一種神經幹細胞凍存復甦的方法
2023-04-28 20:23:56
專利名稱：一種神經幹細胞凍存復甦的方法
技術領域：
本發明涉及生物製品領域，具體涉及一種神經幹細胞凍存復甦的方法。本發明通過添加EGF和bFGF兩種細胞因子，使得神經幹細胞凍存復甦率大大提高，由現有技術中的 40%左右達到90%以上，本發明對神經幹細胞成功地進行了凍存、復甦，對臨床擇期進行幹細胞移植手術和建立「幹細胞庫」具有重要的意義。
背景技術：
神經幹細胞(Neural Stem Cell, NSC)是存在於胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一種幹細胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，可通過不對等的分裂方式分化成神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等神經組織的各類細胞，也可轉分化成血細胞和骨骼肌細胞。在腦、脊髓等所有神經組織中，不同的神經幹細胞類型產生的子代細胞種類不同，分布也不同。目前的科學技術已經可以在體外培養擴增神經幹細胞，用於生命科學研究、藥物篩選測試、臨床應用研究等領域。由於神經幹細胞凍存後復甦率直接影響著神經幹細胞的質和量，為獲得來源方便的神經幹細胞，改進神經幹細胞凍存復甦技術、建立一種能夠長期儲存幹細胞的方法對促進神經幹細胞的研究和應用具有重要意義。目前，神經幹細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由於血清具有成分複雜、質量不穩定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復甦技術成為發展趨勢。目前神經幹細胞無血清凍存液的主要成分是70%的無血清培養基、20%牛血清白蛋白(BSA)和10%二甲基亞碸(DMSO)。凍存程序一般是梯度降溫的方法，降溫速度大約是rc /分鐘。對凍存的細胞進行復甦時，一般是將凍存管直接置於37°C迅速解凍，然後加入完全生長培養基重懸細胞，離心棄上清後，再加入完全生長培養基繼續培養，以供後續的研究或測試使用。結合上述無血清凍存和復甦技術對神經幹細胞進行凍存和復甦，凍存後復甦率僅有40 %左右，遠低於含血清的凍存技術。因此，本領域需要新的對神經幹細胞進行凍存和復甦的方法，以提高神經幹細胞的凍存復甦率，從而獲得優質的神經幹細胞凍存復甦產品，為以後神經幹細胞移植手術和建立「幹細胞庫」等應用奠定良好的基礎。
發明內容
本發明涉及一種神經幹細胞凍存復甦的方法，該方法對凍存液、復甦液、凍存程序、復甦程序等進行了改進和優化，使神經幹細胞的復甦率相對於現有技術的方法大大提高，從現有技術所獲得的40%左右的復甦率提高到90%以上。具體地，本發明的神經幹細胞凍存復甦方法包括以下步驟凍存步驟、復甦步驟和洗滌步驟，其中凍存步驟包括向神經幹細胞懸液中加入凍存液和在液氮中凍存的步驟；復甦步驟包括向從液氮中取出的凍存細胞中加入復甦液使細胞復甦的步驟；洗滌步驟包括將復甦的細胞液洗滌後製備成細胞懸液備用。本發明在傳統的凍存液配方中添加了生長因子(EGF)和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。所述EGF在凍存液中的終濃度為0.008-0. 04 μ g/ml、優選0.009-0. 03 μ g/ ml，最優選0. 01-0. 02 μ g/ml ；所述bEGF在凍存液中的終濃度為0. 008-0. 04 μ g/ml、優選 0. 009-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml。在一個具體實施方案中，所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含1XB27 添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM,丙酮酸鈉，終濃度為0. 8-1. 2mM, N-乙醯半胱氨酸(NAC)，終濃度0. 8-1. 2mM, EGF (表皮生長因子)，終濃度0. 005-0. 04 μ g/ ml、優選0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選0. 01-0. 02 μ g/ml，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)， 終濃度 0. 