一種疫苗組合物、試劑盒及應用的製作方法

2023-04-28 19:06:36

本發明屬於獸用生物製品領域，具體涉及一種含犬瘟熱病毒抗原及其他常見犬病病毒抗原的疫苗組合物、試劑盒及其製備方法和應用。

背景技術：

犬瘟熱病毒(caninedistempervirus,cdv)是世界範圍內存在的一種高發病率、高死亡率病毒性疾病，伴隨著生態環境的變化及動物和病毒的進化，其宿主已由傳統的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)動物擴展到食肉目所有8個科及偶蹄目豬科、靈長目獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物，並且呈現不斷擴大的趨勢。

犬細小病毒(canineparvovirus,cpv)所引發的疾病發病急、病程短、死亡率高，傳染性強，可感染各種年齡、性別、品種的犬、狐狸、水貂、貉子和狼，特別易感染幼齡動物(8周齡內的發病死亡率高達70％，1歲內的死亡率也達30％)。

犬腺病毒(canineadenovirus,cav)是哺乳動物腺病毒屬中致病性最強的一種病毒，有2個血清型，其中i型腺病毒(cav-i)引起犬傳染性肝炎(ich)和狐狸腦炎(fe)；ii型腺病毒(cav-ii)則引起犬的傳染性喉氣管炎和腸炎。

狂犬病病毒(rabiesvirus,rv)的主要宿主為犬、貓等動物，為人畜共患傳染病，多數的人狂犬病是與人類密切接觸的帶毒犬或貓傳播的，其危害已經引起廣泛關注。

犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus,cpiv)主要感染犬的呼吸道，臨床表現發熱、流涕和咳嗽，病理變化以卡他性鼻炎和支氣管炎為特徵。

犬冠狀病毒(caninecoronavirus,ccv)呈急性胃腸炎綜合症，導致食慾缺乏、腹瀉、嘔吐等，是養犬業與養狐業危害較大的疾病之一。

犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola，lep)有十幾個血清型，均能引起發病，且為人畜共患病；國內以黃疸出血型和犬型的致病力最高，其中黃疸出血型常致急性出血性黃石綜合症，犬型以腎炎症狀為主。

臨床上cdv單獨感染約佔20％左右，與其它病毒(包括cpv、cav、rv、cpiv、ccv、lep)的混合感染高達50％以上，特別地混合感染的病例治癒率比單純感染率低40％。而目前所使用的犬用疫苗疫苗根據犬不同日齡和不同免疫程序單獨或混合免疫，但是這些疫苗中犬瘟熱病毒抗原都為上世紀30-40年代在北美流行的毒株onderstepoort株或synderhill株，與流行的cdv病毒差異極大，存在免疫逃避的可能，特別是在這些進口疫苗自引入國內起的臨床病例中，犬瘟熱單獨或混合感染均未得到顯著抑制或減少的現象，仍然給寵物犬、養犬業和毛皮經濟動物等養殖行業造成極大危害和嚴重的損失。

技術實現要素：

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種含犬瘟熱病毒抗原的疫苗組合物，該疫苗組合物可以有效預防和/或治療包括犬瘟熱病毒在內的多種病原的感染。

本發明涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的犬瘟熱病毒抗原、免疫量的其他抗原和獸醫學上可接受的載體；其中，所述犬瘟熱病毒抗原為基因組中含有編碼seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或編碼seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟熱病毒抗原，所述犬瘟熱病毒抗原包括滅活的全病毒抗原和/或至少一種亞單位抗原。本發明的疫苗組合物對於現在流行的cdv病毒株的攻毒能夠有效地預防，且能同時預防和治療多種病原的感染。

本發明還涉及一種所述疫苗組合物的製備方法。

本發明還涉及一種所述疫苗組合物在製備預防和/或治療犬瘟熱相關疾病的藥物中的應用。

本發明還涉及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括免疫量的犬瘟熱病毒抗原、免疫量的其他抗原和獸醫學上可接受的載體，其中，所述犬瘟熱病毒抗原為基因組中含有編碼seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或編碼seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟熱病毒抗原，所述犬瘟熱病毒抗原包括滅活的全病毒抗原或至少一種亞單位抗原；所述試劑盒中犬瘟熱病毒抗原與其他抗原為滅活抗原和/或亞單位抗原形式時，犬瘟熱病毒抗原與其他抗原混合後放置；所述犬瘟熱病毒抗原為滅活抗原和/或亞單位抗原形式，所述其他抗原中包含活抗原形式成分時，所述活抗原形式抗原成分與滅活抗原和/或亞單位抗原形式抗原成分分別放置。

本發明還涉及一種所述試劑盒的製備方法。

本發明還涉及所述試劑盒在製備預防和/或治療犬瘟熱相關疾病的藥物中的應用。

本發明的有益效果：本發明所製備的疫苗組合物、試劑盒對當前流行的犬瘟熱單獨或混合感染有良好的預防和控制效果。

具體實施方式

以下，對本發明的實施方式進行說明。

本發明涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的犬瘟熱病毒抗原、免疫量的其他抗原和獸醫學上可接受的載體；其中，所述犬瘟熱病毒抗原為基因組中含有編碼seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或編碼seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟熱病毒抗原，所述犬瘟熱病毒抗原包括滅活的全病毒抗原和/或至少一種亞單位抗原。

