純化因子VIII和VonWillebrand因子的方法

2023-04-28 18:00:31 4

專利名稱：：純化因子VIII和VonWillebrand因子的方法
技術領域：
：本發明領域涉及在藥物中用作活性劑的因子VIII以及VonWillebrand因子的純化。現有技術因子VIII(下面也稱作"FVIII")是以低濃度存在於人血漿中的血漿蛋白質。然而，其代表了凝結級聯中的關鍵點。事實上，這一蛋白質起因子IX(或"FIX")的輔因子的作用以便活化因子X(或"FX")。一旦被活化，因子X將凝血酶原轉變成凝血酶，後者再將纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，從而導致止血纖維蛋白凝塊的形成。罹患A型血友病的人具有FVIII缺陷，這自發地或在源於事故或外科手術的創傷後造成嚴重的失血。通常通過注射純化的血漿源FVIII來治療那些個體。由於此注射通常為多次且重複，所以可獲得高純度FVIII濃縮物是至關重要的。事實上，如果FVIII濃縮物未充分純化，它們可能含有大量的纖維蛋白原和免疫球蛋白，這可能誘導不期望的免疫應答。因此，提供血漿源蛋白質用於治療目的需要血漿源FVIII純化方法以獲得高純度產物。最通常從冷沉澱的人血漿級分來製備因子VIII濃縮物。通常在工業中心獲得的用於治療人血漿的因子VIII濃縮物的純度通常約1IU/mg並且通常不超過10至20IU/mg的最大範圍。最常見的純化方法都意味著沉澱步驟，該步驟針對於除去(通常不夠充分)蛋白源汙染物如纖維蛋白原、纖連蛋白以及免疫球蛋白。這些方法可使用或組合低溫沉澱(10°C)，或者添加蛋白沉澱劑，像親水聚合物如PEG(Newman等人，Br.J.Haemato121:1-20，1971;Hao等人，MethodsofPlasmaProteinFractionation,AcademicPress1980，pp.57-74)，聚乙烯妣咯烷酮(Casillas和Simonetti，Br.J.Haemato,50:665-672，1982)、葡聚糖、聚糖體、珀可、羥乙基澱粉以及氧化鋁也被建議用作沉澱劑。Thorell和BlombSck推薦的甘氨酸以及氯化鈉的使用(Thorell和Blomb3ck,ThrombRes.1984Aug15;35(4):431-50)也適用於沉澱劑。類似地，一些作者(Ng等人，ThrombosisRes.，42:825-834,1986)成功地將三種沉澱劑PEG、甘氨酸和氯化鈉組合以獲得具有比活性在10至16IU/mg範圍的因子VIII濃縮物。也通過在生產過程中包括與多孔矽珠的接觸步驟來生產因子VIII濃縮物，該接觸步驟旨在截留低分子量蛋白源汙染物(Margolis等人，VoxSang.46:341-348，1984)。產物的比活性仍舊保持相對較差lUI/mg。出現了製備非常高純度因子VIII濃縮物的方法。事實上，提出了通過免疫親禾口色i普f去來獲f尋農縮淨勿(Zimmerman禾口Fulcher，ThrombosisRes.，Suppl.VII，p.58，1987;Berntorp禾口Nilsson，ThrombosisRes.，S聊l.VII，p.60，1987;Levine等人，ThombosisRes，Su卯l.VI1，1987)。此種方法在於利用固定到色譜底物的抗因子VIII:C或抗VonWillebrand因子抗體的方法來純化因子VIII。此種方法是有效的但是卻需要烈性(drastic)溶液的使用以將因子VIII從其抗體或從VonWillebrand因子解吸附。因此需要針對於除去不想要的化學劑的其他超濾步驟，但是這可能影響因子VIII的生物活性。