一種內皮抑素結合物及其製備方法
2023-05-10 07:03:56 1
專利名稱：一種內皮抑素結合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種血管生成抑制因子結合物及其製備方法，尤其涉及一種內皮抑素結合物及其製備方法，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
內皮抑素(Endostatin，ES)，又稱作內皮抑制素，是近幾年發現的一種內源性新生血管生成抑制因子，它是以抑制腫瘤新生血管形成從而阻斷其營養供應為作用機制的新型抗腫瘤藥物。由於內皮抑素是對血管內皮細胞有特異作用，對正常組織內的血管不會造成明顯的影響，因此，與傳統的治療方法(如化療、放療等)相比較具有如不產生抗藥性、沒有細胞毒性等許多優點。然而，其I期臨床試驗研究結果表明，內皮抑素應用於人體的有效劑量是每天300mg/m2，此劑量對於一種基因工程藥物來說是非常大的，如此大的劑量不但會對人體產生許多副作用，而且患者也難以承受巨額的用藥費用，從而成為內皮抑素應用於臨床的最大障礙。另外，內皮抑素體內半衰期短、穩定性差等缺點也都有礙於其在臨床上的應用。
如果能夠通過一定的手段增加內皮抑素的穩定性、延長其體內半衰期以減少給藥劑量或延長給藥周期，將會大大提高內皮抑素的治療效果，降低用藥費用，促進其在臨床上的應用。經檢索，利用肝素及其鹽類或聚乙二醇及其衍生物修飾內皮抑素製備內皮抑素結合物，以減少給藥劑量或延長給藥周期，實現提高內皮抑素療效的研究和應用還未見報導。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在於克服上述現有內皮抑素存在的對臨床應用所不利的缺點，提出一種新的理想的內皮抑素結合物及其製備方法，以解決現有內皮抑素臨床應用中所存在的問題。
本發明所述的內皮抑素結合物，由內皮抑素分子上的自由氨基結合肝素及其鹽類或聚乙二醇及其衍生物構成，其特徵是所述結合肝素及其鹽類的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是1.22％～54.13％；所述結合聚乙二醇及其衍生物的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是23.78％～76.92％；且一個內皮抑素分子可以結合1～8個肝素及其鹽類分子或聚乙二醇及其衍生物分子。
上述的內皮抑素結合物中所述內皮抑素分子的分子量為15000～30000道爾頓。
上述的內皮抑素結合物中所述肝素及其鹽類的分子量為500～50000道爾頓。
其中所述肝素及其鹽類的分子量優選為1500～30000道爾頓。
其中所述肝素及其鹽類優選指肝素鈉、肝素鈣、低分子肝素鈉及低分子肝素鈣之一。
上述的內皮抑素結合物中所述聚乙二醇及其衍生物的分子量為400～20000道爾頓。
其中所述聚乙二醇及其衍生物的分子量優選為800～10000道爾頓。
其中所述聚乙二醇的衍生物優選為單甲氧基聚乙二醇。
本發明所述內皮抑素結合物的製備方法，由以下步驟組成(1)將質量百分比濃度為1％～10％的肝素及其鹽類與質量百分比濃度為1％～13％的高碘酸鈉、溴化氰、氰尿醯氯之一進行活化反應；或者，將聚乙二醇及其衍生物與溴化氰、氰尿醯氯之一進行活化反應；其中選用肝素及其鹽類與高碘酸鈉進行活化反應時，可使肝素及其鹽類與高碘酸鈉在pH4.0～7.0，溫度0～4℃下，連續攪拌反應5～20小時，並用質量百分比濃度為2％～10％的亞硫酸氫鈉溶液滴定至顏色由無色澄清→渾濁狀紫紅色→最終為無色澄清，得活化的肝素及其鹽類溶液，待用；選用聚乙二醇及其衍生物與氰尿醯氯進行活化反應時，可使聚乙二醇及其衍生物與氰尿醯氯以重量比為(5～7)∶1的比例共同加入到無水苯中，常溫下攪拌10～16小時，過濾，用無水乙醚沉澱出產物，再用無水苯溶解沉澱，如此反覆多次，直至紫外掃描檢測無氰尿醯氯吸收止，常規真空乾燥，得白色固體粉末狀活化的聚乙二醇及其衍生物，待用；(2)將純化後的內皮抑素用碳酸鹽緩衝液溶解，加入上述活化的肝素及其鹽類溶液，在pH 