術語「疫苗組合物」又稱免疫原性組合物，是指一種含免疫原的製劑，包括如蛋白質、肽、全細胞、滅活的、亞單位或減毒的活的病毒或細菌，或者多糖，或其組合，其被施用來刺激受體對存在於免疫原性組合物中一種或多種抗原的體液和細胞免疫反應。免疫接種是施用疫苗組合物並在宿主中刺激對抗原的免疫或免疫原性反應的過程。優選的宿主為哺乳動物諸如犬。

術語「免疫量」應當理解為「免疫有效量」，又稱免疫保護量或產生免疫應答的有效量，為可在接受者體內有效誘導免疫應答的抗原量，該量足以預防或改善疾病的體徵或症狀，包括不利的健康影響或其併發症。所述免疫應答可能足以用於診斷目的或其它試驗，或可能適合用於預防疾病的徵兆或症狀，包括由病原體引起的感染所造成的不利的健康結果或其併發症。體液免疫力或由細胞介導的免疫力或此二者均可被誘導。動物對免疫原性組合物的免疫應答可通過例如測量抗體效價、淋巴細胞增殖分析而間接評估，或在以野生型毒株攻擊後通過監測徵兆或症狀來直接評估，而該由疫苗提供的保護性免疫力可通過測量例如受試者的臨床徵兆如死亡率、發病率的減少、溫度數值、受試者總體生理狀況及總體健康和表現來評估。所述免疫應答可包括但不限於誘導細胞性和/或體液免疫力。

術語「犬瘟熱病毒」(caninedistempervirus，cdv)是指隸屬於副粘病毒科麻疹病毒屬的感染犬科、鼬科和浣熊科等的單股負鏈不分節段rna病毒，所引發的臨床症狀包括雙相熱、發燒、呼吸困難、可見皮膚發紅、眼有大量分泌物、鼻流膿性分泌物、後肢不能站立的自然發病而死；剖檢肺臟大面積出血壞死、脾臟腫大、腸繫膜淋巴結腫大。

術語「犬瘟熱病毒抗原」是指至少含有一種犬瘟熱病毒抗原形式的任何組合物，所述犬瘟熱病毒抗原可誘導、刺激或能抵抗犬瘟熱病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、減毒的活的或亞單位的抗原，所述亞單位抗原為包含h蛋白、f蛋白和/或m蛋白。減毒和滅活方法是本領域技術人員熟知的。減毒方法包括但不限於在細胞培養物中在核實的細胞系上連續傳代(病毒和一些細菌)、在肉湯培養物中連續傳代(細菌)、紫外線照射(病毒和細菌)和化學誘變(病毒和細菌)。病毒或細菌的滅活方法包括但不限於用福馬林、β-丙內酯(betapropriolactone,bpl)或二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)處理或本領域技術人員已知的其他方法。

術語「獸醫學上可接受的載體」是指在本發明疫苗組合物中其他成分，不刺激機體不阻礙使用化合物的生物學活性和特性的載體或者稀釋劑，優選為佐劑。術語「佐劑」可包括鋁膠佐劑；皂苷(saponin)，如quila、qs-21(cambridgebiotechincorporation,cambridgema)、gpi-0100(galenicapharmaceuticalsincorporation，birminghamal)；油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基(alkenyl)衍生物的共聚物選出的化合物。

作為本發明的一種實施方式，本發明的疫苗組合物中所述犬瘟熱病毒抗原為犬瘟熱病毒c/hn/001株抗原，所述犬瘟熱病毒c/hn/001株(caninedistempervirus,strainc/hn/001)保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno.v201604，保藏地址為中國武漢·武漢大學，保藏日期為2016年3月29日。

作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒滅活的全病毒抗原的含量為滅活前103-109tcid50/ml。

術語「tcid50」是指組織培養感染劑量，並且其被定義為感染50％的給定批次的已接種細胞培養所需的病毒稀釋。各種方法可用於計算tcid50，包括sperman-karber方法，其用在通篇說明書中。關於spearman-karber方法的描述，參見bwmahy,hokangro.virologymethodsmanual,1996:25-46。在本發明中當抗原含量為滅活抗原含量時，表示滅活前的抗原含量。

作為本發明的一種優選實施方式，所述犬瘟熱病毒滅活的全病毒抗原的含量為滅活前104-106tcid50/ml。作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒亞單位抗原包括h蛋白，所述h蛋白胺基酸序列為seqidno.2所示序列。

作為本發明的一種實施方式，所述h蛋白含量為10-200μg/ml。

作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒亞單位抗原還包括f蛋白和/或m蛋白，所述f蛋白胺基酸序列為seqidno.4所示序列。

作為本發明的一種實施方式，所述f蛋白含量為10-160μg/ml，所述m蛋白含量為10-180μg/ml。

作為本發明的一種實施方式，所述其他抗原包括犬細小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬鉤端螺旋體抗原、犬冠狀病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼腸病毒抗原、犬偽狂犬病毒抗原、犬輪狀病毒抗原、犬皰疹病毒抗原、犬病毒性乳頭瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒抗原、支氣管敗血波氏桿菌抗原的一種或多種。

