用於檢測CBFβ/MYH11融合基因相對表達量的試劑盒的製作方法

2023-04-28 06:14:21 1

專利名稱：用於檢測CBFβ/MYH11融合基因相對表達量的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種基因檢測試劑盒，採用探針實時突光定量PCR技術,用於檢測人類急性髓細胞性白血病(acute myelognous leukemia,AML)患者體內CBFP /MYHll融合基因表達水平，同時對高危人群進行較為準確的篩查。該試劑盒可有效的節約檢測時間，提聞檢測精度。
背景技術：
Acute myelocytic leukemia即急性髓細胞白血病,其病情進展迅速，自然病程僅有數周至數月，目前還沒有找到真正的致病因，一般認為遺傳、輻射、化學物質(如苯)、藥物及其他職業上的暴露(如濃煙、顏料、殺蟲劑等)可能與AML的發生有關。臨床上，根據血象、骨髓象、細胞化學染色、免疫學染色的檢測結果將急性骨髓系白血病分為M(TM7，8種亞 型。M■是M4型白血病中的一種特殊類型。患者骨髓中粒系和單核系原始細胞同時惡性增生，嗜酸粒細胞佔5% -30%。Inv(16) (pl3 ；q22)/t(16 ；16) (pl3 ；q22)為急性髓系白血病(AML)-M■的非隨機染色體異常，是由16號染色體長臂上的CBFP基因與短臂上的平滑肌肌球蛋白重鏈基因(MYHll)產生融合所致，形成CBFP/MYHll和MYHl 1/CBFP兩種融合基因。其中CBFP/MYHll融合基因易促使白血病發病。迄今已發現10種CBFP/MYHll融合基因轉錄本，最為常見的是A型，即CBFP 47Vmyh1921，佔88%，其次為D型(CBFe 474/MYH12ci1)和E型(CBFP 474/ MYH994)，這兩型檢出率均為5%，其他類型均只有個案報導。與其他AML亞型相比，(AML)-M4ro患者多為中青年，常有外周血白細胞計數升高、器官腫大、對化療藥物有良好反應。大多數研究認為，有較好的預後，有inv(t6)者完全緩解率可達90% 100%，近50%能夠獲得5年無病生存(DFS)，但中樞神經系統復發較常見。CBF^/MYHlI的致白血病機制尚不清楚，在CBF@ /MYHll基因敲除小鼠中，CBF3 /MYHll顯性負抑制CBF對其靶基因的轉錄調控活性。間接免疫螢光染色證實CBF ^ /MYHll基因表達產物CBF ^ /SMHHC與野生型CBF ^ 一樣定位於胞漿，當CBF ^ SMHHC與AMLl共表達時，CBF P / SMHHC可將AMLl蛋白部分扣留於胞漿，CBF ^ /SMHHC融合蛋白的AMLl胞漿扣留是CBF ^ /SMHHC顯性負抑制CBF對其靶基因的轉錄激活的主要機制。有研究發現，CBF ^/SMHHC與野生型CBFP相比，其與AMLl具有更高的親和性，當二者共表達時大部分CBF ^ /SMHHC融合蛋白已從胞漿進入胞核，而CBF ^ /SMHHC、AML1與mSin3A可形成轉錄抑制複合物，因此，CBF 3 /SMHHC顯性抑制CBF對其靶基因的轉錄激活的另一機制是通過CBF ^ /SMHHC與野生型CBFP競爭性結合AMLl，在胞核內與AMLl及一些轉錄抑制輔助因子(如mSin3A等)形成轉錄抑制複合物所致。目前臨床上已經將CBFP/MYHll融合基因作為動態評估患者病情及預後的手段之一。常用的檢測技術有螢光原位雜交技術(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法儘管結果較為直觀，但是試驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結果需經驗豐富的專業人士來判讀，結果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進行準確的估算。此外，由於砷劑及全反式維甲酸的應用，APL治療效果得到很大的提高，微小殘留病是其復發的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、汙染控制好的方法來對CBFP /MYHll融合基因mRNA殘留進行檢測。RQ-PCR米用Taqman探針突光定量技術,綜合生物學、酶學和突光化學於一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了 PCR產物汙染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易於統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關係好，操作簡單，自動化程度高、防汙染，有較大的線性範圍等優點。能夠滿足CBFP /MYHll融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認為是目前首選檢測方法，用於評價治療效果、預測預後。實時螢光定量PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR GreenI由於是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究採用實時螢光PCR技術結合Taqman探針法應用於CBFP /MYHll的基因檢測。

