人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的新用途的製作方法
2023-04-28 10:25:16
專利名稱：人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及人溶菌酶的新用途，特別是人溶菌酶在治療痤瘡的藥物中的新用途。
背景技術：
抗生素創造了許多醫學奇蹟，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產褥熱、敗血症、結核等。21世紀的今天，耐藥菌的發展令人觸目驚心。如耐青黴素的肺炎鏈球菌，過去對青黴素、紅黴素、磺胺等藥品都很敏感，現在幾乎「刀槍不入」。肺炎克雷伯氏菌對西力欣、復達欣等16種高檔抗生素的耐藥性高達51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)除萬古黴素外已經無藥可治。從細菌的耐藥發展史可以看出，在某種新的抗生素出現以後，就有一批耐藥菌株出現。開發一種新的抗生素一般需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產生只要2年的時間，抗生素的研製速度遠遠趕不上耐藥菌的發展速度。目前急需開發一種針對不同耐藥菌株均有效的「超級抗生素」用於臨床治療。
發明內容
本發明的目的是提供一種人溶菌酶在製備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、蟎蟲和耐藥菌引起的痤瘡疾病的新用途。
實際上，本發明涉及人溶菌酶在製備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、蟎蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應用。
所述人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(穀氨酸-丙氨酸)2或(穀氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
所述藥物中含有人溶菌酶300U～300萬U/mL。藥物為噴霧劑、滴劑、乳膏劑或乳劑。藥物中還可以加入殺蟎止癢劑SM-650。
為了更好地理解本發明的實質，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗及結果來說明其在製藥領域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配製200毫升培養基為準，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌後接種甘油管種子，搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20-35℃，在恆溫床上培養36-48小時。進行種子罐培養，最後進行生產罐培養。將發酵表達完成的培養液進行提取純化，對提取純化的基因重組人溶菌酶濃縮液進行測蛋白、測活性保存。將純度95％基因重組人溶菌酶濃縮液溶於水中製得30000U/mL，磷酸鹽緩衝液20mM(pH7.0)、25％丙三醇、吐溫80，殺蟎止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)乾粉溶於水中製得1％備用。
一、基因重組人溶菌酶(HLZ)體外抗菌作用評價藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、對照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性單位50000單位/mg，美國SIGMA公司產品，批號L6876。
3、克拉黴素效價948μ/mg，中國藥品生物製品檢定所標準品，批號4、羅紅黴素效價878μ/mg，中國藥品生物製品檢定所標準品，批號5、注射用阿莫西林哈爾濱製藥廠產品，批號010504。
6、瓊脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羥甲基氨基甲烷(Tris)成都化學試驗廠，批號010211試驗菌株所用菌株均為2002.4～2003.9月於四川、北京地區收集的臨床分離致病菌。經本室用API方法重新鑑定後用於試驗。
質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單孢菌ATCC27853培養基1、Tris-HCl緩衝液0.1MTris 100ml，0.1MHCl 70ml，HighWater 800ml，測PH值，用HCl溶液調至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂瓊養基在Tris-Cl緩衝液中加入脂瓊糖116℃無菌後使用。
3、M-H培養基中國藥品生物製品檢定所產品，M-H肉湯培養基稱取25g加1000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌，116℃20分鐘。M-H固體培養基稱取36g，加1000ml蒸餾水，高壓滅菌，116℃20分鐘，用於革蘭陽性、陰性需氧菌的藥敏試驗。
4、血培養基，即在M-H培養基中加5-10％脫纖維兔血配製而成，用於腸球菌、鏈球菌的藥敏試驗。
試驗方法採用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將受試藥物用滅菌蒸餾水溶解，適當稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養基混勻，以二倍稀釋，製備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多點接種儀(DenleyA400，England)將稀釋至105CFU/ml的試驗菌液接種於各含藥平皿表面，置於37℃培養8-10小時，取出分別吸取6ml融化的M-H培養基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置於37℃培養10小時取出，觀察結果，以無細菌生長平皿內所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。