術語「犬細小病毒抗原」指至少含有一種犬細小病毒(canineparvovirus，cpv)抗原形式的任何組合物，所述犬細小病毒抗原可誘導、刺激或能抵抗犬細小病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬細小病毒抗原包括活的抗原如吉林省五星動物保健藥廠生產的犬五聯活疫苗的cpvcr86106株，楊凌綠方生物工程有限公司生產的犬五聯活疫苗的cpvan1株，輝瑞公司生產的犬多聯苗的cpvnl-35-d株，英特威公司生產的犬四聯疫苗的cpv154株，梅裡亞公司生產的犬多聯苗的cpv115-780916株，海博萊公司生產的犬多聯苗的cpvc-780916株；滅活的抗原如中國專利cn102657860a公開的cpv毒株，jl09-11株(參見孫相鑫，犬細小病毒jl09-11株得分離鑑定及免疫研究.中國人民解放軍軍事醫學科學院博士學位論文.2011)，nl-35-d株(參見siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)，cpvjs12株(參見李月華等.犬細小病毒js12株vp2基因的分子特徵及其在大腸桿菌中的表達.中國獸醫科學,2013,43(10):991-998)；亞單位的抗原如含cpv抗原性蛋白vp2蛋白或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術語「犬腺病毒ii型抗原」指至少含有一種犬腺病毒ii型(canineadenovirus-ii，cav-ii)抗原形式的任何組合物，所述犬腺病毒ii型抗原可誘導、刺激或能抵抗犬腺病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬腺病毒ii型抗原包括活的抗原如吉林省五星動物保健藥廠生產的犬五聯活疫苗的cav-iiyca18株，楊凌綠方生物工程有限公司生產的犬五聯活疫苗的cav-iixn3株，輝瑞公司生產的犬多聯苗的cav-iinl-cpi株，英特威公司生產的犬四聯疫苗的cav-iimanhattanlpv3株，梅裡亞公司生產的犬多聯苗的cav-iicgf2004/75株、海博萊公司生產的犬多聯苗的cav-iimanhattan株，亞單位的抗原如含cav抗原性蛋白e3蛋白或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術語「狂犬病毒抗原」指至少含有一種狂犬病毒(rabiesvirus,rv)抗原形式的任何組合物，所述狂犬病毒抗原可誘導、刺激或能抵抗狂犬病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述狂犬病毒抗原包括活的抗原如乾元浩生物公司生產的狂犬活疫苗的rvflury株，rvrb/e3株(參見中國專利cn1876181a)；滅活的抗原如吉林正業公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvflurylep株，上海海利公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvsad株，中國人民解放軍軍事醫學科學院研製的狂犬病滅活疫苗的rvcvs-11株，唐山怡安生物工程公司等生產的狂犬病滅活疫苗的rvctn-1株，英特威公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvpasteurriv株、輝瑞公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvhcp-sad株、梅裡亞公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvg52株、維克公司生產的狂犬病滅活疫苗的rvvp12株；亞單位的抗原如含rv抗原性蛋白g蛋白或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術語「犬副流感病毒抗原」是指至少含有一種犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)抗原形式的任何組合物，所述犬副流感病毒抗原可誘導、刺激或能抵抗犬副流感病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬副流感病毒抗原包括活的抗原如cy-c株(保藏號為cgmccno.5268，參見中國專利cn102343088a)，a-20/8株(參見中國專利cn1876181a)，xn-4株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分離與鑑定.第四軍醫大學學報，2000,21(6):722-724)，solvary株(金昌德，李六金，婁慶林等.犬副流感流行毒株的分離鑑定.中國畜禽傳染病,1997(1):24-27)，以kc-plus呈現的活減毒犬副流感病毒d008株、以canixindhppi/l呈現的活減毒犬副流感病毒manhattan株、以duramunedappi呈現的活減毒犬副流感病毒fdl株、以vanguard7呈現的活減毒犬副流感病毒nl-cpi-5株、以和/或kc呈現的活減毒犬副流感病毒cornell株，以吉林省五星動物保健藥廠生產的犬五聯活疫苗的犬副流感病毒a-20/8株，和/或來自naramunetm、univac2、univac5、kennel-jectm、plus5的活減毒的犬副流感病毒毒株；滅活的抗原如犬副流感病毒d008株(美國atcc保存，保藏號為vr-399)，xn931株(金昌德，李六金，施新猷等.犬副流感病毒流行毒株的分離與鑑定.第四軍醫大學學報，2000,21(6):719-721)，xn934株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分離與鑑定.第四軍醫大學學報，2000,21(6):722-724)，78238株(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所主編.獸醫微生物學.北京:中國農業出版社,1998:414-415)、yz0506株(岑皓.犬副流感病毒的分離及單克隆抗體的製備.揚州大學碩士學位論文,2007)；亞單位抗原如含cpiv免疫原性蛋白f(fusionprotein，即融合蛋白)、hn(hemagglutinin-neuraminidase，即血凝素神經氨酸酶)、m(matrixprotein，即基質蛋白)、np(nucleocapsidprotein，即核衣殼蛋白)、p(phosphopritein，即磷蛋白)和/或l(largeprotein，即大蛋白)蛋白或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術語「犬冠狀病毒抗原」是指至少含有一種犬冠狀病毒(caninecoronavirus,ccv)抗原形式的任何組合物，所述犬冠狀病毒抗原可誘導、刺激或能抵抗犬冠狀病毒感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬冠狀病毒抗原包括活的抗原如ccvys1/v60株(參見中國專利cn1876181a)；滅活的抗原如輝瑞公司生產的犬多聯苗的ccvnl-18株；亞單位抗原如含ccv免疫原性蛋白s蛋白或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術語「犬鉤端螺旋體抗原」是指至少含有一種犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola，lep)抗原形式的任何組合物，所述犬鉤端螺旋體抗原可誘導、刺激或能抵抗犬鉤端螺旋體感染的免疫應答，所述抗原形式包括但不限於滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬鉤端螺旋體抗原包括活的抗原如外膜蛋白(outermembraneprotein,omps)，滅活的抗原如輝瑞公司生產的犬多聯苗的lep犬型c-51株、黃疸型nadl11403株，英特威公司生產的犬多聯苗的lep犬型ca-12-000株、鉤端型820k株；亞單位抗原如含lep免疫原性蛋白、外膜蛋白(omps)或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