005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml，二甲基亞碸 (DMSO)，終濃度7-8 % (ν/ν)，牛血清白蛋白(BSA)，終濃度0. 08-0. 12g/ml。上述DMEM培養液、DMEM/F12培養液、B27添加劑和N2添加劑是培養神經幹細胞的常用公知添加劑，購自 Invitrogen公司，它們也可以從其它商業渠道購買得到。在配製過程中，將上述B27添加劑 (Invitrogen，50 倍濃度(50X))、N2 添加劑(Invitrogen，100 倍濃度(100X))加入 DMEM 或DMEM/F12培養液(Invitrogen，1倍濃度(IX))中，使B27添加劑、N2添加劑的終濃度分別為0. 8 X-1. 2 X濃度，優選^witrogen公司建議使用的1倍濃度B27添加劑(1XB27 添加劑)終濃度和1倍濃度N2添加劑(1 XN2添加劑)終濃度。在具體的實施方案中，前述的DMEM培養液可以用本領域培養細胞常用的其它細胞培養液替代，優選用DMEM/F12培養液代替。DMEM培養液是本領域常用的公知細胞培養液，包含甘氨酸，0. 4mM, L-精氨酸，0. 398mM, L-胱氨酸，0. 201mM, L-穀氨醯胺，4mM，L-組氨酸，0. 2mM, L-異亮氨酸，0. 802mM, L-亮氨酸，0. 802mM, L-賴氨酸，0. 798mM, L-蛋氨酸， 0. 201mM, L-苯丙氨酸，0. 4mM, L-絲氨酸，0. 4mM, L-蘇氨酸，0. 798mM, L-色氨酸，0. 0784mM, L-酪氨酸，0. 398mM, L-纈氨酸，0. 803mM,氯化膽鹼，0. 0286mM, D-泛酸鈣，0. 00839mM,葉酸，0. 00907mM,煙醯胺，0. 0328mM,維生素 B6，0. 0194mM，核黃素，0. 00106mM,鹽酸硫胺， 0. 0119mM,肌醇，0. 04mM,氯化鈣，1. 8mM,硝酸鐵，0. 000248mM,硫酸鎂，0. 814mM,氯化鉀， 5. 33mM,碳酸氫鈉，44. 05mM,氯化鈉，81. 9mM，磷酸二氫鈉，0. 906mM,葡萄糖，25mM,羥乙基哌嗪乙磺酸，25. 03mM。DMEM/F 12培養液是本領域常用的公知細胞培養液，包含甘氨酸，0. 25mM, L-丙氨酸，0. 05mM, L-精氨酸，0. 699mM, L-天冬醯胺，0. 05mM, L-天冬氨酸，0. 05mM, L-半胱氨酸，0. 0998mM, L-胱氨酸，0. ImM, L-穀氨酸，0. 05mM, L-穀氨醯胺，2. 5mM, L-組氨酸， 0. 15mM, L-異亮氨酸，0. 416mM，L-亮氨酸，0. 451mM, L-賴氨酸，0. 499mM, L-甲硫氨酸， 0. 116福丄-苯丙氨酸，0. 215mM，L-脯氨酸，0. 15mM，L-絲氨酸，0. 25mM，L-蘇氨酸，0. 449mM, L-色氨酸，0. 0442mM, L-酪氨酸，0. 214mM, L-纈氨酸，0. 452mM,生物素，0. 0000143mM, 氯化膽鹼,0. 064ImM，D-泛酸鈣，0. 0047mM,葉酸，0. 0060ImM，煙醯胺，0. 0166mM,吡哆醇， 0. 00971mM,核黃素，0. 000582mM,鹽酸硫胺，0. 00644mM,維生素 B12，0. 000502mM, i_ 肌醇， 0. 07mM,氯化鈣，1. 05mM,硫酸銅，0. 0000052mM,硝酸鐵，0. 000124mM,硫酸鐵，0. 0015mM,氯化鎂，0. 301mM，硫酸鎂，0. 407mM，氯化鉀，4. 16mM，碳酸氫鈉，14.四福，氯化鈉，120. 61mM，磷酸氫二鈉，0. 5mM，磷酸二氫鈉，0. 453mM，硫酸鋅，0. 0015mM，葡萄糖，17. 51mM，4_羥乙基哌嗪乙磺酸，15. 02mM,次黃嘌呤鈉，0. 015mM，亞油酸，0. 00015mM,硫辛酸，0. 0005ImM，酚紅，0.0215mM，腐胺，0. 000503mM，丙酮酸鈉，0. 5mM，胸苷，0. 00151mM。上述B27添加劑包含生物素，腎上腺皮質酮，孕酮，乙酸維生素A，人重組胰島素， 三碘甲腺原氨酸，維生素E，乙酸維生素E，還原穀胱甘肽，過氧化物歧化酶，鹽酸肉鹼，鹽酸乙醇胺，D-半乳糖，鹽酸腐胺，亞油酸，亞麻酸，牛血清白蛋白(無脂肪酸)，人轉鐵蛋白，亞硒酸鈉。上述N2添加劑包含胰島素5mg/L，孕酮20nM，腐胺IOOuM,亞硒酸鈉30nM，轉鐵蛋白 100mg/L。在一個具體的實施方案中，所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含1XB27 添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM,丙酮酸鈉，終濃度為1. OmM, NAC,終濃度 1. OmM, EGF，終濃度 0. 01 μ g/ml, bFGF,終濃度 0. 01 μ g/ml, DMSO,終濃度 7. 5% (ν/ν)， BSA，終濃度0. lg/ml。在另一個具體實施方案中，所述凍存液為DMEM或DMEM/F 12培養液中包含1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM，丙酮酸鈉，終濃度為
