一種豬胰腺α-澱粉酶(PPA)及其製備方法
2023-04-28 04:08:21
專利名稱：一種豬胰腺α-澱粉酶(PPA)及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種澱粉酶，具體涉及豬胰腺α-澱粉酶及其製備方法。
背景技術：
我國飼料以玉米為主，玉米中含有大量澱粉，添加α -澱粉酶使澱粉預降解，既達到了切斷長鏈澱粉的作用，又減少了黏度，有助於提高了飼料的轉化效率，為此α-澱粉酶在飼料酶中佔據著很重要的地位。
澱粉酶是水解澱粉和糖原等的一類酶的統稱，最早實現工業生產，是迄今為止用途最廣、產量最大的幾個酶製劑品種之一。人類早在數千年前就已利用澱粉酶的作用從事釀酒。但直到1811年，第一種澱粉降解酶才被KirchhofT發現[錯誤！未定義書籤。]， 1833年Payen和Persoz從麥芽的水抽提物中用酒精沉澱分離到澱粉酶。1894年日本人高峰讓吉從米麴黴(Aspergillus oryzae)中提取出澱粉酶作為消化劑；1919年法國人又先後發現枯草桿菌(Bacillus subtilis)可以分泌耐熱且活性更強的α-澱粉酶；1926年德國設廠生產α -澱粉酶，為微生物酶工業生產奠定基礎；1949年，日本成功地進行了 α -澱粉酶的液體深層發酵，從而促進了大規模工業化生產的發展。至此，α-澱粉酶在輕工、食品、製藥等領域中的應用越來越廣泛。
基因工程技術在α-澱粉酶工業上應用和發展已取得可喜結果。國內外研究者已報導了 α-澱粉酶基因的克隆。1984年被Tsukagoshi等人在嗜熱脂肪芽胞桿菌 (B. stearothermophiIus)中克隆得到一段包含ct -澱粉酶基因的6. 4kb片段,而Mielenz 所克隆的基因大小為5. 4kb，二者可以在大腸桿菌HBlOl中表達,在澱粉-瓊脂培養基上產生澱粉水解圈，這表明該片段含有的α -澱粉酶基因是完整的。
α-澱粉酶廣泛分布於動物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山嵛菜)及微生物中，不同來源的酶具有不同性質，不同性質的酶具有不同的用途。工業生產用的一般由微生物進行大規模發酵生產,主要來源於幾種細菌和真菌,如原核微生物枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、黃單胞菌等；真核微生物米麴黴、黑麴黴.、擬內孢菌等。一般來說細菌澱粉酶因為具有某些特性而優於真菌澱粉酶。另外也有從動植物體內提取獲得α-澱粉酶，但受到動植物原料來源及工藝方面不成熟的限制而成本高昂，無法滿足市場的需求。發明內容
本發明的目的是提供一種豬胰腺α-澱粉酶(PPA)及其製備方法，可以高效表達 α-澱粉酶的重組酵母可用來大規模工業化廉價生產飼料用α -澱粉酶，同時發酵後的菌體還可以做優良的單細胞飼料蛋白。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現一種豬胰腺α-澱粉酶(ΡΡΑ)，來源於豬胰腺組織，豬胰腺α-澱粉酶的核苷酸序列如下
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豬胰腺α -澱粉酶的胺基酸序列如下
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所述的豬胰腺α -澱粉酶(PPA)的製備方法包括以下步驟
I)克隆豬胰腺α -澱粉酶PPA基因；
2) PPA基因在酵母表達載體上的構建；
3)酵母轉化和重組酵母的篩選；
4)發酵生產α-澱粉酶。