生產期間，因子VIII的比活性可達到4000至10000IU/mg，但是其不穩定性需要在凍幹步驟前加入穩定劑例如白蛋白，這將因子VIII的比活性降至3-5IU/mg。然而，免疫親和純化的主要缺點在於動物源殘留抗體的存在並因此可能在患者中造成針對那些非人蛋白質的免疫反應的發生。因此，通過可用於大規模工業環境的方法，所有這些方法都不允許提供完全沒有非人蛋白質如動物源抗體的極高純度的因子VIII濃縮物。EP0343275描述了從冷沉澱物製備因子VIII的方法，其特徵在於，在病毒滅活處理之前，冷沉澱物懸浮於pH值在6.5至7.5範圍的含有1至3U/ml肝素的水中，與氫氧化鋁懸液反應並在IO至18t:的溫度下冷卻以及將pH值調整至6至7的範圍，離心或過濾，然後再經過後處理，尤其是通過使用親水型離子交換樹脂如Fractogel-DEAE(現在稱作DEAE-TOYOPEARL⑧，由TosohBioscience公司出售)的色譜法進一步進行純化。這一文本因而描述了通過將非常特殊的預備步驟(尤其是特徵為完全沒有任何乙醇處理)與在親水型樹脂如FractogelDEAE上的離子交換色譜聯合使用，而只純化因子VIII。EP0359593描述了陰離子交換色譜純化方法，其使得在經深思熟慮而不需要任何後處理的條件下，在單個色譜柱上分離預期的蛋白質。此種方法使得能夠從人或動物血漿分離因子VIII、纖維蛋白原、纖連蛋白和VonWillebrand因子蛋白質。此種方法可總結如下將溶解於水的冷沉澱物級分通過使用基質為大交聯乙烯聚合物凝膠類型的陰離子交換樹脂的色譜法進行單次分離，該樹脂由於其孔隙率特性而能夠留住因子VIII-VonWillebrand因子複合物，然後通過連續增加洗脫緩衝液的離子強度而選擇性地收集多種蛋白質。此種方法通過使用接枝到Fraetoge1⑧tsk-deae650樹脂上的deae部分(現稱作DEAE-TOYOPEARL⑧，由TosohBioscience公司出售)而得到很好的結果。然而，此種方法雖然能獲得純化的FVIII，但不能獲得足夠純的VonWillebrand因子。另一方面，VonWillebrand因子(下文也稱作"FvW")通過發揮下述兩種不同功能而在止血起至關重要的作用，即作為粘著蛋白，它允許血小板分散，粘附並聚集到血管內皮下膜上，並因此參與損傷血管的快速癒合，以及另一方面，其保證因子VIII穩定並運輸到血液循環中，而它並非與因子VIII共價相連。FvW先天缺乏或這一因子的結構缺陷確實引起vonWillebrand疾病，該疾病表現為皮膚和黏膜出血。當需要進行手術時，這一疾病的臨床表現非常異類並且問題頗多。急需對vonWillebrand疾病的治療以矯正原發止血(出血時間)和凝結缺陷。通常將使用富含FvW的人血漿衍生物(例如該血漿的冷沉澱物級分或含有足量與之相伴的FvW的因子VIII濃縮物)的替代療法對該疾病進行治療。但是FvW是難於純化的蛋白質。事實上，VonWillebrand因子是已知的在血漿中循環的最大蛋白質。其由一組二硫鍵連接的多聚體構成，該多聚體的基礎元件具有分子量約260千道爾頓(kDa)。血漿中，FvW的最小形式是440至500kDa的二聚體，而最大形式是分子量可以達到兩千萬道爾頓的所述二聚體的多聚體。多聚體中亞基的排列可以是對於在其中形成它的細胞特異的FvW在巨核細胞和內皮細胞中合成且聚合。因此，由於其複雜性以及由於其與FVIII的結合，VonWillebrand因子分子的製備非常複雜。製備FvW濃縮物的多種方法通常組合這樣的步驟，其在於沉澱血漿級分和/或色譜，該沉澱步驟移除不想要的蛋白質的主要部分(纖維蛋白原，纖連蛋白等)，而該色譜步驟(離子交換色譜、親和色譜、免疫親和色譜、空間排阻色譜等)針對於提供高比活性的高純度濃縮物，同時保留多聚體形式的完整性，特別是高分子量的那些，其生物作用在治療過程中是決定性的。