作為本發明的一種優選實施方式，所述其他抗原包括犬細小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬鉤端螺旋體抗原、犬冠狀病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原的一種或多種。

作為本發明的一種實施方式，所述犬細小病毒抗原包括cpvcr86106株抗原、cpvan1株抗原、cpvnl-35-d株抗原、cpv154株抗原、cpv115-780916株抗原、cpvc-780916株抗原，cpvjl09-11株抗原、cpvjs12株抗原、cpvvp2亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬腺病毒ii型抗原包括cav-iixn9株抗原、cav-iiyca18株抗原、cav-iixn3株抗原、cav-iinl-cpi株抗原、cav-iimanhattanlpv3株抗原、cav-iicgf2004/75株抗原、cav-iimanhattan株抗原，cave3亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合；所述狂犬病病毒抗原包括rvflury株抗原、rvrb/e3株抗原、rvflurylep株抗原、rvsad株抗原、rvcvs-11株抗原、rvctn-1株抗原、rvpasteurriv株抗原、rvhcp-sad株抗原、rvg52株抗原、rvvp12株抗原；rvg亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬副流感病毒抗原包括cy-c株抗原、a-20/8株抗原、solvary株抗原、d008株抗原、manhattan株抗原、fdl株抗原、nl-cpi-5株抗原、cornell株抗原、a-20/8株抗原、naramunetm、univac2、univac5、kennel-jectm、plus5的犬副流感病毒毒株抗原、xn931株抗原、xn934株抗原、78238株抗原、yz0506株抗原、亞單位抗原cpivf亞單位蛋白抗原、hn亞單位蛋白抗原、m亞單位蛋白抗原、np亞單位蛋白抗原、p亞單位蛋白抗原、或l亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬冠狀病毒抗原包括ccvys1/v60株抗原、nl-18株抗原、ccvs亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；以及所述犬鉤端螺旋體抗原包括外膜蛋白抗原、lep犬型c-51株抗原、黃疸型nadl11403株抗原、lep犬型ca-12-000株抗原、鉤端型820k株抗原、lep亞單位蛋白抗原、外膜蛋白或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合。

作為本發明的一種實施方式，所述獸醫學上可接受的載體包括佐劑，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐劑系統、blockco-polymer、saf-m、單磷醯脂質a、avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、ims1314、胞壁醯二肽或gel佐劑中的一種或幾種。

術語「乳劑」可尤其基於輕液體石蠟油(europeanpharmacopea類型)；因烯烴寡聚產生的類異戊二烯油(isoprenoidoil)，如角鯊烷(squalane)或角鯊烯油(squaleneoil)，尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇(mannide)的酯(如無水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們任選乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic產品，特別是l121。參見hunter等編寫的《thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》(ed.bydesstewart-tull,johnwileyandsons,newyork,1995:51-94)和todd等編寫的《vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用powellm和newmanm編寫的《vaccinedesign,thesubunitandadiuvantapproach》(plenumpress,1995)第147頁描述的spt乳劑及第183頁描述的mf59乳劑。術語「丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物」優選為交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是與糖(sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯，這些化合物已知被稱為卡波姆(carbomer，商品名carbopol)(phameuropa,1996,8(2))。本領域技術人員還可參見美國專利us2909462，其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯，所述化合物具有至少3個羥基，優選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂烴基(aliphaticradical)取代。優選的基團是那些含有2-4個碳原子的基團，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團(ethylenicallyunsaturatedgroup)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基，如甲基。這些產品以卡波普的名義出售，(bfgoodrich,ohio,usa)特別合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交聯。這其中可提及卡波普974p、934p和971p，最優選使用卡波普971p。術語「順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物」也可考慮順丁烯二酸酐與乙烯的共聚物ema(monsanto)，這些聚合物在水中溶解產生酸性溶液，經中和，優選中和至生理ph，以便產生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。術語「佐劑」還包括，但不限於，ribi佐劑系統(ribiincorporation)、blockco-polymer(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、單磷醯脂質a(monophosphoryllipida)、avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素、ims1314、胞壁醯二肽、gel佐劑等。優選地，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐劑系統、blockco-polymer、saf-m、單磷醯脂質a、avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、ims1314、胞壁醯二肽或gel佐劑中的一種或幾種。