本發明探索了三種發酵方法第一種為以甘油為碳源、甘油飼餵培養的發酵方法具體如下1)菌株培養階段。發酵培養基接種前先加28%氨水使培養基的pH達到5. O (氨水同時也作為氮源)，再按每升培養基加入4. 37ml PTMl，5-10%接種種子液，通氣攪拌培養18-24小時，在培養過程中隨著菌株的生長，培養基中的溶氧量將有100%逐漸降低，當碳源消耗完後溶氧量將再度升高至80%以上，此時菌體溼重將達到110g/L。2)碳源飼餵階段。流加50%甘油(包含12ml/LPTMl)，流加量為18. 15/hr/L，培養4小時。調整通氣量使溶氧量始終大於20%.此時菌體溼重達到220g/L。3)誘導表達階段。加入甲醇(含 12ml/L PTM1)，使甲醇終濃度維持在O. 3%，溶氧量始終大於20% .在誘導過程中每12小時取樣一次測定表達的澱粉酶的積累量。第二種方法為以甘油為碳源、碳源-甲醇混合飼餵的方法。具體為在第一種方法的第二步即碳源飼餵階段完成後，增加一個碳源-甲醇混合飼餵階段，即流加50%甘油甲醇(4 I)培養4小時，流加量為5ml/hr/L，控制溶氧量始終大於20%.接著再進入甲醇誘導階段。第三種方法為以葡萄糖為碳源、碳源-甲醇混合飼餵的方法。除了把碳源甘油換成葡萄糖外，其餘與第二種方法完全相同。
本發明的有益效果為高效表達α -澱粉酶的重組酵母可用來大規模工業化廉價生產飼料用α-澱粉酶，同時發酵後的菌體還可以做優良的單細胞飼料蛋白；具有高活性、 高耐受性，不僅可以豐富澱粉酶選擇性，還可以進一步對其分子水平改造提供一定的理論依據。
具體實施方式
實施例1克隆豬胰腺α -澱粉酶PPA基因
豬胰腺RNA的提取採用Trizol試劑盒法，採集新鮮豬胰腺組織，迅速在液氮中研磨，研磨粉末放入Trizol溶液中，渦旋均勻後低溫下離心，上清液經異丙醇處理後，轉入 75%的乙醇中沉澱RNA分子，即可獲得純淨的RNA。
通過RT-PCR擴增得到包含α -澱粉酶原ORF的cDNA片段。反應參數如下表
權利要求
1.一種豬胰腺α -澱粉酶(PPA)，其特徵在於豬胰腺α -澱粉酶來源於豬胰腺組織，豬胰腺α-澱粉酶的核苷酸序列如下5' -ATGAAGTTGTTTCTGCTGCTTTCAGCCTTTGGGTTCTGCTGGGCCCAGTATGCCCCACAAACCCAGTCTGGACGAACGTCTATTCTCCATCTGTTTGAATGGCGCTGGGTTGACATTGCTCTTGAATGTGAGCGGTATTTGGGCCCCAAAGGATTTGGAGGGGTACAGGTCTCCCCCCCCAATGAAAATATAGTAGTCACTAACCCTTCAAGACCTTGGTGGGAGAGATACCAACCAGTGAGTTACAAGTTATGTACCAGATCAGGAAATGAAAATGAATTCAGAGACATGGTGACTAGATGTAACAACGTTGGCGTGCGTATATATGTGGATGCTGTCATTAATCATATGTGTGGAAGTGGTGCAGCTGCAGGAACGGGCACCACTTGTGGAAGTTATTGCAACCCTGGAAATAGGGAGTTTCCAGCAGTCCCATACTCTGCTTGGGATTTTAACGATGGTAAATGTAAAACTGCAAGTGGAGGAATCGAGAGCTATAATGATCCTTATCAAGTCAGAGATTGTCAACTGGTTGGTCTTCTTGATCTTGCACTGGAAAAGGATTATGTGCGCTCCATGATTGCTGATTATCTAAACAAACTCATTGACATTGGTGTAGCAGGGTTCCGAATTGATGCTTCTAAGCACATGTGGCCTGGAGACATAAAAGCAGTTTTGGATAAACTTCACAACCTAAACACCAACTGGTTCCCTGCCGGAAGTCGACCTTTCATATTCCAGGAGGTGATTGATTTGGGTGGTGAGGCAATTCAAAGCAGTGAGTACTTTGGAAATGGCCGCGTGACAGAATTTAAATACGGTGCAAAACTGGGCACCGTTGTGCGCAAGTGGAGTGGAGAGAAGATGTCTTACTTGAAGAACTGGGGAGAAGGCTGGGGTTTCATGCCCTCTGATAGAGCCCTTGTCTTTGTTGATAACCATGACAACCAGCGAGGGCATGGAGCGGGGGGAGCATCTATTCTTACATTCTGGGACGCTAGACTGTACAAAGTGGCAGTTGGATTTATGCTCGCCCACCCTTACGGATTCACACGAGTGATGTCAAGCTACCGTTGGGCAAGAAATTTTGTGAATGGACAAGATGTTAATGATTGGATTGGGCCACCAAATAATAACGGGGTCATTAAGGAAGTTACTATTAATGCAGATACTACCTGTGGCAATGACTGGGTCTGTGAGCATCGATGGCGTCAGATAAGGAACATGGTTTGGTTCCGTAACGTGGTGGACGGCCAACCTTTTGCAAACTGGTGCGATAACGGAAGCAACCAGGTAGCTTTTGGAAGAGGAAACAGAGGATTCATTGTCTTTAACAATGATGATTGGCAATTATCTTCAACTTTGCAAACTGGTCTTCCTGGTGGCACATACTGTGATGTTATCTCTGGAGATAAAGTTGGTAACAGTTGTACAGGAATTAAAGTCTATGTTTCCAGTGATGGCACAGCTCAGTTTTCTATTAGTAACTCTGCTGAAGATCCATTTATTGCAATTCATGCTGAATCCAAATTGAATCTCTAG-3' 豬胰腺α-澱粉酶的胺基酸序列如下MKLFLLLSAFGFCWAQYAPQTQSGRTSIVHLFEWRWVDIALECERYLGPKGFGGVQVSPPNENIVVTNPSRPWWERYQPVSYKLCTRSGNENEFRDMVTRCNNVGVRIYVDAVTNHMCGSGAAAGTGTTCGSYCNPGNREFPAVPYSAWDFNDGKCKTASGGIESYNDPYQVRDCQLVGLLDLALEKDYVRSMIADYLNKLIDIGVAGFRIDASKHMWP⑶IKAVLDKLHNLNTNWFPAGSRPFIFQEVTDLGGEAIQSSEYFGNGRVTEFKYGAKLGTVVRKWSGEKMSYLKNWGEGffGFMPSDRALVFVDNHDNQRGHGAGGASILTFffDARLYKVAVGFMLAHPYGFTRVMSSYRWARNFVNGQDVNDWIGPPNNNGVIKEVTINADTTCGNDWVCEHRWRQIRNMVffFRNVVDGQPFANWffDNGSNQVAFGRGNRGFIVFNNDDWQLSSTLQTGLPGGTYCDVIS⑶KVGNSCTGIKVYVSSDGTAQFSISNSAEDPFIAIHAESKLNL
2.權利要求1所述的豬胰腺α-澱粉酶(PPA)的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)克隆豬胰腺α-澱粉酶PPA基因； 2)PPA基因在酵母表達載體上的構建；3)酵母轉化和重組酵母的篩選；4)發酵 生產α-澱粉酶。
全文摘要
本發明涉及一種豬胰腺α-澱粉酶(PPA)及其製備方法，豬胰腺α-澱粉酶來源於豬胰腺組織；其製備方法包括1)克隆豬胰腺α-澱粉酶PPA基因；2)PPA基因在酵母表達載體上的構建；3)酵母轉化和重組酵母的篩選；4)發酵生產α-澱粉酶。本發明的有益效果為高效表達α-澱粉酶的重組酵母可用來大規模工業化廉價生產飼料用α-澱粉酶，同時發酵後的菌體還可以做優良的單細胞飼料蛋白。
文檔編號C12N15/81GK102994473SQ20111027216
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者夏新界, 謝夢憶 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司