歐洲專利EP0503991公開了以工業規模製備FvW濃縮物的方法，包括血漿冷沉澱物級分的預純化步驟和三步連續的色譜步驟，第三步色譜是在瓊脂糖固定的明膠柱上進行的親和色譜。因此獲得的FvW濃縮物具有以每mg蛋白質的瑞斯託菌素輔因子的活性單元來表示的比活性高於100VWF:RCo/mg，以及與初始血漿中相類似的高分子量多聚體水平。歐洲專利申請EP0934748描述了FvW製備方法，包括陰離子交換和陽離子交換色譜法的組合。得到的FvW級分具有以每mg蛋白質的FvW抗原單元來表示的比活性高於100IUFvW:Ag/mg，但仍舊含有顯著量的因子Vin。美國專利US6，579，723描述了通過免疫親和色譜製備高純度的FvW的方法，其中免疫吸附劑是抗FvW抗體。也可提供通過在肝素上的親和色譜來純化的額外步驟。然而，此種免疫親和純化的缺點是可能存在可誘導免疫反應的殘留抗體。歐洲專利EP0383234教導了通過陰離子交換色譜的方法來製備FvW濃縮物，其使用含有碳水化合物的酸性溶液(PH範圍5.5至6.5)來進行以在陰離子交換器上固定因子VIII。通過衝洗底物而回收FvW，以及未滯留的纖連蛋白和纖維蛋白原，確實需要額外的沉澱步驟以分離純化的FvW濃縮物。EP1632501描述了從含有VonWillebrand因子的生物級分製備高純度VonWillebrand濃縮物的方法，包括使用弱鹼型乙烯基聚合物底物通過陰離子交換色譜的分離。有益地，此種方法可以非常容易地進行並且能夠獲得含有非常少的因子VIII的高特異性VonWillebrand因子。FVIII和FvW是非常有用的血漿源蛋白質，並且其在一些人中的缺乏導致嚴重的止血病。因此最重要的是研發製備這些蛋白質的方法，該方法能夠生產具有適於患者重複使用的純度的產品。先前技術中描述的方法能夠獲得純的因子VIII，但是純度差的VonWillebrand因子，或者是獲得純的FVIII和FvW，但是卻要實施複雜且繁重的方法。發明才既述本發明涉及純化含有FVIII和FvW的混合物的溶液，或者含有FvW的溶液，或者源於動物、尤其是非人動物的分泌物的溶液，或者含有FVIII的植物提取物的方法，其特徵在於，包括在可以吸附選自FVIII和FvW的蛋白質中至少一種的離子交換色譜過濾型膜上的色譜步驟。發明詳明因此，本發明的一個目的在於提供一種從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源於非人動物的分泌物的溶液，和(iv)源於含有FVIII的植物提取物的溶液來純化FVIII或FvW的方法，所述方法的特徵在於，包括在離子交換色5譜過濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。如在此使用，"純化方法"旨在意指將FVIII從介質中存在的其他分子分離的方法，或者將FvW從介質中存在的其他分子分離的方法，或者將FVIII從FvW分離的方法，或者將FVIII/FvW複合物從介質中存在的其他分子分離的方法。那些分子可以是不同於FVIII和FvW的蛋白質、病毒、細菌、孢子、培養基、胎牛血清，這一列表並非局限性的。如在此使用，"FVIII"旨在意指任何形式的FVIII，尤其是能作用為FIX活化中的輔因子且能夠與FvW形成複合物，特別是成熟FVIII，成熟FVIII生物活性衍生物如含有前肽(pro-FVIII)的pro-FVIII，包含非成熟FVIII的蛋白構建體，FVIII前體(pre-pro-FVIII)，切去信號肽和前肽後獲得的成熟FVIII。