本發明的疫苗組合物可直接施用於肌內、鼻腔或皮下，用於腸胃外施用的合適的方法包括肌內、滴鼻和皮下注射。作為本發明的一種優選實施方式，所述藥物經肌肉注射給藥。

本發明還涉及所述疫苗組合物的製備方法，其中，所述製備方法包括：(1)分別製備所述犬瘟熱病毒抗原、所述其他抗原；以及(2)按比例將所述步驟(1)中所述製備的犬瘟熱病毒抗原、其他抗原放置，添加獸醫學上可接受的載體。

本發明還涉及所述疫苗組合物在製備預防和/或治療犬瘟熱相關疾病的藥物中的應用。

術語「預防和/或治療」在涉及犬瘟熱病毒感染時是指抑制犬瘟熱病毒的複製、抑制犬瘟熱病毒的傳播或防止犬瘟熱病毒在其宿主體內定居，以及減輕犬瘟熱病毒感染的疾病或病症的症狀。若病毒荷載量減少、病症減輕和/或攝食量和/或生長增加，那麼就可以認為所述治療達到了治療效果。

本發明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括免疫量的犬瘟熱病毒抗原、免疫量的其他抗原和獸醫學上可接受的載體，其中，所述犬瘟熱病毒抗原為基因組中含有編碼seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或編碼seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟熱病毒抗原，所述犬瘟熱病毒抗原包括滅活的全病毒抗原或至少一種亞單位抗原；所述試劑盒中犬瘟熱病毒抗原與其他抗原為滅活抗原和/或亞單位抗原形式時，犬瘟熱病毒抗原與其他抗原混合後放置；所述犬瘟熱病毒抗原為滅活抗原和/或亞單位抗原形式，所述其他抗原中包含活抗原形式成分時，所述活抗原形式抗原成分與滅活抗原和/或亞單位抗原形式抗原成分分別放置。

作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒抗原為犬瘟熱病毒c/hn/001株抗原，所述犬瘟熱病毒c/hn/001株(caninedistempervirus,strainc/hn/001)保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno.v201604，保藏地址為中國武漢·武漢大學，保藏日期為2016年3月29日。

作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒滅活的全病毒抗原的含量為滅活前103-109tcid50/ml。

作為本發明的一種優選實施方式，所述犬瘟熱病毒滅活的全病毒抗原的含量為滅活前104-106tcid50/ml。

作為本發明的一種實施方式，所述犬瘟熱病毒亞單位抗原包括h蛋白，所述h蛋白胺基酸序列為seqidno.2所示序列，所述h蛋白含量為10-200μg/ml。

作為本發明的一種優選實施方式，所述犬瘟熱病毒亞單位抗原還包括f蛋白和/或m蛋白，所述f蛋白胺基酸序列為seqidno.4所示序列；所述f蛋白含量為10-160μg/ml，所述m蛋白含量為10-180μg/ml。

作為本發明的一種實施方式，所述其他抗原包括犬細小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬鉤端螺旋體抗原、犬冠狀病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼腸病毒抗原、犬偽狂犬病毒抗原、犬輪狀病毒抗原、犬皰疹病毒抗原、犬病毒性乳頭瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒抗原、支氣管敗血波氏桿菌抗原中的一種或多種。

作為本發明的一種優選實施方式，所述其他抗原包括犬細小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬鉤端螺旋體抗原、犬冠狀病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原的一種或多種。

作為本發明的一種實施方式，所述犬細小病毒抗原包括cpvcr86106株抗原、cpvan1株抗原、cpvnl-35-d株抗原、cpv154株抗原、cpv115-780916株抗原、cpvc-780916株抗原，cpvjl09-11株抗原、cpvjs12株抗原、cpvvp2亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬腺病毒ii型抗原包括cav-iixn9株抗原、cav-iiyca18株抗原、cav-iixn3株抗原、cav-iinl-cpi株抗原、cav-iimanhattanlpv3株抗原、cav-iicgf2004/75株抗原、cav-iimanhattan株抗原、cave3亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述狂犬病病毒抗原包括rvflury株抗原、rvrb/e3株抗原、rvflurylep株抗原、rvsad株抗原、rvcvs-11株抗原、rvctn-1株抗原、rvpasteurriv株抗原、rvhcp-sad株抗原、rvg52株抗原、rvvp12株抗原、rvg亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬副流感病毒抗原包括cy-c株抗原、a-20/8株抗原、solvary株抗原、d008株抗原、manhattan株抗原、fdl株抗原、nl-cpi-5株抗原、cornell株抗原、a-20/8株抗原、naramunetm、univac2、univac5、kennel-jectm、plus5的犬副流感病毒毒株抗原、xn931株抗原、xn934株抗原、78238株抗原、yz0506株抗原、亞單位抗原cpivf亞單位蛋白抗原、hn亞單位蛋白抗原、m亞單位蛋白抗原、np亞單位蛋白抗原、p亞單位蛋白抗原、或l亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；所述犬冠狀病毒抗原包括ccvys1/v60株抗原、nl-18株抗原、ccvs亞單位蛋白抗原或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合；以及所述犬鉤端螺旋體抗原包括外膜蛋白抗原、lep犬型c-51株抗原、黃疸型nadl11403株抗原、lep犬型ca-12-000株抗原、鉤端型820k株抗原、lep亞單位蛋白抗原、外膜蛋白或其結構域的抗原，以及這些抗原形式組分的混合。