試驗結果(1)人溶菌酶對臨床分離菌株的體外抗菌活性見表1。
(2)人溶菌酶對379株臨床分離致病菌的MIC50、MIC90見表2。
根據以上試驗結果表明人溶菌酶體外具有一定抗菌作用，對耐藥菌株的抗菌活性也有很好的作用。人溶菌酶是一種小分子蛋白質，存在於機體的淚液、痰、鼻涕、白細胞和血清中，對多種革蘭氏陽性菌和少數革蘭氏陰性菌有殺菌作用，基因重組人溶菌酶(HumanLysozyme)主要切斷肽聚糖中N-乙醯葡萄糖胺和N-乙醯胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯結，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。
表1人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉黴素和羅紅黴素體外抗菌活性MIC細菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(萬μ/ml)mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml金葡MRSA02-22 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-23 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1＞1金葡MRSA02-26 0.025(0.03) 0.004(0.02) ＞1＞1金葡MRSA02-28 0.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1＞1金葡02-19-50.03(0.1) ＜0.002(0.001) ＞1＞1表葡MssE25 0.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-29 0.063(0.2)0.5(2.5) 0.03 0.5表葡MRSE 02-5 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.003) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-6 ＜0.001(0.005)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-2 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞11表葡MRSE 02-20-3 ＜0.001(0.003)0.004(0.02) ＞11表葡MRSE 02-20-4 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-5 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-6 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-20-7 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 1 1表葡MRSE 02-20-8 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-9 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-20-1 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-3 1(3) 0.015(0.08) ＞1＞1表葡MRSE 02-4 0.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5＞1
續表1MIC細菌HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(萬μ·/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/ml mg/ml表葡MRSE 02-100.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡MRSE 02-12＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡MRSE 02-11＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-150.008(0.024) 0.002(0.01) 1 ＞1表葡MRSE 02-170.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡MRSE 02-18＜0.001(0.003) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-200.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡MRSE 02-210.016(0.05)0.25(125) ＜0.001＜0.001表葡MRSE 02-220.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001丙酸桿菌02-7-40.008(0.02)4(20) 0.002 0.002丙酸桿菌02-7-50.008(0.02)0.25(0.63) ＜0.001＜0.001丙酸桿菌02-7-60.008(0.02)0.063(0.31) 0.008 0.25丙酸桿菌02-7-90.063(0.2) 0.125(0.63) 0.008 0.016丙酸桿菌02-7-70.125(0.4) 0.016(0.08) 0.032 0.25丙酸桿菌03-2-22 0.032(0.1) 0.5(2.5)1 1丙酸桿菌03-2-30 0.063(0.2) 4(10) ＞1＞1丙酸桿菌03-2-32 0.016(0.05)0.25(1.25) 0.008 0.5丙酸桿菌03-2-33 0.032(0.1) 2(10) ＞1＞1丙酸桿菌03-2-36 0.063(0.2) 4(20) 0.25 0.5丙酸桿菌03-2-37 0.032(0.1) ＞4(20) ＞11丙酸桿菌03-2-39 0.032(0.1) 0.5(2.5)0.51
