一種微生物溶菌酶微膠囊及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-28 10:18:56

專利名稱：一種微生物溶菌酶微膠囊及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物製劑和水產養殖領域，具體為一種微生物溶菌酶微膠囊及製備方法和應用。
背景技術：
現今，水產類食品遭受藥物汙染與危及人類健康的現象越來越嚴重，許多國家已明令禁止或限制抗生素等在飼料中的應用，因此，尋找天然安全的抗生素替代物是各國水產養殖業迫切需要解決的問題。微生物溶菌酶是由微生物分泌產生的一種能溶解細菌細胞壁的酶，因其比卵清溶菌酶具有更高的生產率和更廣泛的抑菌譜，近年來其在食品、醫學、酶工程和飼料工業上倍受關注，因而將其作為水產養殖中抗生素替代物的思路是極具意義的，然而因其蛋白質結構易受胃腸道環境的降解而在口服製劑的運用中依然受到限制。微膠囊技術是採用半透囊膜將物質包裹在囊內形成微膠囊，對芯材物質起保護及選擇性釋放的作用。其壁材有很多，海藻酸鈉是從褐藻中提取的聚陰離子天然雜多糖，其溶液可與多價陽離子(如Ca2+)交聯形成「蛋格」結構而瞬時凝膠化，此反應條件溫和，成膜能力強且可降解性較好，因而海藻酸鈉常被用作包埋藥物、蛋白質或細胞的壁材。然而單獨的海藻酸鈉壁材結構稀疏，因此加入輔助壁材可增加包埋物穩定性，提高藥物生物利用率，並且改變藥物釋放速率。殼聚糖是甲殼素經脫乙醯基後的產物，能溶於酸性溶液形成陽離子基團，易與帶負電荷的海藻酸鈉發生靜電絡合，使壁材膜更為緻密堅固。此兩者均資源豐富，價廉易得，相容性好，可生物降解，並均有報導具有免疫促進作用而適宜用於飼料添加劑。截止目前，尚未有利用海藻酸鈉/殼聚糖為壁材法製備微生物溶菌酶微膠囊的報導。

發明內容
本發明目的在於提供一種溶菌酶微膠囊。本發明還提供了上述溶菌酶微膠囊的製備方法和應用。本發明的溶菌酶微膠囊製備方法包括如下步驟(I)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，並攪拌；滴加攪拌時間為10 90分鐘，優選為20 50分鐘；優選的，所述海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液中，海藻酸鈉含量為O. 01 O. 03g/mL，溶菌酶的活性為5000 10000U/mL ；所述含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，殼聚糖含量為O. 001 O. 006g/mL,氯化鈣含量為O. 01 O. 04g/mL，醋酸的含量為I 5ml/L ;所述殼聚糖的脫乙醯度為75% 95% ;所述的海藻酸鈉與殼聚糖的用量比為1:1 1:10 ;(2)滴加完畢後固化O. 5 4小時，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠；優選的，固化時間為50 70分鐘；(3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預冷凍後進行冷凍乾燥；所述預冷凍溫度為-15 -25 0C，預凍時間為6 24h ;冷凍乾燥的溫度為-20 -28V，壓力為50 lOOPa，時間為18 36h。通過上述方法所製備的溶菌酶微膠囊，以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為 20000 30000U/g。上述溶菌酶微膠囊可用於製備魚飼料，尤其是製備異育銀鯽的飼料，用於異育銀鯽的養殖。在異育銀鯽的飼料中，以溶菌酶計，溶菌酶的含量為50000 250000U/kg。微生物溶菌酶在經過飼料加工中的高溫擠壓和長期保存過程，以及餵食後被魚體腸道消化環境的降解破壞而使得酶活損失率大，而達不到促進免疫、防病治病效果，本發明解決了上述技術問題。本發明通過製備一種以海藻酸鈉/殼聚糖為複合壁材的微生物溶菌酶微膠囊,添加於異育銀鯽飼料，其優勢在於經過飼料加工過程的高溫擠壓後，依然較高地保留微生物溶菌酶的活性；在常溫保存的過程中，微生物溶菌酶的穩定性可保持半年以上；飼餵養殖中，能經受水產動物胃中強酸和消化環境，在腸道中釋放並發揮有效的促生長保健效果，長期服用可以代替或部分代替抗生素對一些致病菌引起的疾病進行防治，解決抗生素使用帶來的抗藥性和藥物殘留問題，也有望運用於食品防腐添加劑、醫療等領域。