作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒中活抗原部分還包括凍幹保護劑，所述滅活抗原和/或亞單位抗原部分還包括佐劑；所述凍幹保護劑包括脫脂牛奶、明膠、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、穀氨酸鈉、vc、蔗糖、甘氨酸和/或精氨酸中的一種或幾種；所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐劑系統、blockco-polymer、saf-m、單磷醯脂質a、avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、ims1314、胞壁醯二肽或gel佐劑中的一種或幾種。術語「犬」通常被稱為狗者，但也包括犬科家族的其他成員如狼、貉子、狐狸。

本發明還涉及所述試劑盒的製備方法，其中，所述製備方法包括：步驟(1)分別製備所述犬瘟熱病毒抗原、所述其他抗原；以及步驟(2)按比例將所述步驟(1)中所述製備的犬瘟熱病毒抗原、其他抗原放置，添加獸醫學上可接受的載體。

本發明還涉及所述試劑盒在製備預防和/或治療犬瘟熱相關疾病的藥物中的應用。

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

本發明實施例中所用到的化學試劑均為分析純，購自國藥集團。

為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。本發明所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1犬瘟熱病毒毒株的分離鑑定及含量測定

1.1犬瘟熱病毒毒株的分離鑑定

犬瘟熱病毒由普萊柯生物工程股份有限公司技術人員從疑似爆發犬瘟熱的患病犬的肺臟病變處分離得到，命名為cdvc/hn/001株。

以cdvh-f:5'ttagggctcaggtagtcca3'、cdvh-r:5'ctaagkccaattgaratgtgt3'為引物，按照easyscriptone-steprt-pcrsupermix(購自北京全式金生物技術有限公司)試劑盒說明書進行一步法rt-pcr技術擴增cdvc/hn/001株的h基因序列，擴增目的片段連接t載體後轉化，挑選陽性克隆質粒予英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，結果如seqidno.1所示，與核酸電泳帶1800bp左右相符；並與genbank中cdvh蛋白基因序列進行megalign處理以分析比對，結果表明：該毒株為亞洲i型病毒，與傳統疫苗株onderstepoort株h蛋白基因序列的同源性為90％。

同時，以cdvf-f:5'-ccggaattcacaggcaagccccatgcac-3'、cdvf-r:5'-ccgctcgagaattaggcgggacttatgga-3'為引物，按照easyscriptone-steprt-pcrsupermix(購自北京全式金生物技術有限公司)試劑盒說明書進行一步法rt-pcr技術擴增cdvc/hn/001株的f基因序列，擴增目的片段連接t載體後轉化，挑選陽性克隆質粒予英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，結果如seqidno.3所示，與核酸電泳帶2000bp左右相符；並與genbank中cdv序列進行megalign處理以分析比對，結果表明：該毒株為亞洲i型病毒，與傳統疫苗株onderstepoort株f蛋白基因序列的同源性為90％。

1.2犬瘟熱病毒毒株含量的測定

將cdvc/hn/001株在單克隆細胞系vero/dogslam細胞系vero/dongslam-1f5株(vero/dogslamcellline,strainvero/dongslam-1f5)(保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno.c201611，保藏地址為中國武漢·武漢大學，保藏日期為2016年03月29日)上擴增，將擴增後的c/hn/001株按照reed-muench方法(參見殷震.動物病毒學.北京:科學出版社,1997)進行病毒含量測定，結果表明：該毒株的含量為104-109tcid50/ml。

實施例2疫苗組合物的製備

2.1cdv滅活全病毒抗原的製備

將cdvc/hn/001株經終濃度為0.025％v/vbpl(β-丙內酯)進行滅活，並按照《中國獸藥典》(中國獸藥委員會，2010年版三部，中國農業出版社，2010)方法對cdvc/hn/001在進行無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗，結果表明：cdvc/hn/001株滅活後，未受到細菌、黴菌的汙染，也未受到支原體和外源病毒的感染，純淨性良好。

