦而5 ^表肥胖。在產後的斷奶日(30和60天)，母牛-牛犢對^L移到大的圍欄場地。 位於圍欄的案例母牛-牛犢對，在每個圍欄中不超過8對。對照母牛-牛 犢對一皮移到單獨的遠的圍欄。
母牛以提供給每頭母牛每天90-100 MJ可代謝能量的能量飲食祠養 (這接近於對於460-kg肉用母牛產生約7-8 Kg奶並且沒有體重變化的、 推薦水平的100 % )。這種飲食包括60 %的草青貯飼料和40 %的濃縮物(大 麥、大豆、礦物質和維生素；16%的粗蛋白)。在斷奶和治療日前，根據 產犢日在組中圈養的母牛不超過8頭。在斷奶後第一天之後，牛犢用蛋白 質、維生素和礦物質飼養以滿足標準需要，並且在生長階段以幾乎恆定的 量飼養。在斷奶後第一天期間牛犢僅接受水。
案例和對照的行為通過腿部安裝的遙測系統測量。這個系統能監視和 記錄行走、躺下次數和躺下時間的累計的記錄。這個感應器具有數據存儲 和傳輸能力，並且含有集成的能源足以使用至少一個月。在跟蹤觀察期間 收集的數據從感應器每周下載一次。
安全性量度包括生命徵象、體格檢查、偶發疾病、以及評估不良事件。
在本研究的末尾，測量了下述終點
施用酪蛋白衍生肽後停止泌乳的效率如下衡量1 - 4天內停止；5-8 天、成功；9-15天、小成功；停止泌乳需要16或更多天、不成功。
從斷奶至斷奶後30天，母牛身體狀況評分進行如下非常成功-體 重沒有變化或者增加；0至0.5分的較低的評分-成功；0.5至1分的較低 的評分，小成功；l.O或更高分的較低的評分，不成功。
從斷奶至斷奶後30天，母牛的體重情況評估如下非常成功，沒有 變化或者增加；體重下降達到5%，成功；體重下降5%至10%之間，小 成功；體重下降10%或更多，不成功。
從斷奶至斷奶後30天，牛犢的體重情況評估如下非常成功-增加 IO或更高百分比；增加5至9個百分比，成功；沒有變化至增加4個百分 比，小成功；以及體重降低，不成功。
母牛和牛犢的行為通過行走以標準值評估如下非常成功-減少io或更多百分比；成功-減少5至9個百分比；小成功-沒有變化或者增加 /減少至4個百分比；不成功-增加5或更多百分比。
母牛和牛犢的行為通過躺下時間以標準值評估如下非常成功-增加 10%或更多；成功，增力。5%至9%;小成功-沒有變化或者增加/減少至 4%;不成功-減少5%或更多。
出現下述情況任一項時停止臨床試驗
完成研究；篩選失敗；被群的主人拒絕；母牛遭受無法忍受的不良事 件；牛犢遭受無法忍受的不良事件；違反選入/淘汰標準；研究者認為需要 停止本研究的任何因素或情況。
實施例3:奶牛的發情期誘導和同步化
目的
本研究的主要目的是誘導和同步化產犢後奶牛返回發情期，在幹乳期 之前通過根管內施用酪蛋白衍生肽到每個乳頭區域。第二個目的是在施用 日後不超過105天達到成功的受精。
治療的成功的結果被認為是，施用後至少80%的母牛糹皮誘導的發情階 段達到20天，以及達到第三脈衝的被治療母牛至少有70%受孕。
研究設計
臨床試驗設計為案例-對照研究。
"案例"和"對照"是預期的幹乳期前至少14天登記的奶牛。取樣 的案例接受酪蛋白衍生肽或酪蛋白水解產物(CNH)的乳房內施用，而取樣 的對照不接受任何乳房內施用。
案例和對照母牛生活在相同的群，處於產犢後(相同的出生日士60天) 相同的時期(± 180天)，並且在相同時間泌乳(± 90天)，並且至少平行 14天。
酪蛋白衍生肽(或CNH)的治療是在一天期間每天施用1-2次。對 於參加本項研究的奶牛的選入和淘汰標準如上文中實施例1中定義的標準。
臨床試驗的總持續時間是120天(17周)左右，包括對現場(群)的 十三(13 )次探視，如下述
第一個階段基線/篩選探視過程，其包括從千乳期前15天至治療曰， 對於本項研究的所有參與者進行至少2次探視。對於研究場所的探視是在 治療前第15和第7天進行，以及在幹乳期的開始時進行。
第二個階段取樣日和治療日，包括盲選案例和對照，以及乳房內治療。
第三個階段在幹乳期期間，從治療日的第1天至第60天或產犢日， 進行至少4次探視。
第四個階段產犢和授精，直到跟蹤觀察的結束包括至少6次探視。 在第四個階段期間，在產犢日進行一次探視，而且在接下來的三周期間對 於授精和跟蹤觀察進行至少3次探視。
在研究期間對案例和對照進行臨床檢查，包括乳房檢查、具體的臨床 系統，體重和懷孕狀況。採乳樣化驗脂肪百分比、蛋白百分比、乳糖百分 比、體細胞計數以及細菌學檢查。採血樣主要化驗雌激素、孕酮、LH、 FSH 和前列腺素。
安全性量度包括生命徵象、體格檢查、偶發疾病、評估不良事件和細 菌檢驗。
在本研究的末尾，測量了下述終點產犢前乳腺分泌，通過脈衝的受 孕率；受精率；產犢和/或斷奶後的受精；產犢和/或斷奶後母牛體重；母 牛的感染性疾病。