本發明包括的其他FVIII生物活性衍生物是處於翻譯後修飾或者轉變成生物活性形式的前藥，該生物活性形式例如截短形式、缺失形式如EP218712所述缺失定位於Arg-759和Ser_1709之間區域的一個或多個胺基酸的FVIII、嵌合形式以及包括不同於血漿天然成熟形式的翻譯後修飾的形式。例如，這些多種FVIII形式可例如通過修飾成熟FVIII或者任何天然存在於血液中的其他形式而產生。編碼此FVIII的核苷酸序列可源於多種來源，優選來自哺乳動物，包括人、豬、羊、牛、馬科和羊亞科來源，這一列表並非局限性的。如在此使用，"FvW"旨在意指任何FvW形式，尤其是成熟FvW，成熟FvW生物活性衍生物，例如含有前肽的pro-FvW，包含非成熟FvW的蛋白構建體，包括FvW前體(pre-pro-FvW))，FvW前肽(pro-FvW)，切去信號肽和前肽後獲得的成熟FvW。本發明包括的其他FvW生物活性衍生物是經歷翻譯後修飾或者轉變成生物活性形式的前藥，該生物活性形式例如截短形式、缺失形式如抗蛋白水解的A2結構域缺失的FvW(Lankhof等人，Thromb.Haemost.77:1008-1013，1997)、Val449和Asn730之間包括糖蛋白lb結合結構域和用於膠原以及肝素的結合位點(Pietu等人，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.164:1339-1347，1989)的FvW片段，嵌合形式以及包括不同於血漿天然成熟形式的翻譯後修飾的形式。例如，這些多種FvW形式可通過修飾成熟FvW或者任何天然存在於血液中的其他形式而製備。編碼此FvW的核苷酸序列可源於多種來源，優選來自哺乳動物，包括人、豬、羊、牛、馬科和羊亞科來源，這一列表並非局限性的。如在此使用，"含有FVIII和FvW的混合物的溶液"旨在意指處於複合狀態或分離狀態的任何含有FVIII和FvW的溶液。這些溶液可以是血漿或重組或轉基因來源的。當該溶液是重組來源時，其源自單細胞體系，其中FVI11和FvW蛋白表達被誘導。可以提及任何轉染有包括編碼這些蛋白中各自的基因的載體的動物或人細胞系，優選編碼人蛋白質的基因，其中所述細胞系可尤其選自CH0-K、CHO-LeClO、CH0Lec-l、CH0Pro_5、CH0dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt_4、C0S_7、293_HEK、YB2/0(ATCCCRL-1662)、BHK、K61-I6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653、SK-H印、H印G2、PERC6(Crucell)細胞系，以及植物細胞、細菌體系，例如E.Coli、真菌體系、使用病毒的體系，尤其是杆狀病毒，這一列表並非局限性的。此種細胞體系通過本領域技術人員公知的方法表達FvW和FVIII蛋白。可提及US5，198，349作為實例，其內容在此通過引用併入本文。所述文獻描述了FVIII和FvW共表達，尤其是在CH0細胞中，該CH0細胞一方面共轉染有插入了FVIII編碼序列的表達載體，而另一方面共轉染有插入FvW編碼序列的表達載體。6當該溶液是轉基因來源時，其源自多細胞體系，尤其來自通過轉基因獲得的動物或植物，也就是說其中一種或多種細胞接收了重組DNA分子。其適合的實例包括狗、貓、小鼠、大鼠、倉鼠、牛、山羊、綿羊、兔和豬、馬、昆蟲、植物如菸草、大豆，這一列表並非局限性的。當通過動物生產FVIII和FvW時，這一生產可在由動物分泌的多種介質中發生，該介質例如尿、血液、唾液或乳汁，這一列表並非局限性的。