一種全程定量檢測c-反應蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒的製作方法

2023-04-28 08:17:11 3

專利名稱：一種全程定量檢測c-反應蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗領域，特別涉及一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒。
背景技術：
C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)是由肝臟合成的一種急性時相反應蛋白，由5個完全相同的非糖基化的亞單位非共價聯結，每個亞單位相對分子質量23017，由 206個胺基酸殘基組成。它具有多種生物活性，被認為最敏感的炎症指標之一。CRP不僅對感染性疾病、妊娠期糖尿病的病程檢測及預後判斷評估、抗生素療效等具有重要的臨床應用前景，同時亦是心血管疾病最有力的預測因子之一。CRP在健康的人體中只含有微量，在新的刺激出現前，其濃度可保持長期穩定，半衰期長(約18 20小時)，且不受性別、食物或晝夜的影響。當出現感染性疾病，血清中CRP在感染發生後5 8小時即開始升高，48小時達到峰值，且高峰值可達正常的數百倍。隨著感染控制它可在M 48小時迅速下降，1周內恢復正常。CRP的水平和持續時間與感染程度呈正相關，當CRP持續升高或再度升高時，提示臨床應重視病情的變化。近年來，許多前瞻性的流行病學研究發現，CRP在健康者未來發生心血管疾病風險評估上，是個獨立且強而有力的預測指標。目前，已有約20多篇的相關文獻指出，在患有心血管疾病的風險方面(如冠狀動脈疾病、心肌梗塞、腦中風、周邊血管疾病及突發性心猝死等)，CRP值最高的族群相對於較低的族群，其相對危險性高出2 4倍。在心血管疾病的診斷中，低水平的CRP (0. 1 10mg/L)被認為與其密切相關，是心血管炎症病變的生物標誌物。這個水平的C-反應蛋白又被稱為超敏C-反應蛋白(hs-CRP)，通常認為hs-CRP 3mg/L時為高危險性。此夕卜，CRP亦可作為偵測糖尿病的風險。當其濃度大於:3mg/L時，得糖尿病的機率是CRP小於lmg/L族群的 4 6倍。臨床上常規測定CRP的方法主要包括放射免疫法、免疫比濁法、酶聯免疫吸附法及膠體金免疫層析等。這些方法具有各自的特點和不足放射免疫法結果較準確，線性範圍較寬，但是操作繁瑣，耗時，此外放射性標記物會對操作者產生危害，對環境造成汙染，已逐漸被其它方法所代替。免疫比濁法已被廣泛應用，但是其檢測靈敏度較低，且通常需要自動生化分析儀等大型儀器配合，操作耗時長，所需樣本量大。酶聯免疫吸附法具有方法間結果差異大，線性範圍窄的缺點，並且不適合單人份或者小批量的檢測，對基層醫院、診所中的推廣應用具有較大限制。膠體金免疫層析具有快速、便捷、價廉及適合單人份操作等優點， 但是只能定性或半定量檢測，當樣品中含有目標分析物的濃度較低時，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結果，容易出現誤判，靈敏度低。中國專利號ZL 200720140930. 2公開了一種C-反應蛋白顏色顆粒診斷試紙，通過顏色顆粒檢測臨床樣本(全血/血清/血漿)中的C-反應蛋白，但該專利僅能進行定性檢測，而不能定量分析，靈敏度低，當遇到異常樣本，還需使用其它方法進行覆核，不僅費時而且會增加患者的就醫負擔，很難獲得廣泛的市場推廣。中國專利申請號201010236071. 3披露了一種人C-反應蛋白膠體金免疫層析法定量檢測試紙，依據膠體金的光學性能對樣品中的C-反應蛋白進行定量檢測，該試紙的檢測範圍為5 200mg/L。然而，對於心血管疾病而言，當C-反應蛋白含量低於3mg/L時即具有危險性，此試紙的靈敏度卻並不能滿足條件。中國專利申請號201010550610. 0公開了一種全程定量檢測C反應蛋白的免疫層析試紙條及其製備方法，該專利採用螢光膠乳微粒標記CRP，並進行免疫層析，實現對CRP 的全程定量檢測。該專利所用螢光膠乳微粒是將螢光素與0. 01 1 μ m的膠乳微球共價結合而得。所用螢光素屬於有機螢光染料。量子點(quantum dots,QDs)也稱半導體納米晶體，可以理解為粒徑小於或接近激子波爾半徑的半導體納米顆粒，存在著特殊的物理性質。與有機螢光染料相比，它具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄、螢光壽命長、表面修飾多功能化及穩定性好等眾多優點。 在螢光檢測領域具有取代傳統有機螢光染料的潛力，已成為新一代生物螢光標記物。因此，基於量子點的諸多優勢，需要研製一種利用量子點來全程定量檢測C-反應蛋白的方法，彌補現有技術中檢測C-反應蛋白靈敏度低、檢測範圍窄、操作繁瑣及定量不準確等不足，進而實現既可用於感染性疾病的檢測或療效觀察，又可監測評估心腦血管疾病。

發明內容