1.OmM, NAC,終濃度 1. OmM, EGF，終濃度 0. 02 μ g/ml，bFGF,終濃度 0. 02 μ g/ml，DMSO,終濃度 7. 5% (ν/ν)，BSA，終濃度 0. lg/ml。向神經幹細胞懸液中加入適量的凍存液，使細胞終濃度在0. 8-1. 2X10"6個細胞 /ml，然後進行降溫凍存。以前的降溫方法是用程序降溫儀以每分鐘降1攝氏度的速度對細胞均勻梯度降溫，然後保存到液氮中。本發明的方法是將細胞懸液在低溫，優選在_15°C 至-25°C，更優選在_18°C至_22°C，最優選在_20°C放置一段時間，優選20-40分鐘，更優選 25-35分鐘，最優選30分鐘，然後在_65°C至-75°C，優選在_68°C至-72°C，最優選在_70°C 放置12-16個小時，然後轉入液氮中長期凍存。傳統的神經幹細胞凍存復甦方法不用復甦液，而是把凍存的細胞從液氮中取出， 直接放到37攝氏度解凍，然後用完全培養基洗滌，再放到完全培養基中培養。本發明的復甦步驟採用了在DMEM或DMEM/F12培養液中包含如下成分的復甦液1 XB27添加劑，1XN2 添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM,丙酮酸鈉，終濃度為0. 8-1. 2mM, NAC,終濃度 0. 8-1. 2mM和BSA，終濃度0. 008-0. 012g/ml。在一個具體的實施方案中，所述復甦液在DMEM 或DMEM/F12培養液中包含1 XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM,丙酮酸鈉，終濃度為1. OmM, NAC,終濃度1. OmM和BSA，終濃度0. 01g/ml。上述復甦液中所使用的DMEM培養液、DMEM/F12培養液、B27添加劑和N2添加劑購自^witrogen公司，它們也可以從其它商業渠道購買得到。在配製過程中，將上述B27 添加劑(Invitrogen，50X)、N2 添加劑(Invitrogen, 100 X)加入 DMEM 或 DMEM/F 12 培養液 (Invitrogen, 1 X)中，使B27添加劑、N2添加劑的終濃度分別為0. 8 X -1. 2 X濃度，優選 Invitrogen公司建議使用的1XB27添加劑終濃度和1XN2添加劑終濃度。在具體的實施方案中，本發明的復甦過程中增加了激活的步驟，該激活的溫度為 35°C至45°C，優選為38°C至42°C，最優選為40°C。傳統的復甦方法是將裝有凍存的神經幹細胞的凍存管從液氮中取出，直接置於37攝氏度，而我們的方法是從液氮中取出後先激活1.5-2. 5分鐘，再置於37攝氏度。具體地，該復甦過程包括將液氮中的凍存細胞取出，在 35°C至45°C，優選在38°C至42°C，最優選在40°C水浴中溫育1. 5-2. 5分鐘；加入8_12倍體積的37°C預熱的復甦液重懸，離心去上清，再用DMEM或DMEM/F 12培養液洗滌。洗滌時，可加入4-6倍體積的DMEM或DMEM/F12培養液重懸，離心去上清；重複前一步用DMEM或DMEM/ F12再次洗滌；加入1-1. 5倍體積的Hibernation培養基(該培養基的成分=KCl 2. 24g/L、NaOH 0. 2g/L、NaH2PO4. 2H20 0. 78g/L、MgCl2. 6H20 0. lg/L、丙酮酸鈉 2. 2g/L、葡萄糖 1. Og/L 和山梨(糖)醇36.4g/L)重懸。所獲得的細胞懸液用於之後的研究測試。通過本發明的凍存復甦方法，活神經幹細胞佔90%以上，也就是說復甦率在90% 以上。這樣的神經幹細胞是臨床應用，例如通過神經幹細胞移植治療神經系統疾病，和建立 「幹細胞庫」所期望的。