具體實施例方式下面以具體例子對本發明進行說明。實施例1取100ml 40g/L的海藻酸鈉溶液與100ml 2mg/mL溶菌酶溶液(溶菌酶的活性為5000U/mg)混合均勻，將上述混合溶液通過蠕動泵滴入到200ml含20g/L氯化鈣和50g/L殼聚糖(脫乙醯度為90%)及5mL/L醋酸的水溶液中，並以180rpm的速度攪拌，蠕動泵滴加速度為100滴/min (約4 6mL/min)。約40分鐘後滴加完畢，停止攪拌，固化I小時後，取固體用蒸餾水洗滌兩次，用紗布浙幹。-20°C下預冷凍12小時，-25°C、80pa下冷凍乾燥24小時。2%氯化鈣與O. 5%殼聚糖(脫乙醯度為90%)的O. 5% (v/v)醋酸水溶液中並不斷進行攪拌，10~6U/4所得到的溶菌酶微膠囊以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為23000 27000U/g。在常溫保存的過程中，微膠囊中溶菌酶的穩定性可保持半年以上。實施例2將上述製得的溶菌酶微膠囊進行異育銀鯽養殖試驗I材料與方法1.1試驗用魚與飼料製備試驗於2011年7月-9月在上海海洋大學特種水產養殖場進行。選用當年異育銀鯽，放於試驗池中用基礎飼料養殖40d，使其適應試驗條件，並消除試驗魚因營養和環境造成的差異。試驗分為11個組每組4個重複，每個重複30尾(初重28. 11±2. 14g)。根據異育銀鯽的營養需求制定飼料配方，製作基礎飼料。在基礎飼料中分別添加溶菌酶製品和其包被品，其中溶菌酶製品即酶活為5000U/mg的微生物溶菌酶晶體粉末；包被品是將微生物溶菌酶微膠囊用高速粉碎機粉碎成40目的粉末(溶菌酶含量為25000U/g)。溶菌酶組設置 5 個梯度10mg/kg,20mg/kg,30mg/kg,40mg/kg 和 50mg/kg (酶製劑 1-5);溶菌酶包被品組根據與溶菌酶組初始酶活相等的原則，將添加量分別設置為2g/kg,4g/kg,6g/kg,8g/kg和lOg/kg (包被組1-5)。以包被品lOg/kg組為對比，不足部分用纖維素補充。飼料原料與溶菌酶或者溶菌酶微膠囊逐級混合後製成直徑O. 5cm顆粒，常溫密閉保存。1. 2飼養管理飼養水源為經過120目篩絹過濾後的天然河水，室外養殖(溫度21_34°C)，每組網箱2m*0. 75m*1. 0m,間斷性充氣，使溶解氧控制在6_12mg/L，氨氮〈O. 5mg/L。每周換水1/2左右。試驗過程中每天按照魚體總重的3%左右投喂，參照前一天的攝食情況，酌情增加或減少投餌量。每天投餵三次(7:00，11:00，17:00)，每次分2輪投喂，每次投餵時間控制在30分鐘左右。投餵完I小時檢查攝食情況，以無殘餌為宜。1. 3實驗儀器與藥品1. 3.1主要儀器冰箱(_20°C );冷凍乾燥機；雙螺杆制粒機；固體樣品粉碎機；電熱恆溫鼓風乾燥箱；高速臺式離心機；電子天平；熱恆溫水浴鍋；生化培養箱；高壓滅菌鍋；722分光光度計；移液器；玻璃勻漿管。1. 3. 2 藥品溶菌酶試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、澱粉酶試劑盒、蛋白酶試劑盒購於南京建成生物過程研究所。1. 4測定指標1. 4.1生產性能養殖試驗結束後，每個重複組採樣10尾分別稱重測量體長，並稱取每個重複組總重。計算餌料係數、相對增重率。增重率(％ )=(末體重-初始體重)/初始體重X 100飼料係數(FCR) =投餵飼料總重/(終末總重-初始總重)1. 4. 2內源酶指標養殖試驗結束，採取試驗魚的腸道和肝胰臟測定其澱粉酶和蛋白酶的活力，採全血製備血清後測定其溶菌酶、S0D，採集脾臟測定其溶菌酶和SOD活力。1. 4. 3攻毒試驗養殖試驗結束後，每組選取體質健壯，規格均勻的試驗魚進行嗜水氣單胞菌的抗感染試驗。每組選取32尾，其中30尾隨機分成3組，每組10尾。試驗魚個體間體重無顯著差異。嗜水氣單胞菌取自上海海洋大學水生動物病原庫，接種於營養瓊脂平板培養48h後，用生理鹽水衝洗稀釋至109cfu/mL備用。每尾注射O. 5mL菌液，採用腹腔注射。另選取剩下2尾，注射O. 5mL生理鹽水，作為空白對照。試驗魚在80X50X45cm的周轉箱內暫養48h後，開始試驗，試驗期間水溫18-23°C，觀察120h內各組死亡情況(120h後試驗魚的死亡趨於穩定)並記錄。試驗期間全部投餵基礎組飼料。1. 5數據處理用SPSS 17. O軟體進行單因素方差分析，影響顯著者採用Duncan’s法進行多重比較比較。試驗結果以平均數土標準差表示。2 結果