本發明要解決的技術問題為針對現有技術中檢測C-反應蛋白靈敏度低、檢測範圍窄的缺點，提供了一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒。為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將C-反應蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應C-反應蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現C-反應蛋白的定量檢測。本發明提供的一種全程定量檢測CRP的螢光免疫層析的方法，是一種以量子點為螢光信號，採用雙色標記技術，在免疫層析試紙條上實現CRP快速靈敏檢測的方法。本發明全程定量檢測CRP的螢光免疫層析方法能夠解決現有螢光免疫層析技術
5中背景與信號難區分、靈敏度低、螢光定量方法不明確的不足和缺陷，可實現對微量樣品的檢測。由於量子點螢光受激發光幹擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統染料和有色標記物檢測方法的10 1000倍。本發明採用化學交聯或生物分子間特異性作用將CRP的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，其中所述特異性抗體為抗CRP的單克隆抗體或多克隆抗體。本發明中的化學交聯為當量子點表面存在活性基團時，可與特異性抗體直接反應，不需用化學交聯劑；反之，則需採用化學交聯劑將抗體與量子點相偶聯。其中，化學交聯劑包括1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及戊
二醛等。作為優選，在本發明的一個實施例中，採用EDC/NHS交聯法對量子點進行蛋白修飾。其一般步驟為將純化後的量子點溶液與EDC和NHS混合，然後加入一定量的蛋白質， 以緩衝液作為反應介質，培育4小時，加入甘氨酸封閉，並以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到蛋白修飾的量子點螢光納米顆粒。生物分子間特異性作用包括生物素-親和素系統和抗原-抗體系統。作為優選， 在本發明的另一個實施例中，採用生物素-親和素系統的結合方式對標記物進行量子點修飾，該結合方式具有放大信號的作用。具體為將生物素連接到蛋白質分子表面，通過親和素-生物素間的相互作用，將蛋白質分子偶聯到鏈黴親和素修飾量子點的表面。為了提高信號與背景的區分度，本發明選用發射光波長為550 1300nm的量子點。因在紫外照射下，層析膜、底板和扣卡的螢光強度在550nm以下遠強於550nm以上，從而對低濃度CRP檢測時產生一定的影響，故優選發射波長大於550nm的量子點。此外，層析膜、底板和扣卡在近紅外區域(750 1300nm)螢光強度極弱，結合量子點合成技術，優選近紅外波長的量子點(750 1300nm)進一步提高靈敏度。本發明所用量子點包含單一化合物形成的量子點或是幾種化合物組裝成的複合物量子點，且量子點具有較強的光穩定性。形成量子點的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。其中，質控分子修飾的量子點與CRP抗體修飾的量子點可選用相同發射波長的量子點。但在本發明中，為了減弱質控分子修飾的量子點對定量帶及背景信號的影響，採用雙色標記技術，即選用兩種發射波長不同的量子點分別標記質控分子和抗體。作為優選，在本發明的一個實施例中，標記墊中CRP抗體修飾的量子點發射波長為650nm，質控分子修飾的量子點發射波長為570nm。作為優選，在本發明的另一個實施例中，標記墊中CRP抗體修飾的量子點發射波長為900nm，質控分子修飾的量子點發射波長為600nm。作為優選，在本發明的實施例中，使用有機相方法合成570nm、600nm和650nm的 CdSe/aiS，並把量子點由脂溶性轉為水溶性，此過程中量子點螢光無明顯變化；使用水相方法合成900nm的hAs。為了降低對量子點螢光信號的影響，本發明採用弱螢光的層析膜、低螢光的底板以及低螢光的扣卡，從而保證獲得高螢光信背比，能良好區分信號與背景，進而提高檢測靈敏度。作為優選，在本發明的實施例中，底板為黑色，表面附有不乾膠，且扣卡、層析膜、 底板及不乾膠均不含有螢光劑。本發明實施例中螢光免疫層析試紙條由樣品墊、標記墊、過濾膜、層析膜、吸水墊和底板組成，如圖1所示。在標記墊上固定有CRP特異性抗體修飾的量子點，以及質控分子修飾的量子點。在試紙條層析膜上分別設有定量帶和兩條質控帶，其中定量帶固定有對應 CRP的與上述標記墊中特異性抗體不同抗原表位的特異性抗體，質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子。本發明定量帶是判定樣品中CRP含量的主要指標，並且受質控帶螢光信號強度校正，以提高定量準確度。此外，通過增加定量帶的條數，可擴大試紙條的檢測範圍，避免出現 HOOK效應。