2.2cdv亞單位抗原的製備

根據實施例1所測得的cdvc/hn/001株的h蛋白、f蛋白基因序列(依次見seqidno.1、seqidno.3)，以及cdvsy株的m蛋白基因序列(參見ncbi登錄號：kj466106)，分別設計引物序列如下：

cdvh-f:5』-ttagggctcaggtagtcca-3』

cdvh-r:5』-ctaagkccaattgaratgtgt-3』

cdvf-f:5』-ccggaattcacaggcaagccccatgcac-3』

cdvf-r:5』-ccgctcgagaattaggcgggacttatgga-3』

cdvm-f:5』-ccgctcgagaaaactgctttcactatcgc-3』

cdvm-r:5』-ggaagatctcaggagcaacaccgagacaa-3』

按照liufx等(liufx,zhaoy,liledal.buddingofpestedespetitsruminantsvirus-likeparticlesfrominsectcellmembranebasedonintracellularco-expressionofpestedespetitsruminantsvirusm,handnproteinsbyrecombinantbaculoviruses.jvirolmethods.2014,207:78-85)文獻的操作方法依次構建表達犬瘟熱病毒h、f和m蛋白，並純化獲得h、f和m蛋白。最終分別獲得純化後h、f和m重組蛋白，並分別用bca蛋白定量試劑盒(購自碧雲天生物技術研究所)按照說明書測定蛋白含量，結果：h、f和m蛋白含量依次為0.8、0.8、1mg/ml。

2.3疫苗組合物的製備

用生理鹽水溶液將實施例2.1、2.2依次製備的cdvc/hn/001株抗原、亞單位抗原、現有技術中的其他抗原以及petgela佐劑(購自法國seppic公司，終濃度為5％)按照表1所示組分及含量進行配製。其中，滅活的或亞單位的抗原、活的抗原組成疫苗組合物(包括疫苗2、3、4、6)時，將滅活的或亞單位的抗原、petgela佐劑用pbs溶液按表1中所示終濃度進行混合配製得混合液，並對各混合液分別進行性狀檢驗(久置後上層為無色澄明液體，下層為灰白色沉澱，振搖後呈均勻混懸液)、無菌檢驗(按現行《中國獸藥典》進行檢驗，均無菌生長)；並對活抗原進行性狀檢驗(為乳白色海綿狀樹洞團塊，易於瓶壁脫離)、無菌檢驗(按現行《中國獸藥典》進行檢驗，均無菌生長)。免疫使用時，使用含滅活的或亞單位的抗原、佐劑的混合液稀釋活的抗原，使活的抗原的終濃度如表1所示。

表1含犬瘟熱病毒抗原的疫苗組合物所含組分及含量

註：疫苗1、5中的cpv抗原為滅活的jl09-11株(參見孫相鑫，犬細小病毒jl09-11株得分離鑑定及免疫研究.中國人民解放軍軍事醫學科學院博士學位論文.2011)；疫苗2、3、4、6中的cpv抗原為弱毒的nl-35-d株(參見siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)；疫苗3、6中的cavⅱ抗原為的弱毒yca18株(參見夏鹹柱，範泉水，扈榮良等.ⅱ型犬腺病毒自然弱毒yca18株的實驗免疫研究.中國獸藥雜誌,2001,35(2):1-4)。

實施例3疫苗組合物的應用

3.1疫苗組合物的安全性試驗

選取cdv抗原、抗體陰性、cpv抗原陰性及cav抗原陰性的2-3月齡健康齡比格犬30隻，隨機分為6組，5組/只，分別免疫實施例2製備的疫苗1-6，每隻比格犬均注射10個使用劑量的疫苗，觀察14日。結果：免疫接種比格犬精神、飲食均正常；體溫無明顯變化，均在正常38.5℃-39.5℃範圍內；接種部位沒有出現腫脹、壞死，無全身不良反應。

表明：疫苗1-6的安全性試驗均合格。

3.2疫苗組合物之犬瘟熱病毒抗原的動物試驗

選取cdv抗原、抗體陰性的2-3月健康齡比格犬40隻，隨機分為8組，5隻/組，分別免疫疫苗1-6，1頭份/只。第7組為現有技術對照組，免疫購自英特威公司的犬瘟熱、犬細小病毒二聯活疫苗(作為現有疫苗1)，1頭份/只。另設第8組作為空白對照組，不免疫，隔離飼養。分別於免疫前以及免疫後14天、21天採血以檢測犬瘟熱病毒的中和抗體即cdvsn抗體(參見殷震,劉景華.動物病毒學.第2版.北京：科學出版社,1997:204-437)。免疫21天後，對所有犬分別通過滴鼻和腹腔注射途徑攻擊犬瘟熱病毒c/hn/001株病毒液6ml(病毒含量為2×106.0tcid50)，觀察14日，結果見表2。

表2犬瘟熱病毒抗原動物試驗結果

註：#表示現有疫苗對照組中有1隻體溫升高、1隻食慾減退、1隻拉稀便並且死亡，*表示對照組各犬均出現體溫升高、精神萎靡、食慾減退、稀便等犬瘟熱病毒病的典型症狀。

由表2可知：(1)免疫後的抗體效價，疫苗1-3免疫犬後所產生的cdvsn抗體效價相當，高於疫苗4-6免疫後的，也高於現有疫苗免疫後的，表明犬瘟熱病毒滅活抗原所產生的免疫效果優於犬瘟熱病毒亞單位抗原、現有疫苗的；疫苗4-6免疫犬後所產生的cdvsn抗體效價以含犬瘟熱病毒h、f蛋白所製備的亞單位抗原免疫後的最高，其次為含犬瘟熱病毒h、f、m蛋白的抗體效價，再次為含犬瘟熱病毒h蛋白的抗體效價，但仍高於現有疫苗的抗體效價；(2)攻毒保護，疫苗1-6免疫後用cdv流行的強毒株攻毒均未出現犬瘟熱病毒病的症狀，且保護率均為100％；而現有疫苗免疫後用cdv流行的強毒株攻毒後有3隻出現犬瘟熱病毒病的症狀，保護率為80％，低於疫苗1-6的抗體效價。