續表1MIC細菌 HLZ CLZCLAROXmg/ml(萬μ/ml) mg/ml(萬μ/ml) mg/mlmg/ml大腸埃希菌03-2-41 0.032(0.1)0.5(2.5) ＞1 ＞1大腸埃希菌03-2-42 0.016(0.05) 0.5(2.5) 0.063 ＞1大腸埃希菌03-2-43 ＜0.001(0.003)＞4(20) 0.016 0.25大腸埃希菌03-2-45 0.032(0.1)2(10)0.250.5大腸埃希菌03-2-51 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 ＞1大腸埃希菌03-2-52 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 0.25大腸埃希菌03-2-53 0.008(0.024) 4(20)0.030.25大腸埃希菌032-54 0.032(0.1)1(5) ＞1 1大腸埃希菌03-2-56 0.032(0.1)＞4(20) 0.016 0.25大腸埃希菌03-2-57 ＜0.001(0.003)2(10)0.032 0.25大腸埃希菌03-2-58 ＜0.001(0.003)4(20)＞1 0.5大腸埃希菌03-2-59 0.032(0.1)4(20)0.125 0.25沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 0.5(0.25)0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 1(5) 0.008 0.016沙雷氏菌2-31-8 0.008(0.02) 0.125(0.63) 0.016 0.016肺炎克雷伯菌02-6-140.25(0.8) 1(5) 0.063 ＞1肺炎克雷伯菌02-6-180.5(1.5) ＞4(20) 0.5 1注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉黴素，ROX指羅紅黴索二、重組人溶菌酶(HLZ)加殺蟎止癢劑SM-650體外殺蟎作用評價1、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位300單位/mL試驗藥品及試劑
1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位300單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺蟎止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產單位北京耐特生化技術研究所試驗蟎蟲所用蟎蟲標本為第四軍醫大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺蟎蟲活性測定採用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺蟎止癢劑SM-650最低殺蟎濃度(MIC)。將蟎蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)300單位/mL，殺蟎止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片蟎蟲標本上，觀察結果，以最低殺蟎濃度(MIC)。
試驗結果見表3，結果表明人溶菌酶加殺蟎止癢劑SM-650體外殺蟎有殺滅作用。
表3
2、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位3000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位3000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺蟎止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，
生產單位北京耐特生化技術研究所試驗蟎蟲所用蟎蟲標本為第四軍醫大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺蟎蟲活性測定採用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺蟎止癢劑SM-650最低殺蟎濃度(MIC)。將蟎蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)3000單位/mL，殺蟎止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片蟎蟲標本上，觀察結果，以半數殺蟎濃度(MBC)。
試驗結果見表4，結果表明人溶菌酶加殺蟎止癢劑SM-650體外殺蟎有殺滅作用。
表4
3、基因重組人溶菌酶濃縮液活性單位30000單位/mL試驗藥品及試劑1、基因重組人溶菌酶濃縮液(Human Lysozyme HLZ)活性單位30000單位/mL，由大連奇龍生物技術研究所提供，2、殺蟎止癢劑SM-650白色粉未，純度為≥99％，ph6～8，生產單位北京耐特生化技術研究所試驗蟎蟲所用蟎蟲標本為第四軍醫大學臨床門診痤瘡病人。
試驗方法體外殺蟎蟲活性測定採用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺蟎止癢劑SM-650最低殺蟎濃度(MIC)。將蟎蟲標本分離到玻片上，用人溶菌酶(HLZ)30000單位/mL，殺蟎止癢劑SM-650 1％/Ml。滴到玻片蟎蟲標本上，觀察結果，以無活蟎蟲為殺蟎濃度。
試驗結果見表5，結果表明人溶菌酶加殺蟎止癢劑SM-650體外殺蟎有殺滅作用。