此種生產方法可通過本領域技術人員公知的方法進行。可提及EP0741515和EP807170作為實例，這一列表並非局限性的。後者描述了以穩定方式在其基因組中整合編碼FVIII和FvW的DNA分子的轉基因動物的生產，以便表達它們並在乳汁中分泌它們。當通過植物生產FVIII和FvW時，這一生產可通過本領域技術人員公知的方法進行，如在US6，331，416和US5，994，628中所述，這一列表並非局限性的。當該溶液是血漿來源時，其可以是動物或人源血漿，或冷沉澱物，或者通過標準分級方法獲得的級分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459,1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級分可任選地經過預純化處理，例如在氫氧化鋁上的吸附。FVIII和FvW混合物意指這些蛋白質可以近乎相似的量存在，或者一種蛋白質相對於另一種是主導存在的，或者非常主導存在的。如在此使用，"含有FvW的溶液"旨在意指任何含有FvW的溶液，並且基本上缺乏，也就是具有很少或者甚至極少的FVIII。這一溶液可以是重組、轉基因或血漿來源。當溶液是重組來源時，其源自單細胞體系，其中FvW蛋白表達被誘導。其適合的實例包括所有轉染有包括編碼這一蛋白的基因的載體的動物或人細胞系，優選編碼人蛋白質的基因，其中所述細胞系可尤其選自CH0-K、CH0-LeC10、CH0Lec-1、CH0Pro-5、CH0dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293-HEK、YB2/0、朋K、K61_I6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653、SK-H印、H印G2細胞系，以及植物細胞、細菌體系，例如E.Coli、真菌體系、使用病毒的體系，尤其是杆狀病毒，這一列表並非局限性的。此種細胞體系表達FvW蛋白，並且可通過本領域技術人員公知的方法獲得。可提及US5，198，349和W089/06096作為適合的實例，這一列表並非局限性的。US5，198,349描述了通過將編碼人FvW的cDNA插入表達載體而在COS細胞中表達人FvW。當該溶液是轉基因來源時，其源自多細胞體系，尤其來自通過轉基因獲得的動物或植物，也就是說其中一種或多種細胞接收了編碼FvW的重組DNA分子。其適合的實例包括狗、貓、小鼠、大鼠、牛、山羊、綿羊、兔和豬、馬、昆蟲、植物如菸草、大豆，這一列表並非局限性的。當通過轉基因動物生產FvW時，這一生產可由由動物分泌的多種介質實現，該介質例如尿、血液、唾液或乳汁，這一列表並非局限性的。此種生產方法可通過本領域技術人員公知的方法進行。W02001/022810和W01999/058699是其適合的實例，這一列表並非局限性的。這一方面，W02001/022810描述了在其乳汁中生產人FvW的雌性轉基因小鼠的生產。當通過植物生產FvW時，這一生產可由本領域技術人員公知的方法實現，如在US6，331，416和US5，994，628中所述，這一列表並非局限性的。當該溶液是血漿來源時，其可以是動物或人源血漿級分，或冷沉澱物，或者通過標CN準分級方法獲得的級分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459，1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級分可任選地經過預純化處理，例如在氫氧化鋁上的吸附。