8～10、溫度0～4℃條件下，緩慢攪拌進行修飾反應，反應10～24小時後，加甘氨酸終止修飾反應，得肝素及其鹽類-內皮抑素結合物；其中，上述內皮抑素與活化的肝素及其鹽類溶液以mg比mL計，按(14～16)∶1的量反應；或者，將上述活化後的聚乙二醇及其衍生物與純化後的內皮抑素，按摩爾比(40±2)∶1的比例溶於四硼酸鈉緩衝液中，在pH8～10、溫度0～4℃條件下，緩慢攪拌進行修飾反應，反應10～24小時後，加甘氨酸終止修飾反應，得聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物；其中，上述內皮抑素以內皮抑素蛋白含量進行摩爾計算；(3)採用凝膠層析法分別對上述肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物進行分離純化，再經冷凍乾燥，製得肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物純品。
上述內皮抑素結合物的製備方法中所述碳酸鹽緩衝液的濃度為0.1～0.3mol/L，優選濃度為0.3mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩衝液，所述四硼酸鈉緩衝液的濃度為1～10mmol/L，優選濃度為10mmol/L的四硼酸鈉緩衝液。
上述內皮抑素結合物的製備方法中所述凝膠層析法優選採用Sephadex G-50或Sephadex G-75柱對肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物進行分離純化。
本發明製得的低分子肝素及其鹽類-內皮抑素結合物和聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物與天然內皮抑素相比，不僅保留了內皮抑素原有的抑制血管內皮細胞增殖的作用，而且還具有抗原性低、半衰期長、穩定性高等特性，能夠更充分發揮其抑制腫瘤生長及其它抗血管生成作用，從而進一步促進了內皮抑素在臨床上的應用。
經活性研究證明，修飾後的內皮抑素具有明顯的抑制腫瘤生長、抑制血管內皮細胞增殖、抑制雞胚絨毛尿囊膜血管和鹼燒傷誘導的兔角膜毛細血管增生的作用，且抑制效果明顯優於未修飾的內皮抑素。
本發明的低分子肝素及其鹽類-內皮抑素結合物和聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物在一定程度上克服了內皮抑素在治療腫瘤的臨床應用中存在的用量過大的問題，並且，還可用於治療糖尿病視網膜毛細血管增生性疾病。
具體實施例方式
內皮抑素修飾物製備的關鍵是修飾劑的活化和修飾條件的控制。肝素和聚乙二醇及其衍生物活化的方法有多種，如高碘酸鈉活化法、溴化氰活化法、氰脲醯氯活化法等。在此僅舉以高碘酸鈉、溴化氰活化肝素和氰尿醯氯活化聚乙二醇及其衍生物並進一步製備肝素-內皮抑素結合物和聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物的例子。
實施例1聚乙二醇-內皮抑素結合物的製備(1)聚乙二醇的活化將聚乙二醇(分子量為6000道爾頓)18g、無水碳酸鈉2.2g、氰尿醯氯2.75g加入到無水苯75mL中，常溫下攪拌過夜，過濾，用無水乙醚沉澱出產物，再用無水苯溶解，如此反覆多次，直至紫外掃描檢測無氰尿醯氯吸收止，真空乾燥，得白色固體粉末，即為活化的聚乙二醇，置於4℃冰箱中密封保存。
(2)活化的聚乙二醇對內皮抑素的修飾將活化後的聚乙二醇與內皮抑素(以內皮抑素蛋白含量計)按摩爾比40∶1溶於pH9.0、10mmol/L的四硼酸鈉緩衝液中，4℃緩慢攪拌反應，反應15小時後加一定量的甘氨酸終止修飾反應，得聚乙二醇-內皮抑素結合物。
(3)聚乙二醇-內皮抑素結合物的純化對修飾反應物(聚乙二醇-內皮抑素結合物)用Sephadex G-50柱對其進行分離純化，再冷凍乾燥，即製得聚乙二醇-內皮抑素結合物純品。
實施例2單甲氧基聚乙二醇-內皮抑素結合物的製備(1)單甲氧基聚乙二醇的活化單甲氧基聚乙二醇(分子量為5000道爾頓)50g、氰尿醯氯5.5g、無水無水碳酸鈉10g、分子篩5A 5g溶於無水苯400mL中，常溫下攪拌過夜，離心去除碳酸鈉、分子篩5A等懸浮物，用無水乙醚沉澱出產物，再用無水苯400mL溶解。如此反覆多次，直至紫外掃描無氰尿醯氯吸收。真空乾燥，得白色固體粉末，即為活化的單甲氧基聚乙二醇，置於4℃冰箱中密封保存。