圖la-b 該圖為 Countess 全自動細胞計數儀(Countess antomated cell counter)記錄的實驗結果。其中，圖Ia為實施例1的方法獲得的實驗結果，自動細胞計數儀顯示活細胞濃度(Viable cell concentration)9. 6X 10~5個細胞/ml，與凍存前的 1. OX 10~6個細胞/ml相比，復甦率達96%。圖Ib為對比例1的方法獲得的實驗結果，自動細胞計數儀顯示活細胞濃度3. 5 X 10~5個細胞/ml，與凍存前的1. 0 X 10~6個細胞/ml相比，復甦率為35%。圖加-b 該圖為Countess 全自動細胞計數儀記錄的實驗結果，其中圖加為實施例2的方法獲得的實驗結果，自動細胞計數儀顯示活細胞濃度9. 4X10~5個細胞/ml，與凍存前的1. OX 10~6個細胞/ml相比，復甦率達94%。圖2b為從對比例2的方法獲得的實驗結果，自動細胞計數儀顯示活細胞濃度4. OX 10~5個細胞/ml，與凍存前的1. OX 10~6個細胞/ml相比，復甦率為40%。
具體實施例方式實施例1 獲取鼠腦組織皮層神經幹細胞1. OX 10~6個細胞，加入一定體積的凍存液，使細胞懸液的最終濃度為1. OX 10~6個細胞/ml，將細胞懸液在-20°c放置30分鐘，在_70°C放置12-16個小時，然後轉入液氮中凍存。1周後將液氮中的凍存細胞取出，在40°C水浴鍋中溫育2分鐘；加入10倍體積的 37°C預熱的復甦液重懸，離心去上清；加入5倍體積的DMEM培養液重懸，再次離心去上清； 重複該洗滌步驟；然後加入1倍體積的Hibernation培養基(購自hvitrogen公司)重懸，經自動細胞計數儀計數，獲得9. 6X 10~5個細胞/ml，復甦率為96% (參見圖la)。本實施例中，凍存液的成分是在DMEM培養液(Invitrogen)中含有1 XB27 添力口劑(Invitrogen)，1 XN2 添力口劑(Invitrogen)，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM,丙酮酸鈉，終濃度為1. OmM,NAC，終濃度 1. OmM,EGF (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. 01 μ g/ml，bFGF(購自 hvitrogen 公司)，終濃度 0. 01 μ g/ml,DMS0，終濃度 7.5% (ν/ν),BSA (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. lg/ml。復甦液的成分是在DMEM培養液(Invitrogen)中含有
1 XB27 添力口劑(Invitrogen)，1 XN2 添力口劑(Invitrogen)，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM,丙酮酸鈉，終濃度為1. OmM,NAC，終濃度 1. OmM,BSA,終濃度 0. 01g/ml。對比例1 獲取鼠腦組織皮層神經幹細胞1. OX 10~6個細胞，加入一定體積的凍存液，使細胞懸液的最終濃度為1. OX 10~6個細胞/ml，將細胞懸液在程序降溫儀中以1°C/分鐘的速度降溫至-150°C，然後轉入液氮中凍存。1周後將液氮中的凍存細胞取出，在37°C水浴鍋中解凍，加入5倍體積的DMEM培養液重懸，離心去上清；重複該洗滌步驟；然後加入1倍體積的DMEM培養液重懸，經自動細胞計數儀計數，獲得3. 5X10"5個細胞/ml，復甦率為35% (參見圖lb)。對照方法中，凍存液的成分是在DMEM培養液Gnvitrogen公司產品)中含有1XB27 添加劑 Qnvitrogen 公司產品)，1XN2 添加劑 anvitrogen 公司產品)，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM,丙酮酸鈉，終濃度為1. OmM,NAC，終濃度 1. OmM,01^0，終濃度7.5% (ν/ν),BSA (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. lg/ml。實施例2 獲取鼠腦組織皮層神經幹細胞1. OX 10~6個細胞，加入一定體積的凍存液，使細胞懸液的最終濃度為1. OX 10~6個細胞/ml，將細胞懸液在-20°c放置30分鐘，在_70°C放置12-16個小時，然後轉入液氮中凍存。1周後將液氮中的凍存細胞取出，在40°C水浴鍋中溫育2分鐘；加入10倍體積的 37°C預熱的復甦液重懸，離心去上清；加入5倍體積的DMEM培養液重懸，再次離心去上清； 重複前一步用DMEM再次洗滌；加入1倍體積的Hibernation培養基(購自hvitrogen公司)重懸，經自動細胞計數儀計數，獲得9. 