在本發明的一個實施例中，發明人所選用的樣品為血清，且樣品進一步包含全血和血漿。當樣品為全血時，螢光免疫層析試紙條還包括在樣品墊與層析膜之間設置的過濾膜，用於凝固、過濾細胞，該過濾膜可分別與標記墊和層析膜直接毛細作用接觸，如圖1所示，也可與樣品墊和標記墊直接毛細作用接觸，如圖3所示。其中，過濾膜還可以與樣品墊合併為同一結構，同時擁有樣品收集、釋放及過濾的作用。本發明實施例採用預潤免疫層析方法對待測樣品中的CRP進行定量檢測。其中預潤免疫層析為滴加一定體積的緩衝液到層析膜上，潤溼一定時間後，將樣品加入樣品墊中，然後樣品沿層析膜向吸水墊方向層析運動。預潤的目的是預潤溼層析膜，封閉非特異性結合位點，以使量子點標記物均勻通過層析膜，減少在層析膜上的非特異性吸附，並減緩樣品的層析速度，從而提高特異性結合效率。其中滴加緩衝液體積一般為20 80μ 1，潤溼時間為30秒 2分鐘，而樣品層析時間通常為8 25分鐘。本發明的預潤免疫層析包括將緩衝液直接或間接滴加於層析膜。當將緩衝液間接滴加於層析膜時，螢光免疫層析試紙條還包括潤溼墊和連接墊，其中潤溼墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤溼墊和吸水墊以毛細作用接觸。緩衝液通過潤溼墊到達層析膜。本發明的緩衝液為ρΗ 7. 2 11的鹼性緩衝液，且該鹼性緩衝液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性劑。其中，表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優選，在本發明的實施例中使用包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。本發明的檢測用螢光定量儀包含激發光源模塊、濾光模塊、光電轉換模塊、控制分析模塊以及軟體系統。其中激發光源模塊包含光源及聚光裝置，該光源為發光二極體或雷射二極體，且波長位於300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應量子點的螢光信號。光電轉換模塊包括圖像傳感器或者光電倍增管。層析結束後，在光源激發下，試紙條產生的螢光信號經濾光模塊濾除雜散光及背景螢光，到達光電轉換模塊，獲得數位訊號。其中所獲質控帶與定量帶的螢光信號強度具有一定的相關性，主要影響因素包括溫度、溼度、基質等。本發明檢測結果的判定方法如果質控帶螢光信號強度超出螢光定量儀內部設定的可接受值，說明檢測結果無效；在檢測結果有效前提下，定量帶與質控帶螢光信號強度的比值越高，表示樣品中目標檢測物的濃度越高，反之越低。本發明採用螢光定量儀檢測一系列不同濃度的標準品，繪製標準曲線。其中標準曲線為標準品系列濃度(c)與所對應的校正螢光信號強度(F)的關係曲線，關係式為F = f (c)，校正螢光信號強度為F= α Fi^i/FIi^，其中α為校正係數，受溫度、溼度和基質等影響。然後檢測樣品，依據標準曲線可獲得樣品中CRP的濃度。本發明提供了一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡
(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，如圖4所示。該試劑盒採用直接預潤免疫層析方法。 扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(12)，且具低螢光特性或不含螢光劑。本發明實施例中的直接預潤免疫層析試紙條，其結構包括樣品墊(1)、標記墊 O)、層析膜G)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質控帶(8)和定量帶(7)。當進行全血樣品檢測時，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結構如圖1所示，其中樣品墊(1)、標記墊O)、過濾膜(3)、層析膜(4)和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上，樣品墊⑴位於上樣孔 (11)的下方，且連接於標記墊0)，標記墊( 連接於過濾膜(3)，過濾膜C3)連接於層析膜 G)，層析膜(4)上固定有兩條質控帶(8)和兩條定量帶(7)，且質控帶(8)位於定量帶(7) 的兩側，層析膜(4)位於視窗(12)的下方，層析膜(4)連接於吸水墊(5)。在對試紙條預潤時，可將緩衝液直接滴加於窗口(1 內的層析膜上，其中滴加位置為質控帶(8)的兩側，可靠近樣品墊一側，亦可靠近吸水墊一側。本發明還提供了一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，如圖5所示。該試劑盒採用間接預潤免疫層析方法。扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤溼孔