(2)活化的單甲氧基聚乙二醇對內皮抑素的修飾將活化後的單甲氧基聚乙二醇與內皮抑素(以內皮抑素蛋白含量計)按摩爾比40∶1溶於pH9.0、10mmol/L的四硼酸鈉緩衝液中，4℃緩慢攪拌反應，反應15小時後加一定量的甘氨酸終止修飾反應，得單甲氧基聚乙二醇-內皮抑素結合物。
(3)單甲氧基聚乙二醇-內皮抑素的純化對修飾反應物(單甲氧基聚乙二醇-內皮抑素結合物)用Sephadex G-50柱對其進行分離純化，再冷凍乾燥，即製得單甲氧基聚乙二醇-內皮抑素結合物純品。
實施例3肝素-內皮抑素結合物的製備(1)肝素的活化(高碘酸鈉活化法)稱取肝素(平均分子量為15000道爾頓)0.3g溶於雙蒸水4.5mL中，輕微攪拌下滴加12％的高碘酸鈉溶液0.5mL。此時測得溶液的pH值為5.40左右，用0.1mol/L的鹽酸調溶液的pH為5.0左右，4℃暗處緩慢攪拌活化20小時。
將活化反應20h的溶液自暗處取出，緩慢攪拌下滴加5％亞硫酸氫鈉溶液終止低分子肝素的活化反應，終止反應過程中溶液顏色變化為無色澄清→渾濁狀紫紅色→無色澄清，然後用2mol/L的碳酸鈉溶液調節該溶液的pH為9.0±0.2。
(2)活化的肝素對內皮抑素的修飾稱取純化後的內皮抑素90mg，用pH9.5、0.3mol/L的碳酸鹽緩衝液1mL溶解，加入pH 9.0±0.2的活化的肝素溶液6mL，4℃緩慢攪拌反應，反應18小時後，加一定量的甘氨酸終止修飾反應，得肝素-內皮抑素結合物。
在修飾過程中通過不同修飾反應時間的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、不同修飾反應時間自由氨基數變化測定、不同修飾反應時間內皮抑素活性變化測定來監測其修飾反應。
(3)肝素-內皮抑素結合物的純化對修飾反應物(肝素-內皮抑素結合物)用Sephadex G-50柱對其進行分離純化，再冷凍乾燥，即製得肝素-內皮抑素結合物純品。
實施例4低分子肝素-內皮抑素結合物的製備(1)低分子肝素的活化(溴化氰活化法)稱取低分子肝素(平均分子量為5000道爾頓)4g，溶於預冷的pH9.0、0.1mol/L的碳酸鹽緩衝液20mL中，加入溶有溴化氰1.60g冷的同種緩衝液20mL中，冰浴攪拌反應10min，反應期間加4mol/L氫氧化鈉保持pH10.4～10.8，將反應液傾入冷丙酮100mL中迅速沉澱，抽濾，用冷丙酮充分洗滌，抽乾。收集沉澱於25mL小燒杯加上述緩衝液7～8mL溶解，然後用2mol/L的碳酸鈉溶液調節該溶液的pH為9.0±0.2。
(2)活化的低分子肝素對內皮抑素的修飾稱取純化後的內皮抑素90mg，用pH9.5、0.3mol/L的碳酸鹽緩衝液1mL溶解，加入pH 9.0±0.2的活化的低分子肝素溶液6mL，4℃緩慢攪拌反應，反應17小時後，加一定量的甘氨酸終止修飾反應，得低分子肝素-內皮抑素結合物。
在修飾過程中通過不同修飾反應時間的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、不同修飾反應時間自由氨基數變化測定、不同修飾反應時間內皮抑素活性變化測定來監測其修飾反應。
(3)低分子肝素-內皮抑素結合物的純化對修飾反應物(低分子肝素-內皮抑素結合物)用Sephadex G-75柱對其進行分離純化，再冷凍乾燥，即製得低分子肝素-內皮抑素結合物純品。
權利要求
1.一種內皮抑素結合物，由內皮抑素分子上的自由氨基結合肝素及其鹽類或聚乙二醇及其衍生物構成，其特徵是所述結合肝素及其鹽類的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是1.22％～54.13％；所述結合聚乙二醇及其衍生物的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是23.78％～76.92％；且一個內皮抑素分子可以結合1～8個肝素及其鹽類分子或聚乙二醇及其衍生物分子。
2.如權利要求1所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述內皮抑素分子的分子量為15000～30000道爾頓。
3.如權利要求1所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述肝素及其鹽類的分子量為500～50000道爾頓。
4.如權利要求3所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述肝素及其鹽類的分子量為1500～30000道爾頓。