4X 10"5個細胞/ml，復甦率為94% (參見圖2a)。本實施例中，凍存液的成分是在DMEM培養液Gnvitrogen公司產品)中含有0. 91XB27 添加劑(Invitrogen 公司產品)，0. 91XN2添加劑Qnvitrogen公司產品)，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 82mM丙酮酸鈉，終濃度為0. 91mM,NAC，終濃度 0. 91mM，EGF (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. 02 μ g/ml，bFGF (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. 02 μ g/ml，01^0，終濃度7.5% (ν/ν),BSA (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. lg/ml。復甦液的成分是在DMEM培養液Gnvitrogen公司產品)中含有
0. 95XB27 添加劑(Invitrogen 公司產品)，0. 95XN2 添力口齊[J (Invitrogen 公司產品)，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 9mM,丙酮酸鈉，終濃度為0. 95mM,NAC，終濃度 1. OmM,BSA,終濃度 0. Olg/mL·對比例2:獲取鼠腦組織皮層神經幹細胞1. 0X10~6個細胞，加入一定體積的凍存液，使細胞懸液的最終濃度為1. OX 10~6個細胞/ml，將細胞懸液在程序降溫儀中以1°C /分鐘的速度降溫至-150°C，然後轉入液氮中凍存。1周後將液氮中的凍存細胞取出，在37°C水浴鍋中解凍，加入5倍體積的DMEM培養液重懸，離心去上清；重複該洗滌步驟；然後加入1倍體積的DMEM培養液重懸，經自動細胞計數儀計數，獲得4. OX 10~5個細胞/ml，復甦率為40% (參見圖2b)。對照方法中，凍存液的成分是在DMEM培養液Qrwitrogen公司產品)中含有··0. 91XB27 添加劑(Invitrogen 公司產品)，0. 91XN2 添加劑(Invitrogen 公司產品)，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 82mM,丙酮酸鈉，終濃度為0. 91mM,NAC 終濃度 0.91mM，01^0，終濃度7.5% (ν/ν),BSA (購自 Invitrogen 公司)，終濃度 0. lg/ml。
權利要求
1.一種神經幹細胞凍存復甦的方法，包括以下步驟1)凍存步驟包括向神經幹細胞懸液中加入凍存液和在液氮中凍存的步驟；2)復甦步驟包括向從液氮中取出的凍存細胞中加入復甦液使細胞復甦的步驟；3)將復甦的細胞液洗滌後製備成細胞懸液備用。
2.權利要求1的方法，其中所述凍存液包含表皮生長因子(EGF)和鹼性成纖維細胞生長因子(WGF)。
3.權利要求2的方法，其中所述EGF在凍存液中的終濃度為0.005-0.04yg/ml、優選 0. 008-0. 03μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02μ g/ml。
4.權利要求2的方法，其中所述bFGF在凍存液中的終濃度為0.005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述凍存步驟包括將加入凍存液的神經幹細胞懸液低溫，優選在_15°C至_25°C，更優選在-18°C至_22°C，最優選在_20°C放置一段時間，然後在_65°C至_75°C，優選在-68°C至_72°C，最優選在_70°C放置12-16個小時，再轉入液氮中凍存。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM 丙酮酸鈉，終濃度為0. 8-1. 2mM N-乙醯半胱氨酸(NAC)，終濃度0. 8-1. 2mMEGF,終濃度 0. 005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml bFGF,終濃度 0· 005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml 二甲基亞碸(DMSO)，終濃度7-8% (ν/ν) 牛血清白蛋白(BSA)，終濃度0. 08-0. 12g/ml。