表5
採用圖片法測定了人溶菌酶(HLZ)加殺蟎止癢劑SM-650對臨床分離五人份的蟎蟲標本體外殺蟎作用，結果表明人溶菌酶加殺蟎止癢劑SM-650對蟎蟲有殺滅作用。殺蟎止癢劑SM-650最低殺蟎濃度MICRange為0.2％～2％。人溶菌酶(HLZ)活性單位300單位/ml～30000萬單位/ml。由大連奇龍生物技術研究所研製的基因重組人溶菌酶(Human Lysozyme)具有其它溶菌酶相同作用機制，主要切斷肽聚糖中N-乙醯葡萄糖胺和N-乙醯胞壁酸之間的β-1、4糖苷鍵之間的聯結，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。殺蟎止癢劑SM-650產品有很強的殺蟎作用。
以上結果，可以得出本發明的優點在於
(1)本發明對基因重組人溶菌酶發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
(2)本發明基因重組人溶菌酶安全無毒副作用，有很好的藥用前景。
(3)本發明的基因重組人溶菌酶來源豐富，製備工藝簡單，並可做成噴霧劑、滴劑、奶液、乳劑、乳膏劑等，使用方便，
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述實施例1基因重組人溶菌酶經高壓滅菌後接種甘油管種子，搖床轉數為每分鐘250轉，培養溫度為20℃，在恆溫床上培養36小時。進行種子罐培養後進行生產罐培養。將發酵表達完成的培養液進行提取純化，對提取純化的蛋白濃縮液冰凍乾燥，測定蛋白量、純度和溶菌酶活性保存。將純度95％的基因重組人溶菌酶製得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80，在常溫下混合均質，(在符合GMP要求的製藥工廠，按製藥規程完成)製成噴霧劑、滴劑。
實施例2將純度95％的基因重組人溶菌酶製得300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩衝液10(pH6.0)80％、20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、萬分之三吐溫80，殺蟎止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％，在常溫下混合均質，製成噴霧劑、滴劑。
實施例3將純度95％的基因重組人溶菌酶製得300U～300萬U/ml/g，磷酸鹽緩衝液20mM(pH7.0)85％、20％丙二醇、卡波樹脂1％、香精0.3％殺蟎止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％，在70℃下混合均質，重組人溶菌酶在常溫下與其它原料混合均質，製成乳膏劑、乳劑。
權利要求
1.人溶菌酶在製備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、蟎蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的應用，其特徵是人溶菌酶為基因工程表達的重組人溶菌酶、基因工程表達人溶菌酶的氨基端帶有(穀氨酸-丙氨酸)2或(穀氨酸-丙氨酸)3修飾的人溶菌酶或基因工程表達或化學合成突變體重組人溶菌酶。
3.根據權利要求1所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的應用，其特徵是藥物中含有活性300U～300萬U/mL人溶菌酶。
4.根據權利要求1所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的應用，其特徵是藥物為噴霧劑、滴劑、乳膏劑或乳劑。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡和蟎蟲的藥物中的應用，其特徵是藥物中還含有殺蟎止癢劑SM-650。
6.根據權利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡的藥物中的應用，其特徵是藥物為噴霧劑、滴劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩衝液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、萬分之五吐溫80製成。
7.根據權利要求5所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡和蟎蟲的藥物中的應用，其特徵是藥物為噴霧劑、滴劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/mL，磷酸鹽緩衝液10(pH6.0)80％、20％丙二醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、萬分之三吐溫80，殺蟎止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％製成。
8.根據權利要求5所述的人溶菌酶在製備治療痤瘡和蟎蟲的藥物中的應用，其特徵是藥物為乳膏劑、乳劑，由基因重組人溶菌酶300U～300萬U/ml/g，磷酸鹽緩衝液20mM(pH7.0)85％、20％丙二醇、卡波樹脂1％、香精0.3％殺蟎止癢劑SM-650純度為≥99％，ph6～8(商品)1％製成。
全文摘要
本發明涉及人溶菌酶的新用途，特別是人溶菌酶在治療痤瘡的藥物中的新用途。本發明是人溶菌酶在製備治療由金黃色葡萄球菌、表葡菌、丙酸桿菌、蟎蟲和耐藥菌引起的痤瘡的藥物中的應用。藥物可做成噴霧劑、滴劑、膏劑等。本發明基因重組人溶菌酶發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。安全無毒副作用，有很好的藥用前景。並且基因重組人溶菌酶來源豐富，製備工藝簡單，使用方便。
文檔編號A61K38/47GK1583169SQ20041002073
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月10日 優先權日2004年6月10日
發明者安米 申請人:安米