(14)，且具低螢光特性或不含螢光劑。本發明實施例中的螢光免疫層析試紙條結構如圖2所示，其包含樣品墊(1)、標記墊O)、層析膜、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊( 和底板(6)。層析膜(4)包含質控帶(8)和定量帶(7)。其中樣品墊(1)、標記墊(2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10) 和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上，樣品墊(1)位於上樣孔(11)的下方，且連接於標記墊 O)，標記墊( 連接於層析膜，層析膜(4)上固定有兩條質控帶(8)和兩條定量帶(7)， 且質控帶(8)位於定量帶(7)的兩側，層析膜(4)位於視窗(1 的下方，層析膜(4)連接於潤溼墊(9)，且潤溼墊(9)位於潤溼孔(14)的下方，潤溼墊(9)連接於連接墊(10)，連接墊(10)連接於吸水墊(5)。進行全血樣品層析時，試紙條還包括過濾膜(3)，具體結構如圖3所示，其中試紙條包含樣品墊(1)、標記墊O)、過濾膜(3)、層析膜、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊 (5)和底板(6)。過濾膜(3)連接於樣品墊⑴與標記墊(2)之間。本發明構建的間接預潤免疫層析試紙條，其特徵是，增加了潤溼墊(9)和連接墊 (10)，其中潤溼墊分別與層析膜(4)和連接墊(10)毛細作用接觸，用於緩衝液的滴加，以潤溼層析膜G)，並減少非特異性吸附。
連接墊(10)分別與潤溼墊(9)和吸水墊(5)毛細作用接觸，具有緩慢的吸水速度，以減少潤溼時的吸水量，促使緩衝液充分潤溼層析膜；當加樣品層析時，吸水墊(5) 可通過連接墊(10)吸水，促使樣品層析。試紙條的層析膜(4)具有弱螢光特性或不含螢光劑，其螢光噪聲在大於550nm時很弱，以減少對低濃度CRP檢測的影響。本發明的主要優點如下1)臨床上常規CRP檢測試劑盒，其最低檢測限一般為3 5mg/L，靈敏度較低，無法對:3mg/L以下水平的CRP含量進行準確測定，因此無法作為有效預測評估心腦血管疾病的危險指示。而對於臨床上高敏CRP檢測試劑盒而言，測定範圍上限較低，僅為100mg/L，對高濃度水平下的CRP含量測定具有一定的局限性，以致無法用於感染性疾病、抗生素療效方面的診斷或觀測。本發明所述試劑盒結合兩者優勢，報告範圍可達到0. 05 250mg/L，即可同時對感染性疾病、抗生素療效及心腦血管疾病等診斷評估。2)本發明採用量子點作為特異性抗體的螢光標記物，與有機螢光染料相比，具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄、螢光壽命長、表面修飾多功能化及穩定性好等優勢。 本發明優選了 550 1300nm的量子點，且質控分子和特異性抗體修飾的量子點選用兩種不同發射波長的量子點，以降低非特異性吸附，提高檢測靈敏度。3)本發明試劑盒組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大於550nm時均具有低的螢光特性，以減少對量子點螢光信號獲取的影響，從而保證獲得高的螢光信背比，進而達到提高靈敏度的目的。4)本發明全程定量檢測CRP的螢光免疫層析方法可利用潤溼層析技術，減少非特異性吸附，增強特異性結合，進而提高檢測靈敏度，有利於樣品中CRP含量極低時的準確定量。5)本發明方法與常規膠體金免疫層析相比，具有標記穩定性好、非特異性低、靈敏度高、線性範圍寬以及定量準確等優勢。


圖1為直接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶；圖2為間接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶，9為潤溼墊，10為連接墊；圖3為間接預潤螢光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為標記墊， 3為過濾膜，4為層析膜，5為吸水墊，6為底板，7為定量帶，8為質控帶，9為潤溼墊，10為連接墊；圖4為直接預潤螢光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質控帶，7為定量帶。圖5為間接預潤螢光免疫層析試劑盒示意圖，其中13為扣卡，11為上樣孔，12為視窗，8為質控帶，7為定量帶，14為潤溼孔。
具體實施方式