7.權利要求6的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM 丙酮酸鈉，終濃度為l.OmM NAC，終濃度1. OmM EGF，終濃度 0.01 μ g/ml bFGF，終濃度 0.01 μ g/ml DMSO，終濃度 7.5% (ν/ν) BSA，終濃度 0. 1 g/ml ο
8.權利要求6的方法，其中所述凍存液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM 丙酮酸鈉，終濃度為l.OmMNAC，終濃度1. OmM EGF,終濃度 0. 02 μ g/ml bFGF,終濃度 0. 02 μ g/ml DMS0，終濃度 7.5% (ν/ν) BSA，終濃度 0. 1 g/ml ο
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述復甦液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM 丙酮酸鈉,終濃度為0. 8-1. 2mM NAC，終濃度 0. 8-1. 2mM BSA,終濃度 0. 008-0. 012g/ml。
10.權利要求9的方法，其中所述復甦液為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM 丙酮酸鈉，終濃度為l.OmM NAC，終濃度1. OmM BSA，終濃度 0. 01g/ml
11.權利要求1-10任一項的方法，其中復甦的過程包括將液氮中的凍存細胞取出，在35°C至45°C，優選在38 V至42°C，最優選在40 V水浴中溫育1. 5-2. 5分鐘，然後加入復甦液重懸。
12.一種用於神經幹細胞凍存復甦的凍存液，其為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM 丙酮酸鈉,終濃度為0. 8-1. 2mM N-乙醯半胱氨酸(NAC)，終濃度0. 8-1. 2mMEGF，終濃度 0. 005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml bFGF,終濃度 0. 005-0. 04 μ g/ml、優選 0. 008-0. 03 μ g/ml，最優選 0. 01-0. 02 μ g/ml 二甲基亞碸(DMSO)，終濃度7-8% (ν/ν) 牛血清白蛋白(BSA)，終濃度0. 08-0. 12g/ml。
13.權利要求12的凍存液，其為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM 丙酮酸鈉,終濃度為l.OmM NAC，終濃度1. OmM EGF，終濃度 0.01 μ g/mlbFGF，終濃度 0. 01yg/ml 01^0，終濃度7.5% (ν/ν) BSA，終濃度 0. lg/mL·
14.權利要求12的凍存液，其為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為2. OmM 丙酮酸鈉，終濃度為l.OmM NAC，終濃度1. OmM EGF,終濃度 0. 02 μ g/ml bFGF,終濃度 0. 02 μ g/ml DMS0，終濃度 7.5% (ν/ν) BSA，終濃度 0. 1 g/ml ο
15.一種用於神經幹細胞凍存復甦的復甦液，其為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑，L-穀氨醯胺，終濃度為1. 6-2. 4mM 丙酮酸鈉，終濃度為0. 8-1. 2mM NAC，終濃度 0. 8-1. 2mM BSA，終濃度 0. 008-0. 012g/mL·
16.權利要求15的復甦液，其為DMEM或DMEM/F12培養液中包含 1XB27添加劑，1XN2添加劑， L-穀氨醯胺，終濃度為2mM 丙酮酸鈉，終濃度為ImM NAC，終濃度1. OmM BSA，終濃度 0. 01g/ml。
17.通過權利要求1-11任一項的方法製備的凍存復甦的神經幹細胞懸液，其中該細胞懸液中具有活性的神經幹細胞在90%以上。
全文摘要
本發明提供了一種神經幹細胞凍存、復甦的方法，並提供了通過該方法製備的細胞存活率在90％以上的凍存、復甦的神經幹細胞溶液。同時，本發明還提供了用於上述神經幹細胞凍存復甦方法所用的凍存液和復甦液。
文檔編號A01N1/02GK102228016SQ201110096959
公開日2011年11月2日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者姚靜, 楊立敏, 金宜強 申請人:上海安集協康生物技術有限公司