發明內容
鑑於現有技術中檢測CBFP /MYHll融合基因的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用螢光定量PCR技術檢測CBFP/MYHll融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用於檢測CBFP /MYHll融合基因相對表達量的試劑盒。用於檢測CBFP/MYHll融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特徵在於
檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、擴增目的基因用引物CBF 3 /MYH11-F、CBFP /MYH11-A-R、CBFP /MYH11-D-R、CBFP /MYH11-E-R，探針 CBF P /MYHll-Prob，擴增內參基因Abl用引物abl-F，abl-R，探針abl_Probe ;其中，
CBF^ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAG
CBF^ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTC
CBF^ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACT
CBF^ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCC
CBF3 /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。所述陽性對照品為含有CBFP /MYHll基因的溶液；所述陰性對照品為無CBF3 /MYHll基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為T0Y0B0公司生產的qPCR用cDNA試劑盒產品。THUNDERBIRD qPCR MIX為T0Y0B0公司生產的定量PCR試劑，產品規格為QPS-101。本發明的有益效果本發明將實時螢光PCR技術結合採用Tapman探針，利用雙標準曲線的方法，分別構建內參基因abl和目的基因CBFP /MYHll的定量標準曲線，檢測受測者體內CBFP/MYHll的相對於內參基因的表達水平。相比於以往的免疫組化方法和現今流行的A A CT法，該試劑盒具有精度高，結果便於判讀等優點。加之該試劑盒將反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該試劑盒經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助於臨床上急性髓細胞性白血病(acute myelognous leukemia, AML)患者體內CBF 0/MYHlI融合基因的微量殘留檢測，對於及時幹預治療避免血液學復發、調整治療方案、評價治療效果、預測預後、預防臨床復發都具有重要意義。


圖I :樣品I檢測結果示意圖(CBF 3 /MYHll A型陽性)。圖2 :樣品2檢測結果示意圖(CBF P /MYHll A型陰性)。
圖3 :樣品3檢測結果示意圖(CBF P /MYHll D型陽性)。圖4 :樣品4檢測結果示意圖(CBF P /MYHll D型陰性)。圖5 :樣品5檢測結果示意圖(CBF P/MYHll E型陽性)。圖6 :樣品6檢測結果示意圖(CBF P /MYHll E型陰性)。
具體實施例方式實施例I
本發明的用於檢測CBFP /MYHll融合基因相對表達量的試劑盒，包括
紅細胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
無水乙醇；
檢測體系 PCR 反應液ReverTra Ace qPCR RT Kit (T0Y0B0 公司);THNDERBIRD ProbeqPCR Mix (2X )、CBF3 /MYHll 上、下遊引物各 0. 8uM、CBFP /MYHlI 探針 0. 4 uM ；abl 上、下遊引物各0. 8uM、abl-probe (探針)0. 4uM ;其中
CBF^ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAG ；
CBF^ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTC ；
CBF^ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACT ；
CBF^ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCC ；
CBF3 /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRA ；abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
陽性對照品分別含CBFP /MYHl I基因組溶液；陰性對照品不含CBFP /MYHll基因組溶液。實施例2本發明試劑盒的使用方法
(I)抽提血液中的組織RNA:在潔淨的I. 5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細胞；再次加A 0. 5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入ImlTRIzol，反覆吹打直至沉澱完全溶解，室溫靜止5min ;加入0. 2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4°C離心lOmin，吸取上清層轉移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫乾燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉澱。(2)參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝X=23ul反應液X (8份內參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+n份標本+1份陽
性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
(4)加樣加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質。(5)檢測檢測在實時螢光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件95°C預變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環，突光信號於58°C 35 sec時米集。(6)結果判斷將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。I)內參陽性時，檢測結果才認為有效；
2)陽性判斷標準，Ct〈36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗證；Ct >38，為陰性。實施例3
採用本發明核酸檢測試劑盒檢測臨床標本。取送檢的急性髓細胞性白血病(acute myelognous leukemia,AML)患者抗凝血標本共60例，按實施例2所述方法提取基因組RNA、配製試劑並檢測。每份標本加入檢測體系PCR反應液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的螢光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重複，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。實驗結果與特檢實驗室的報告結果相比較，確定樣品檢測的準確率。部分陽性結果如下表
權利要求
1.用於檢測CBFi3/MYHll融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特徵在於 檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、擴增目的基因用引物CBF β /MYHl 1-F、CBFP /MYHl 1-A-R、CBFP /MYHl 1-D-R、CBFP /MYHl 1-E-R，探針 CBF β /MYHl I-Prob，擴增內參基因Abl用引物abl-F，abl-R，探針abl-Probe ;其中，CBFβ /MYHlI-F: GGAGGATGCATTAGCACAACAGCBFβ /MYHlI-A-R: TCTCCTCCATCTGGGTCCBFβ /MYHlI-D-R: ATCCCTGTGACGCTCTCAACTCBFβ /MYHlI-E-R: GCTTATTCTTGTCTAGGTTCGCCCBFβ /MYHl1-Probe: FAM-GAAGAGGCTCGGAGAAGGACAC-TAMRAabl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述陽性對照品為含有CBFi3/MYHll基因的溶液；所述陰性對照品為無CBFi3 /MYHll基因的溶液。
全文摘要
本發明公開了用於檢測CBFβ/MYH11融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特徵在於檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、擴增目的基因用引物CBFβ/MYH11-F、CBFβ/MYH11-A-R、CBFβ/MYH11-D-R、CBFβ/MYH11-E-R，探針CBFβ/MYH11-Prob，擴增內參基因Abl用引物abl-F，abl-R，探針abl-Probe。本發明試劑盒能夠對人類急性髓細胞性白血病(acutemyelognousleukemia，AML)患者體內CBFβ/MYH11融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。
文檔編號G01N21/64GK102796818SQ20121025570
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者徐建成, 周曉犢, 王淑一 申請人:南昌艾迪康臨床檢驗所有限公司