如在此使用，"源自非人動物分泌物的含有FVIII的溶液"旨在意指任何源自任何分泌物，例如來自血槳、唾液、尿或乳汁，由經遺傳改造以在前述分泌物之一中表達FVI11分子的轉基因動物所生產的溶液。這種情況下，轉基因動物不表達FvW。如在此使用，"源自含FVIII血漿的溶液"旨在也包括任何源自天然含有人或動物FVIII的血漿、基本上沒有FvW的溶液。其可源自動物或人血漿級分，或冷沉澱物，或者通過標準分級方法獲得的級分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459，1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級分可任選地經過預純化處理例如在氫氧化鋁上的吸附。可通過本領域技術人員公知的方法進行從轉基因動物生產方分泌物的方法。其適合的實例包括US5，880，327和US2007/0011752，這一列表並非局限性的。這一方面，US5，880，327描述了在轉基因小鼠的乳汁中生產人FVIII。US2007/0011752描述了從多種動物的唾液生產人蛋白質例如FVIII。如在此使用，"源自含FVI11植物提取物的溶液"旨在意指任何來自含FVIII蛋白質(尤其是人源)的植物的級分，其在經遺傳改造以表達FVIII分子的植物或轉基因植物的細胞中獲得。此提取物可通過將含編碼FVIII的基因的核苷酸載體導入植物細胞而生產。此方法是本領域技術人員公知的，並且可通過屬於本領域的諸多文獻所描述，例如US2005/0060775。如在此使用，"離子交換色譜過濾型膜"旨在意指任何通過離子交換而使FVIII和/或FvW通過該膜時，具有吸附FVIII和/或FvW能力的物理半滲透屏障。此外，這一膜可以在膜與FVIII和/或FvW之間的離子交換相互作用不再足以將它們保留在膜上時，允許FVIII和FvW流過。因此，為了實施根據本發明的純化FVIII或FvW的方法，使用由大孔底物製成的離子交換過濾型膜，所述底物包括固定到其上的負電或正電包被，所述包被提供為過濾型膜離子交換特性。通常，負電或正電包被通過化學接枝固定到大孔底物上。該大孔底物的孔隙率，也就是其平均孔徑是使得過濾型膜允許FVIII和FvW流過。使用此種膜的首要益處在於使用可棄式交換過濾型膜的可能性，其提高了該方法的衛生安全級別。使用此種膜的第二個益處在於在待純化溶液的極高流速下，進行根據本發明純化方法，並且更準確地，離子交換色譜步驟的可能性。任何類型的物理屏障底物可適合於適於根據本發明的實施的過濾型膜，例如多聚體膜、芯(wick)、空心纖維、穩定的纖維素、聚醚碸、或任何可以允許FVIII和FvW流過的三維結構。過濾型膜與FVIII和FvW蛋白之間的離子交換相互作用源於固定到大孔底物上的正電或負電包被，所述包被包括可以被替代的鹼性或酸性官能部分。離子交換包被可為單官能類型，也就是包括只有一種官能部分，或者如果存在多種類型的官能部分，則是多官能類型，。因此，由於FVIII和FvW蛋白質和膜之間的相互作用，過濾型膜使得能夠同時捕獲或吸附FVIII和FvW蛋白。在將含有FVIII和FvW的溶液施用至膜上時，由於離子交換相8互作用，FvW和FVI11被膜保留。當待純化的產物不存在於冷沉澱物時，優選進行溶液預純化步驟以在進行根據本發明的純化方法前純化，從而獲得足以不含汙染物的溶液。這一預純化步驟可以是有益的，尤其是用含有大量蛋白質的介質的複雜的溶液，例如源自乳汁或血漿。此預純化步驟可尤其包括澄清步驟，例如如WO2004/076695所述，或者提取步驟，例如如FR0604864或FR0611536所述，這一列表並非局限性的。