一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法
2023-05-10 02:45:41
一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性檢測方法，包括如下步驟：(1)α-丁酮酸對照品溶液的製備；(2)供試品溶液的製備；(3)酶解反應；(4)α-丁酮酸含量的測定；本發明是以藥物質量分析的標準，增加α-丁酮酸作為對照物質，通過方法學的驗證，得到一種精密度很好的MGL酶活的檢測方法，採用該方法可以在半自動或全自動的紫外分光光度計上使用，而且靈敏度高，特異性強，操作簡單，因而可以得到切實的推廣使用。
【專利說明】-種甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種甲硫氨酸裂解酶酶活性檢測方 法。
【背景技術】
[0002] 甲硫氨酸Y-裂解酶（MethionineY-lyase;E4. 4. 1. 11)簡稱MGL，是一種磷酸批 哆醛（PLP)依賴酶，屬於蛋白家族。它能催化L-甲硫氨酸的消除反應生成甲硫醇、 氨和a-丁酮酸。此外，MGL還能催化L-半胱氨酸及其衍生物的a，消除反應及@取 代反應。MGL是生物體內甲硫氨酸代謝調控的關鍵酶，在含硫胺基酸的代謝中發揮著重要的 作用。腫瘤細胞對甲硫氨酸的需求非常旺盛，缺乏該胺基酸的情況下多種腫瘤細胞生長停 止，而正常的細胞在甲硫氨酸缺乏下仍然正常。有學者在體外細胞培養試驗及動物體內試 驗證明MGL對肺癌、結腸癌、腎癌、等甲硫氨酸依賴性腫瘤具有抗腫瘤作用，並通過I期臨 床試驗，證明其具有用於臨床的安全性和可靠性。與傳統化療方法相比，MGL作為新型抗腫 瘤藥物具有腫瘤特異性高，毒副作用小等特點，顯示出巨大的臨床應用潛力。作為一種極具 潛力開發成抗腫瘤藥物的酶類，其最重要的酶活力指標的準確測定變得十分重要。
[0003] 目前，國內外檢測MGL酶活力的方法主要有兩種：一是採用檢測生成物氨的方法 測定酶活，即在MGL作用於底物後產生氨，依據a-酮戊二酸+NH/+NADH-穀氨酸+NAD+反 應中NADH的消耗速率與NH3生成濃度呈正比的原理，利用自動生化監測分析儀直接測定反 應液中氨的含量，計算出酶活；二是採用檢測生成物a- 丁酮酸的方法測定酶活，即在MGL 作用於底物產生a- 丁酮酸，a- 丁酮酸與3-甲基-2-苯並噻唑酮腙（MBTH)反應，測定生 成物的吸光值，用分光光度法計算a- 丁酮酸的量，從而計算酶活。
[0004] 直接檢測氨的方法測定MGL酶活力，方便省時，但由於本底氨濃度的原因，使測定 精度受到影響。試驗發現在MGL酶液、底物溶液、水中均含氨，其中以酶液中氨含量相對較 高，故測出的酶活力往往偏高。通過檢測a-丁酮酸的生成量來計算酶活的方法，雖較好 地解決了本底氨對酶活性測試的幹擾，使得測量值比較準確，是目前文獻裡最通用的MGL 酶活測定方法。但是酶活方法本身的影響因素多且複雜，如果僅依據現有文獻報導的方法 進行酶活測定來進行質量研究，由於沒有對照品的參照，顯然不能滿足藥品質量分析中對 精密度要求高的方法學要求。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於克服現有技術中缺乏對照品、檢測方法中精密度低的缺陷，提 供了一種甲硫氨酸裂解酶酶活性檢測方法；本發明增加a-丁酮酸作為對照物質，通過 方法學的驗證，得到了一種精密度高的甲硫氨酸裂解酶酶活性檢測方法。
[0006] 一種甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，包括如下步驟：
[0007] SI:a_ 丁酮酸對照品溶液的製備
[0008] 稱取a- 丁酮酸，用水配製成〇. 000025?0. 00025mol/L的溶液，作為對照品溶 液；
[0009]S2 :甲硫氨酸Y_裂解酶酶供試品溶液的製備
[0010] 稱取供試品，加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液， 配製成供試品溶液；
[0011] S3:酶解反應
[0012] 取至少兩支離心管，其中一支離心管編號為N0 ;向其餘各離心管中加入等量的底 物溶液和磷酸吡哆醛溶液，並於37°C預熱；然後向離心管N0中加入體積為VI的三氯乙酸 溶液，同時向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液，然後將這些離心管置於37°C水 浴中反應；反應結束後立即向離心管N0中加入體積為V2的供試品溶液，同時向其它離心管 中各加入體積為VI的三氯乙酸溶液，搖勻；將離心管N0作為空白反應液，其餘離心管作為 酶解反應液；
[0013] 其中，所述底物溶液為由KH2P04-K2HP04緩衝液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液；
[0014]S4:a-丁酮酸含量的測定
[0015]S41:量取步驟S3所得的空白反應液體積為V3置於離心管中，然後加入總體積為 V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；
[0016]S42:量取步驟S3所得的酶解反應液體積為V3置於離心管中，然後加入總體積為 V4的乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用；