3.3疫苗組合物之犬細小病毒抗原的動物試驗

選取cpv抗原陰性(hi≤1:4)、2-3月齡健康齡比格犬40隻，隨機分為8組，5隻/組，1-6組分別免疫疫苗1-6疫苗，1頭份/只。第7組免疫購自輝瑞公司的犬細小病毒病活疫苗(衛佳-5，作為現有疫苗2)，1頭份/只。另設第8組作為空白對照，不免疫，隔離飼養。分別於免疫前以及免疫後14天、21天採血，檢測hi抗體效價(hi抗體效價的檢測根據：殷震,劉景華.動物病毒學.第2版.北京：科學出版社,1997:204-437)。免疫後21天，對所有犬分別通過口服途徑攻擊犬細小病毒cpv-825/98株(參見siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)病毒液1ml(病毒含量為103.5tcid50)，觀察14日。結果見表3。

表3疫苗組合物之犬細小病毒抗原的動物試驗結果

註：*表示對照組各犬均出現食慾減退、精神沉鬱、腹瀉、粘便、血便等犬細小病毒病的典型症狀。

由表3可知：(1)免疫後的抗體效價，疫苗1、5免疫犬後所產生的cpvhi抗體效價相當，高於疫苗2、3、4、6免疫後的抗體效價，也高於現有疫苗免疫後的抗體效價，表明犬細小病毒減毒的活的抗原所產生的免疫效果優於犬細小病毒滅活抗原、現有疫苗的抗體效價；疫苗2、3、4、6免疫犬後所產生的cpvhi抗體效價相當，高於現有疫苗的抗體效價，表明犬細小病毒抗原與犬瘟熱病毒抗原混合使用時可協同提高犬細小病毒抗原的免疫效果；(2)攻毒保護，疫苗1-6免疫後用cpv流行的強毒株攻毒均未出現犬細小病毒病的症狀，且保護率均為100％，與現有疫苗免疫後的攻毒效果相當。

3.4疫苗組合物之犬腺病毒抗原的動物試驗

選取cav抗原陰性、抗體≤1:2、2-3月齡的健康齡比格犬20隻，

隨機分為4組，5隻/組，1-2組分別免疫疫苗3和疫苗6，1頭份/只。第3組作為現有技術對照組，免疫購自美國輝瑞公司的衛佳-5(作為現有疫苗3)。另設第4組作為空白對照組，不免疫，隔離飼養。分別於免疫前和免疫後14天、21天採血，檢測cav中和抗體(即cavsn抗體檢測根據：殷震,劉景華.動物病毒學第2版.北京：科學出版社,1997:204-437)。二免後28天，對所有犬分別鼻腔途徑攻擊犬腺病毒cav-ⅰ型a8301株(參見夏鹹柱，範泉水，扈榮良等.ⅱ型犬腺病毒自然弱毒yca18株的實驗免疫研究.中國獸藥雜誌,2001,35(2):1-4)病毒液1ml(病毒含量為105.5tcid50)，觀察14日，結果見表4。

表4疫苗組合物之犬腺病毒抗原的動物試驗結果

註：*對照犬均出現體溫升高、食慾減少、渴飲增加、沉鬱、血便、「蘭眼」、咳嗽等犬腺病毒感染的典型症狀。

由表4可知：(1)免疫後的抗體效價，疫苗3、6免疫犬後所產生的cavsn抗體效價相當，略高於現有疫苗的抗體效價，表明犬腺病毒ⅱ型抗原與犬瘟熱病毒抗原混合使用時可協同提高犬腺病毒ⅱ型抗原的免疫效果；(2)攻毒保護，疫苗3、6免疫後用犬腺病毒流行的強毒株攻毒均未出現犬腺病毒病的症狀，且保護率均為100％，與現有疫苗免疫後的攻毒效果相當。

綜上所述：本發明製備的含犬瘟熱病毒抗原的疫苗組合物免疫後不僅沒有雙相熱、發燒、呼吸困難、可見皮膚發紅、眼有大量分泌物、鼻流膿性分泌物、後肢不能站立的臨床症狀，而且免疫效果優於現有商品化疫苗，特別地，對疫苗組合物中所含其他抗原的免疫效果還具有協同增效作用。

以上全面描述了本發明的優選實施例，但是可對它們進行各種替代和修改。因此，不應參照以上描述來決定本發明的範圍，而是應參照所附權利要求書及其全部等同物來決定本發明的範圍。任何特徵，(不論是否為優選)均可與任何其他特徵(不論是否為優選)相結合。本發明的權利要求書不應被理解為具有方法和功能的限制，除非在某一權利要求中通過術語「…的方法」明確地列舉出此類限制。