本發明公開了一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析方法及其試劑盒， 本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明的技術方案為步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將C-反應蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為550 1300nm ；步驟2)將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應C-反應蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現C-反應蛋白的定量檢測。本發明螢光免疫層析的原理和檢測方法為採用螢光免疫層析技術及雙抗體夾心法原理全程定量檢測樣品(全血、血清或血漿)中的C-反應蛋白(CRP)的含量。檢測時，首先滴加緩衝液將層析膜潤溼，然後將樣品加入到上樣孔中，樣品流經標記墊時與量子點標記物相混合，並沿著層析膜向吸水墊方向毛細運動，分別流經層析膜上的定量帶及質控帶。 若樣品中含有CRP，則與量子點表面的CRP抗體相結合，當層析至定量帶時，會被預先包被於該條帶的抗體所捕獲，從而構成雙抗體夾心複合物。光源激發下，採用螢光定量儀可獲取定量帶和質控帶的螢光信號強度，依據螢光定量儀獲取的標準曲線，進而可分析出樣品中含有CRP的濃度。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1 以化學交聯方式將抗體修飾於量子點並採用直接預潤免疫層析對CRP 的定量檢測(一 )量子點與抗體的修飾將發射波長為650nm的量子點與lmg/mL的CRP單克隆抗體混合，並在新鮮配製的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，lmg/mL)和碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，lmg/mL)作用下室溫反應 4 證，加入lmol/L甘氨酸封閉，並用色譜柱或層析柱分離純化，得到CRP單克隆抗體修飾的量子點。同理得到兔IgG修飾的量子點。其中CRP抗體修飾的量子點的螢光發射波長為 650nm，兔IgG修飾的量子點的螢光發射波長為570nm。( 二)試劑盒的構建以1 1的比例混合兩種量子點標記物，並加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗
10糖(1 15% )以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0. 05 2%之間，隨後均勻噴塗在標記墊上，37°C乾燥後密封，4°C下保存。如圖1所示，組裝定量檢測CRP的螢光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標記墊 O)、過濾墊(3)、層析膜0)、吸水墊( 組成，順次粘貼於黑色底板(6)上。其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為樣品收集區；標記墊中含有CRP抗體修飾的量子點以及兔 IgG修飾的量子點；層析膜上包含定量帶(7)和質控帶(8)，定量帶和質控帶的間隔R為 3mm彡R彡8mm，且定量帶(7)固定有區別於標記墊中CRP抗體的另一抗原表位CRP抗體， 質控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位於定量帶的兩側。組裝好後，按照要求切割為所需寬度， 並置於扣卡內，加入乾燥劑封裝，與緩衝液共同構建為螢光免疫層析試劑盒。(三)樣品的檢測A)將CRP抗原標準品用正常人全血作為稀釋液分別配製為Omg/L和200mg/L濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的CRP標準品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和05的比例進行混合；C)在層析膜上滴加20μ L的緩衝液，該緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的 PH 9. O的磷酸緩衝液，層析反應30s ；D)分別將步驟B)中配製的全血溶液(120yL)滴加於上樣孔(11)中，層析反應 15min ；E)置於螢光定量儀中獲取螢光信號強度，並繪製相應的標準曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對樣品進行檢測，層析結束後，置於螢光定量儀內獲取螢光信號強度，並依據步驟E)中的標準曲線分析該樣品中CRP的含量；G)輸出檢測報告。(四)結果分析結果表明，其最低檢測限為0.05mg/L，最低定量限為0. 16mg/L，且批內與批間重複性均較好，相關係數R2 > 0. 99，對心血管疾病的診斷具有參考價值。實施例2 以生物素-親和素系統將抗體修飾於量子點並採用間接預潤免疫層析對CRP的定量檢測(一 )量子點與抗體的修飾首先採用pH 9. O的碳酸氫鈉緩衝液對ImL的CRP單克隆抗體(lmg/mL)進行充分透析，加入20 120 μ 1 二甲亞碸(DMSO)新鮮配製的N-羥基琥珀醯亞胺生物素酯(NHSB， lmg/mL)，室溫避光反應4h。