[0017]S43:量取體積為V3的水置於離心管中，然後加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和 3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，作為空白對照液，備用；
[0018] 將上述各離心管放置於50°C水浴中進行反應，然後冷卻降溫，採用紫外-可見分 光光度法，在315?325nm波長處，分別測定空白反應液、酶解反應液、a- 丁酮酸對照品溶 液的吸光度AO、At、As，並根據如下公式計算反應液中酶的效價：
【權利要求】
1. 一種甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟： 51. a - 丁酮酸對照品溶液的製備 稱取a - 丁酮酸，用水配製成〇. 000025?0. 00025mol/L的溶液，作為對照品溶液； 52 :供試品溶液的製備 稱取供試品，加酶稀釋液、二硫蘇糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配製 成供試品溶液； 53 :酶解反應 取至少兩支離心管，其中一支離心管編號為NO ;向其餘各離心管中加入等量的底物溶 液和磷酸吡哆醛溶液，並於37°C預熱；然後向離心管NO中加入體積為Vl的三氯乙酸溶液， 同時向其它離心管中各加入體積為V2的供試品溶液，然後將這些離心管置於37°C水浴中 反應；反應結束後立即向離心管NO中加入體積為V2的供試品溶液，同時向其它離心管中各 加入體積為Vl的三氯乙酸溶液，搖勻；將離心管NO作為空白反應液，其餘離心管作為酶解 反應液； 其中，所述底物溶液為由KH2PO4-K2HPO4緩衝液和L-甲硫氨酸組成的混合溶液； 54. a - 丁酮酸含量的測定 541 :量取步驟S3所得的空白反應液體積為V3置於離心管中，然後加入總體積為V4的 乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用； 542 :量取步驟S3所得的酶解反應液體積為V3置於離心管中，然後加入總體積為V4的 乙酸鈉溶液和3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，備用； 543 :量取體積為V3的水置於離心管中，然後加入總體積為V4的乙酸鈉溶液和3-甲 基-2-苯並噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物溶液，搖勻，作為空白對照液，備用； 將上述各離心管放置於50°C水浴中進行反應，然後冷卻降溫，採用紫外-可見分光光 度法，在315?325nm波長處，分別測定空白反應液、酶解反應液、a - 丁酮酸對照品溶液的 吸光度AO、At、As，並根據如下公式計算反應液中酶的效價：
其中，M為反應常數，M = 2. 3C，C為a - 丁酮酸對照品溶液的濃度； F為實際稱樣量製備的酶液濃度與計算稱樣量製備的酶液濃度的比值； 取樣量為MGL酶的實際稱樣量。
2. 根據權利要求1所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步驟 S2中的所述供試品為甲硫氨酸Y-裂解酶或甲硫氨酸Y-裂解酶凍乾粉製劑。
3. 根據權利要求1所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步驟 S2中的所述供試品溶液中酶的配置濃度為0. 0575?0. 575U/ml。
4. 根據權利要求3所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步驟 S2中的所述供試品溶液中酶的配置濃度為0. 3U/ml，所述M的值為0. 345。
5. 根據權利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步 驟S2中的酶稀釋液為pH = 8. 0、濃度為lOOmmol/L的KH2PO4-K2HPO4緩衝液。
6. 根據權利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步 驟S2中的二硫蘇糖醇溶液的質量體積分數為0. 01% :乙二胺四乙酸溶液的濃度為lmmol/ L ;所述磷酸吡哆醛溶液的濃度為0. 01mmol/L。
7. 根據權利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步 驟S3中的KH2PO4-K2HPO4緩衝液為pH = 8. 0、濃度為lOOmmol/L的溶液，所述L-甲硫氨酸 的濃度為25mmol/L ;所述磷酸吡哆醛的濃度為0. Olmmol/L ;所述三氯乙酸溶液的質量體積 分數為50%。
8. 根據權利要求1或2所述的甲硫氨酸Y-裂解酶酶活性的檢測方法，其特徵在於，步 驟S4中的乙酸鈉溶液為pH = 5. 0、濃度為lmol/L的溶液；所述3-甲基-2-苯並噻唑啉酮 腙鹽酸鹽水合物溶液的質量體積分數為0. 1%。
【文檔編號】G01N21/31GK104330370SQ201410579602
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】黎洪, 王海兵, 胡海豔, 黃魁英, 謝鵬, 夏楓耿, 高建勝, 司徒少金, 陳禧翎 申請人:廣州白雲山明興製藥有限公司, 廣州市微生物研究所