2.1溶菌酶對異育銀鯽生長性能的影響表I顯示，包被品組相對增長率除I組和4組相對基礎組有顯著提高，其他組無顯著差異；溶菌酶組相對增重率5組與基礎組有顯著的降低而溶菌酶I組相對增重率相對基礎組有顯著提高，其他組和基礎組無顯著差異。包被品組餌料係數1、2組和3組相對基礎組有顯著降低，5組相對基礎組有顯著的升高；溶菌酶組除5組相對基礎組有顯著的提高，其他組相對基礎組無顯著差異。在相同的酶活條件下，溶菌酶包被品對異育銀鯽的生長性能的影響對比相同酶活溶菌酶組有明顯的優勢，在一定劑量範圍內可有效降低餌料係數。表I溶菌酶及其包被品對異育銀鯽生長性能的影響
權利要求
1.一種製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，並攪拌； (2)滴加完畢後固化0.5 4小時，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠； (3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預冷凍後進行冷凍乾燥。
2.權利要求1所述製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，步驟(I)中所述海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液中，海藻酸鈉含量為0. 01 0. 03g/mL，溶菌酶的活性為5000 10000U/mLo
3.權利要求1所述製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，步驟(I)中所述含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，殼聚糖含量為0. 001 0. 006g/mL，氯化鈣含量為0. 01 0. 04g/mL,醋酸的含量為I 5ml/L ;所述殼聚糖的脫乙醯度為75% 95% ;所述的海藻酸鈉與殼聚糖的用量比為1:1 1:10。
4.權利要求1所述製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，步驟(I)中的滴加攪拌時間為10 90分鐘。
5.權利要求1所述製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的固化時間為50 70分鐘。
6.權利要求1所述製備溶菌酶微膠囊的方法，其特徵在於，步驟(3)所述預冷凍溫度為-15 _25°C，預凍時間為6 24h ;冷凍乾燥的溫度為-20 _28°C，壓力為50 lOOPa，時間為18 36h。
7.一種溶菌酶微膠囊，其特徵在於，通過權利要求1 任一項所述的方法製備，以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為20000 30000U/g。
8.權利要求7所述溶菌酶微膠囊在製備魚飼料方面的應用。
9.權利要求7所述溶菌酶微膠囊在製備異育銀鯽的飼料方面的應用。
10.權利要求7所述溶菌酶微膠囊在製備異育銀鯽飼料方面的應用，其特徵在於，所述異育銀鯽的飼料中，以溶菌酶計，溶菌酶的含量為50000 250000U/kg。
全文摘要
本發明涉及微生物製劑和水產養殖領域，公開了一種溶菌酶微膠囊，通過以下方法製備(1)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，並攪拌；(2)滴加完畢後固化0.5～4小時，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠；(3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預冷凍後進行冷凍乾燥。這種微膠囊用於製備魚飼料，在經過飼料加工過程的高溫擠壓後，依然較高地保留微生物溶菌酶的活性；在常溫保存的過程中，微生物溶菌酶的穩定性可保持半年以上；飼餵養殖中，能經受水產動物胃中強酸和消化環境，在腸道中釋放並發揮有效的促生長保健效果。
文檔編號A23K1/18GK103005168SQ20121058028
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者李曉暉, 費國琴, 華雪銘, 邢思華, 寧喜斌 申請人:上海海洋大學