這一方面，FR0604864描述了至少一種存在於乳汁中的蛋白質的提取方法，所述蛋白質對所述乳汁的f丐離子具有親和性(無論複合與否)，包括由下面的步驟(i)通過沉澱鈣化合物釋放蛋白質，該化合物通過將乳汁與可溶性鹽如磷酸鈉接觸而獲得，依在此介質中形成所述不溶性鈣化合物的能力選擇該可溶性鹽的陰離子，以便獲得富含蛋白質的液相，(ii)從鈣化合物沉澱分離富含蛋白質的液相，進一步分離所述液相以形成脂相和水性、含有蛋白質的非脂相，禾口(iii)回收該水性，含有蛋白質的非脂相。此外，FR0611536描述了提取存在於乳汁中的蛋白質的方法，包括至少一種疏水袋和在乳汁的中性pH下的負電荷，包括下述步驟a)撇取所述乳汁並脫脂化，b)在使得所述蛋白質保留於接枝有具疏水和離子特性的配體的色譜底物上的pH條件下，將含有所述蛋白質的脫脂化且經過撇取的級分施用到所述底物上，例如4-巰基-乙基-吡啶，c)洗脫該蛋白質，d)通過從所述洗脫級分中除去乳蛋白質而純化該經洗脫的級分，禾口e)回收所述蛋白質。在通過細胞體系生產溶液的情況下，預純化步驟可這樣緊跟在細胞培養步驟本身後。可控制細胞培養基的組成以使由細胞生產的蛋白質分泌到細胞外介質中。此外，可進行細胞選擇以便生成的蛋白質分泌到介質中。此後，可能需要深層過濾步驟或切向微過濾以獲得適於實施根據本發明純化方法的步驟的預純化。本發明的一些具體實施方式中，過濾型膜是陽離子交換選擇性膜。該膜攜帶的官能團的正平衡離子(positivecounter-ion)由與FvW和FVIII具有相同正負號的電荷所代替。可用於陽離子交換包被的官能團包括羧甲基(CM)、磷醯基和磺丙基(SP)、硫酸根(S)，這一列表並非局限性的。在這些使用陽離子交換過濾型膜的實施方式中，可使用的緩衝液包括三-羥甲基-氨基甲烷、碳酸鹽、乙二胺、咪唑或三乙醇胺，這一列表並非局限性的。這些實施方式中，將根據本領域技術人員公知的常規方法，根據蛋白質的等電點來選擇緩衝PH值，以便蛋白質在該pH值具有整體正電荷水平。根據本發明的其他實施方式中，應用的過濾型膜是陰離子交換選擇性膜。由膜攜帶的官能團的負平衡離子由與FvW和FVIII具有相同正負號的電荷所代替。可用於陰離子交換包被的官能部分包括二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基(2_羥丙基)氨基乙基或季銨(QAE，Q)、二甲基氨基乙基(DMAE)和三甲基氨基乙基(TMAE)，這一列表並非局限性的。這些實施方式中，可使用的緩衝液是醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸、巴比妥酸鹽，這一列表並非局限性的。這些實施方式中，將根據本領域技術人員公知的常規方法，根據蛋白質的等電點來選擇緩衝PH值，以便蛋白質在該pH值具有整體負電荷水平。優選地，過濾型膜包括由強陰離子交換器組成的離子交換包被。如在此使用，"強陰離子交換器"旨在意指任何能夠吸附離子化差的蛋白質的陰離子交換膜。此種過濾型膜是市售可得的。適合的實例包括攜帶QAE或Q部分的膜，尤其是MustangQ⑧;膜(Pall)或SartobindQ膜(Sartorius)，這一列表並非局限性的。MustangQ膜(Pall)是尤其引起關注的，因為它擁有高吸附能力和高色譜容量流量，並且因為它可以用於單循環(可棄式的)或多次循環。此外，所述膜使得不需要進行底物衝洗的證實步驟，例如再生和衛生處理(病毒和朊病毒安全方法等)。使用此過濾型膜也使得不需要進行對於標準底物而常規進行的老化研究。因此，相比於現有技術的方法，使用此膜能夠降低生產時間。優選地，與溶液接觸以純化的過濾型膜的表面包括陰離子交換包被，該包被包括通過化學接枝固定到大孔底物上的季銨基團。進一步的具體實施方式中，過濾型膜是大孔膜。如在此使用，術語"大？