加入lmol/L NH4Cl,室溫下振蕩反應lOmin，然後將溶液置於透析袋中，過夜透析純化，並採用超濾離心管濃縮，配製為所需濃度，所得即為生物素化CRP 單克隆抗體。將鏈黴親和素修飾的發射波長為900nm的量子點和生物素化的CRP單克隆抗體按照1 3 1 12的比例混合反應30 60min，所得即為CRP單克隆抗體修飾的量子點。 依據實施例1方式可製得兔IgG修飾的量子點。其中CRP抗體修飾的量子點的螢光發射波長為900nm，兔IgG修飾的量子點的螢光發射波長為600nm。( 二)試劑盒的構建以1 1的比例混合兩種量子點標記物，並加入牛血清白蛋白(0. 05 2% )、蔗糖(1 15% )以及吐溫20、曲拉通X-100等表面活性劑，其中表面活性劑的含量在0. 05 2%之間，隨後均勻噴塗在標記墊上，37°C乾燥後密封，4°C下保存。如圖2所示，組裝定量檢測CRP的螢光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標記墊 (2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)組成，順次粘貼於黑色底板(6)上。 其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待檢樣品收集區；標記墊中含有CRP抗體修飾的量子點以及兔IgG修飾的量子點；層析膜上包含定量帶(7)和質控帶(8)，定量帶和質控帶的間隔R為3mm彡R彡8mm，且定量帶(7)固定有區別於標記墊中CRP抗體的另一抗原表位CRP抗體，質控帶(8)包被了羊抗兔抗體，位於定量帶的兩側；潤溼墊與層析膜毛細搭接1 2mm ；連接墊分別與潤溼墊和吸水墊毛細作用接觸，起緩衝連接作用。組裝好後，按照要求切割為所需寬度，並置於扣卡(13)內，如圖4所示，加入乾燥劑封裝，與緩衝液共同構建為螢光免疫層析試劑盒。(三)樣品的檢測A)將CRP抗原標準品用正常人血清作為稀釋液分別配製為Omg/L和250mg/L濃度；B)將步驟A)中兩種濃度的CRP標準品溶液依次按照5 0、4 1、3 2、2 3、 14和05的比例進行混合；C)在層析膜上滴加40μ L的緩衝液，該緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的 PH 9. O的磷酸緩衝液，層析反應Imin ；D)分別將步驟B)中配製的血清溶液(IOOyL)滴加於上樣孔(11)中，層析反應 13min ；E)置於螢光定量儀中獲取螢光信號強度，並繪製相應的標準曲線；F)同步驟C)和步驟D)操作，對樣品進行檢測，層析結束後，置於螢光定量儀內獲取螢光信號強度，並依據步驟E)中的標準曲線分析該樣品中CRP的含量；G)輸出檢測報告。(四)結果分析結果表明，其最低檢測限為0. 0lmg/L,最低定量限為0. 03mg/L,且在0. 03 250mg/L的報告範圍內，未出現HOOK效應，批內與批間重重複性、穩定性良好，相關係數可達R2 > 0. 99，對心血管疾病的診斷具有參考價值。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種全程定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1)用化學交聯或生物分子間特異性作用將C-反應蛋白的特異性抗體連接到量子點表面，得到抗體修飾的量子點，所述抗體修飾的量子點的發射波長範圍為550 1300nm ；步驟幻將步驟1)得到的抗體修飾的量子點固定在標記墊上，且標記墊上同時固定有質控分子修飾的量子點，所述質控分子修飾的量子點的發射波長與步驟1)得到的抗體修飾的量子點的發射波長不同，且波長範圍為550 1300·，在層析膜上分別設有定量帶和質控帶，其中質控帶固定有能與所述質控分子特異性結合的生物分子，定量帶固定有對應 C-反應蛋白的與步驟1)所述特異性抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟；3)以樣品墊、標記墊、層析膜、吸水墊和底板構建成螢光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱螢光層析膜，底板具低螢光特性；步驟4)試紙條免疫層析後，檢測定量帶和質控帶的螢光信號強度，並以質控帶螢光信號強度校正定量帶的螢光信號強度，進而實現C-反應蛋白的定量檢測。
2.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述抗體修飾的量子點的發射波長為900nm，步驟2、所述質控分子修飾的量子點的發射波長為600nm。
3.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述抗體修飾的量子點的發射波長為650nm，步驟2)所述質控分子修飾的量子點的發射波長為570nm。