5.如權利要求3或4所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述肝素及其鹽類是指肝素鈉、肝素鈣、低分子肝素鈉及低分子肝素鈣之一。
6.如權利要求1所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述聚乙二醇及其衍生物的分子量為400～20000道爾頓。
7.如權利要求6所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述聚乙二醇及其衍生物的分子量為800～10000道爾頓。
8.如權利要求6或7所述的內皮抑素結合物，其特徵是所述聚乙二醇衍生物為單甲氧基聚乙二醇。
9.權利要求1所述內皮抑素結合物的製備方法，由以下步驟組成(1)將質量百分比濃度為1％～10％的肝素及其鹽類與質量百分比濃度為1％～13％的高碘酸鈉、溴化氰、氰尿醯氯之一進行活化反應；或者，將聚乙二醇及其衍生物與溴化氰、氰尿醯氯之一進行活化反應；其中選用肝素及其鹽類與高碘酸鈉進行活化反應時，可使肝素及其鹽類與高碘酸鈉在pH4.0～7.0，溫度0～4℃下，連續攪拌反應5～20小時，並用質量百分比濃度為2％～10％的亞硫酸氫鈉溶液滴定至顏色由無色澄清→渾濁狀紫紅色→最終為無色澄清，得活化的肝素及其鹽類溶液，待用；選用聚乙二醇及其衍生物與氰尿醯氯進行活化反應時，可使聚乙二醇及其衍生物與氰尿醯氯以重量比為(5～7)∶1的比例共同加入到無水苯中，常溫下攪拌10～16小時，過濾，用無水乙醚沉澱出產物，再用無水苯溶解沉澱，如此反覆多次，直至紫外掃描檢測無氰尿醯氯吸收止，常規真空乾燥，得白色固體粉末狀活化的聚乙二醇及其衍生物，待用；(2)將純化後的內皮抑素用碳酸鹽緩衝液溶解，加入上述活化的肝素及其鹽類溶液，在pH 8～10、溫度0～4℃條件下，緩慢攪拌進行修飾反應，反應10～24小時後，加甘氨酸終止修飾反應，得肝素及其鹽類-內皮抑素結合物；其中，上述內皮抑素與活化的肝素及其鹽類溶液以mg比mL計，按(14～16)∶1的量反應；或者，將上述活化後的聚乙二醇及其衍生物與純化後的內皮抑素，按摩爾比(40±2)∶1的比例溶於四硼酸鈉緩衝液中，在pH 8～10、溫度0～4℃條件下，緩慢攪拌進行修飾反應，反應10～24小時後，加甘氨酸終止修飾反應，得聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物；其中，上述內皮抑素以內皮抑素蛋白含量進行摩爾計算；(3)採用凝膠層析法分別對上述肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物進行分離純化，再經冷凍乾燥，製得肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物純品。
10.如權利要求9所述內皮抑素結合物的製備方法，其特徵是所述碳酸鹽緩衝液的濃度為0.1～0.3mol/L；所述四硼酸鈉緩衝液的濃度為1～10mmol/L；所述凝膠層析法採用Sephadex G-50或Sephadex G-75柱對肝素及其鹽類-內皮抑素結合物或聚乙二醇及其衍生物-內皮抑素結合物進行分離純化。
全文摘要
本發明公開了一種內皮抑素結合物及其製備方法，由內皮抑素分子上的自由氨基結合肝素及其鹽類或聚乙二醇及其衍生物構成，其中所述結合肝素及其鹽類的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是1.22％～54.13％；所述結合聚乙二醇及其衍生物的內皮抑素分子上的自由氨基的修飾率是23.78％～76.92％；且一個內皮抑素分子可以結合1～8個肝素及其鹽類分子或聚乙二醇及其衍生物分子。本發明的內皮抑素結合物與天然內皮抑素相比，不僅保留了內皮抑素原有的抑制血管內皮細胞增殖的作用，而且具有抗原性低、半衰期長、穩定性高等特性，能夠更充分發揮其抑制腫瘤生長及其它抗血管生成作用，便於其在臨床上的應用。
文檔編號A61P3/10GK1876186SQ20061004387
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月26日 優先權日2006年4月26日
發明者王鳳山, 楊盛林, 王曉燕, 曹吉超, 馬春紅, 孫汶生, 譚海寧 申請人:山東大學