施用酪蛋白衍生肽後停止泌乳的效率如下衡量非常成功l-4天內 停止；成功，5-8天；小成功，9-15天；不成功，停止泌乳需要16或 更多天。
從產犢和/或斷奶日直到排卵日來測量PPI長度。成功的結果被評估如 下非常成功-少於12至20天；成功-21至24天；小成功-25至29天；不成功-30或更多天。
授精率評估如下非常成功-80或更高百分比；成功-65至79個百 分比；小成功-50至64個百分比；不成功-49或更低百分比。
出現下述情況任一項時停止臨床試驗完成研究；篩選失敗；被群的 主人拒絕；母牛遭受無法忍受的不良事件；牛犢遭受無法忍受的不良事件； 違反選入/淘汰標準；研究者認為需要停止本研究的任何因素或情況。
上文描述的具體實施方式
充分地顯示了本發明的一般性質，以致於其 他人可以通過應用當前知識容易地修改和/或適應於各種應用，這種具體的 實施方式無過多的實驗並且沒有脫離通用概念，因此這種適應和修改應該 並預期包括所公開實施方式等同的意義和範圍。應理解，本文使用的措辭 和術語是為了描述的目的，而不是為了限制。在不脫離本發明的前提下， 執行各種所公開功能的方法，材料和步驟可以採取許多種可選擇的形式。
權利要求
1.一種用於在泌乳家畜動物中誘導發情期的方法，其包括施用給所述動物有效量的衍生自酪蛋白的至少一種肽。
2. 根據權利要求1所述的方法:後約2天至約120天。
3. 根據權利要求2所述的方法:後約2天至約50天。
4. 根據權利要求1所述的方法， 天至分娩後約150天施用。
5. 根據權利要求4所述的方法， 至分娩後約90天施用。
6. 根據權利要求4所述的方法， 至分娩後約60天施用。
7. 根據權利要求4所述的方法， 至分娩後約30天施用。
8. 根據權利要求1所述的方法， 羊、綿羊、豬、駱駝和水牛組成的組(
9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述發情期出現在施用所述肽其中所述發情期出現在施用所述肽其中所述至少一種肽在分娩前約70其中所述至少 一種肽在分娩後立即其中所述至少 一種肽在分娩後立即其中所述至少 一種肽在分娩後立即其中所述家畜動物選自由奶牛、山一種酪蛋白書於生肽被應用於群中多頭泌乳家畜動物，因而同步化了所述群中泌乳動物的發情期,
10. 根據權利要求9所述的方法， 和豬群組成的組。
11. 根據權利要求9所述的方法， 畜動物。
12. 根據權利要求11所述的方法,
13. 根據權利要求11所述的方法:
14. 一種用於在群中誘導至少70 其中所述群選自由肉牛群、奶牛群其進一步包括授精所述群中多頭家其中授精後的受孕率是至少70%。 其中授精後的受孕率是至少75%。 ,受孕率的方法，其包括為所述群的多頭家畜動物施用有效量的衍生自酪蛋白的至少一種肽。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述受孕率是至少70%。
16. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述至少一種肽是磷酸肽。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自酪蛋白亞 型，所述酪蛋白亞型選自由aSl-酪蛋白、aS2-酪蛋白和p-酪蛋白組成 的組。
18. 根據權利要求16所述的方法，其中所述磷酸肽包括如SEQ ID NO:l闡述的胺基酸序列，其片段、類似物或衍生物。
19. 根據權利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aSl _酪蛋 白，其包括如SEQIDNO:3闡述的胺基酸序列，其片段、類似物或衍生物。
20. 根據權利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aS2 -酪蛋 白，其選自下述組含有如SEQIDNO:4闡述的胺基酸序列的肽，含有如 SEQIDNO:5闡述的胺基酸序列的肽，以及其類似物、衍生物或片段。
21. 根據權利要求17所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自(3 -酪蛋白， 其包括如SEQIDNO:2闡述的胺基酸序列，其類似物、衍生物或片段。
22. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至 少一種肽是通過水解酪蛋白獲得的。
23. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至 少一種肽是合成的肽。
24. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述至少一種肽施用到 泌乳動物的至少一個乳腺中。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述至少一種肽同時施用到 所述泌乳動物的全部乳腺中。
26. 根據權利要求24所述的方法，其中所述施用通過選自下述組的 方法進行才艮管內注射，經由附著到所述家畜乳房的貼片應用以及經由浸 泡所述家畜乳房應用。
27. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述至少一種肽施用至 少一次。
28. 根據權利要求1或14所述的方法，其中所述至少一種肽以約6 小時至約24小時的間隔施用1至5次。
29. —種用於誘導哺乳幼仔的無應激斷奶的方法，其包括在斷奶前施 用給泌乳動物至少一天的有效量的衍生自酪蛋白的至少一種肽。
30. 根據權利要求29所述的方法，其中所述泌乳動物選自由奶牛、 山羊、綿羊、豬、 -膝駝和水牛組成的組。
31. 根據權利要求29所述的方法，其中斷奶在分娩後約2周至約15 周開始。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中斷奶在分娩後約4周至約8 周開始。
33. 根據權利要求29所述的方法，其中所述幼仔和所述泌乳動物斷 奶後基本上沒有體重下降。
34. 根據權利要求29所述的方法，其中所述泌乳動物和所述幼仔斷 奶後的身體狀況評分與斷奶前基本一樣d
35. 根據權利要求29所述的方法，其中所述至少一種肽是磷酸肽。
36. 根據權利要求35所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自酪蛋白亞 型，所述酪蛋白亞型選自由aSl-酪蛋白、aS2-酪蛋白和卩-酪蛋白組成 的組。
37. 根據權利要求35所迷的方法，其中所述磷酸肽包括如SEQ ID NO:l闡述的胺基酸序列，其片段、類似物或衍生物。
38. 根據權利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aSl-酪蛋 白，其包括如SEQIDNO:3闡述的胺基酸序列，其片段、類似物或衍生物。
39. 根據權利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自aS2-酪蛋 白，其選自下述組含有如SEQIDNO:4闡述的胺基酸序列的肽，含有如 SEQ ID NO:5闡述的胺基酸序列的肽，以及其類似物、衍生物或片段。
40. 根據權利要求36所述的方法，其中所述磷酸肽衍生自卩-酪蛋白， 其包括如SEQ ID NO:2闡述的胺基酸序列，其類似物、衍生物或片段。
41. 根據權利要求29所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至少一 種肽是通過水解酪蛋白獲得的。
42. 根據權利要求29所述的方法，其中所述衍生自酪蛋白的至少一 種肽是合成的肽。
43. 根據權利要求29所述的方法，其中所述至少一種肽施用到所述 泌乳動物的至少 一個乳腺中。
44. 根據權利要求43所述的方法，其中所述至少一種肽同時施用到 所述泌乳動物的全部乳腺中。
45. 根據權利要求43所述的方法，其中所述施用通過選自下述組的 方法進行根管內注射，經由附著到所述家畜乳房的貼片應用以及經由浸 泡所述家畜乳房應用。
46. 根據權利要求29所述的方法，其中所述至少一種肽在斷奶前約1 天至約10天施用。
47. 根據權利要求46所述的方法，其中所述至少一種肽在斷奶前約3 天施用。
48. 根據權利要求29所述的方法，其中所述至少一種肽以約6小時 至約24小時的間隔施用1至10次。
49. 根據權利要求29所述的方法，其中所誘導的斷奶沒有不利地影 響所述泌乳動物和所述幼仔的舒適度。
全文摘要
本發明涉及用於控制家畜繁殖周期和斷奶的方法，具體而言涉及酪蛋白衍生肽用於誘導發情期並且縮短非發情期的間隔的用途，使得早期斷奶不會不利地影響家畜的健康。本發明進一步涉及家畜群的發情期同步化以及家畜管理計劃。
文檔編號A23J3/00GK101553127SQ200780021666
公開日2009年10月7日 申請日期2007年4月11日 優先權日2006年4月11日
發明者喬斯·馬裡奧·伊斯柯維奇 申請人:米勒尤迪斯公司;以色列農業及鄉村發展部農業研究組織