4.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟1)所述量子點為單一化合物形成的量子點或幾種化合物組成的複合量子點。
5.根據權利要求4所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述化合物為選自aiS、 CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一種或幾種，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
6.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述層析膜在大於 550nm時螢光很弱或不含螢光劑。
7.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述底板為黑色，表面附有不乾膠，且兩者均不含螢光劑。
8.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟幻所述螢光免疫層析試紙條還包括能使樣品中液體與細胞分離的過濾膜。
9.根據權利要求1所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，步驟4)所述免疫層析為預潤免疫層析，其中預潤免疫層析為先以緩衝液預潤層析膜，再於樣品墊中加入樣品，當樣品流經定量帶和質控帶後，進行螢光定量檢測。
10.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述預潤層析膜是指將緩衝液直接滴加於層析膜。
11.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，當所述預潤層析膜為將緩衝液間接滴加於層析膜時，步驟幻所述的螢光免疫層析試紙條還包括潤溼墊和連接墊，其中潤溼墊分別與層析膜和連接墊以毛細作用接觸，連接墊分別與潤溼墊和吸水墊以毛細作用接觸。
12.根據權利要求9所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述緩衝液為pH7. 2 11的鹼性緩衝液。
13.根據權利要求12所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述鹼性緩衝液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的鹼性緩衝液。
14.根據權利要求12所述的螢光免疫層析方法，其特徵在於，所述鹼性緩衝液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0的磷酸緩衝液。
15.一種定量檢測C-反應蛋白的螢光免疫層析試劑盒，包括扣卡(13)、螢光免疫層析試紙條及緩衝液，其特徵在於，所述扣卡(1 為螢光免疫層析試紙條的外部殼結構，包括上樣孔(11)、視窗(1 和潤溼孔(14)；所述螢光免疫層析試紙條包括樣品墊(1)、標記墊 (2)、層析膜(4)、潤溼墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(5)和底板(6)，其中樣品墊(1)、標記墊 O)、層析膜、潤溼墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(5)搭載於底板(6)之上，樣品墊(1) 位於上樣孔(11)的下方，且連接於標記墊0)，標記墊(2)連接於層析膜G)，層析膜(4) 上固定有兩條質控帶(8)和定量帶(7)，且質控帶(8)位於定量帶(7)的兩側，層析膜(4) 位於視窗(12)的下方，層析膜(4)連接於潤溼墊(9)，且潤溼墊(9)位於潤溼孔(14)的下方，潤溼墊(9)連接於連接墊(10)，連接墊(10)連接於吸水墊(5)。
16.根據權利要求15所述的螢光免疫層析試劑盒，其特徵在於，所述螢光免疫層析試紙條還包括過濾膜(3)，其中所述過濾膜C3)連接於樣品墊(1)和層析膜(4)之間，且通過毛細作用接觸。
17.根據權利要求15所述的螢光免疫層析試劑盒，其特徵在於，所述扣卡(1 具有低螢光特性或不含螢光劑。
全文摘要
本發明公開了一種全程定量檢測C-反應蛋白(CRP)的螢光免疫層析方法及其試劑盒。本發明的全程定量檢測CRP螢光免疫層析方法是利用量子點的優良螢光特性，結合雙色標記技術及免疫層析技術，在優化試紙條各組成部件基礎上，實現的螢光定量檢測。與常規膠體金免疫層析方法相比，本發明具有標記穩定性好、非特異性低、靈敏度高、線性範圍寬以及定量準確的優勢。本發明試劑盒可對CRP進行全程定量，即可同時對感染性疾病、抗生素療效，及心腦血管疾病進行預測評估，適用於各級醫院，特別有助於在基層醫院及診所的廣泛推廣。
文檔編號G01N33/68GK102539785SQ20111045163
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者王秀利 申請人:深圳康美生物科技股份有限公司