L"旨在意指由孔徑在0.3m至1.0m範圍的膜構成的體系。更優選地，孔徑在O.5iim至0.9iim的範圍。最優選地，孔徑為0.8ym。根據本發明具體優選的實施方式中，膜底物為聚醚碸底物。作為實例，此聚醚碸膜可為MlIStangQ⑧膜，由Pall出售。這一膜具有0.8iim直徑的孔並且其接枝有季銨基團。根據本發明的具體實施方式中，待純化的溶液含有FVIII或FvW，並且是血漿源的。根據本發明的優選實施方式中，待純化的溶液含有FVIII和FvW的混合物，並且更優選地源於血槳。因此，根據本發明的這些實施方式中，溶液源於天然的人或動物血漿，也就是源於分別天然含有人或動物FVIII和FvW的人或動物血漿。可從豬、兔、山羊收集此動物血漿，這一列表並非局限性的。出人意料地，申請人觀察到過濾型膜，並且尤其是MustangQ敷膜具有比樹脂或凝膠更高的FVIII和/或FvW吸附能力。如在此使用，"吸附能力"旨在意指固定到凝膠上的目標蛋白質的量，並且其通常由凝膠或樹脂製造商以固定到凝膠或陰離子樹脂上的BSA量(牛血清白蛋白)來表示。例如，對於常規用於純化FVIII和/或FvW的DEAE-TOYOPEARUD'凝膠，其在25至35mg/ml的範圍，而對於MustangQ膜，其高於或等於30mg/ml。過濾型膜的較高吸附能力意味著相比於凝膠或樹脂，使用較小量的凝膠等效物吸附等量FVIII和/或FvW的可能。作為說明，能夠在DEAE上吸附50至80IUFvW和FVI11/ml凝膠，在MustangQ⑧,膜上吸附200至250IUVWF和FVIII/ml凝膠等效物。相比於凝膠或樹脂，過濾型膜的最高吸附能力可源於FVIII和/或FvW對離子化位點的提高的可接近性，尤其是在它們形成FVIII/FvW複合物時。事實上，這些蛋白質具有大的尺寸，尤其是在它們形成FVIII/FvW複合物時，並且可以假定相比於接枝到凝膠或樹脂上，當它們接枝到大孔過濾型膜上時，由於孔徑，離子化位點更易於接近它們，而凝膠或樹脂的情況中，離子化位點嵌入通道中，使得不容易被大蛋白質接近。有利地，根據本發明的這一優選實施方式中，該方法包括下述步驟a)提供來自血漿的冷沉澱物，b)在所述離子交換色譜膜上，並且更尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲，也就是吸附因子VIII和VonWillebrand因子，和c)通過連續增加洗脫緩衝液的離子強度值來選擇性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。有利地，在提供來自血槳的冷沉澱物的步驟後，可以進行通過在氧化鋁凝膠上吸附因子VIII和VonWillebrand因子的預純化步驟然後冷沉澱。上述方法步驟c)中，本領域技術人員根據他對於FvW和FVIII蛋白質中每種的理化特性以及對於過濾型膜的離子交換特性的普通知識，可容易地調整洗脫緩衝液的離子強度值，該過濾型膜通常是市售可得的過濾型膜，其使用推薦由製造商提供。本領域技術人員基於他的普通知識尤其知曉從陰離子交換色譜底物用具有離子強度值高於從相同底物洗脫FvW所需的離子強度值的緩衝液來洗脫FVIII所。因此，上述方法步驟c)中，本領域技術人員使用這樣的緩衝液，其離子強度值適於洗脫(從底物解吸附)(i)FvW，(ii)FvW和FVIII或(iii)順序地首先FvW，然後FVIII。根據對由順序地首先洗脫FvW，然後FVIII所組成的備選的(iii)的第一實施方式，本領域技術人員可順序地使用兩種洗脫緩衝液，每種洗脫緩衝液具有分別針對於解吸附FvW或FVIII而調整的離子強度值。根據備選的(iii)的第二實施方式，本領域技術人員用能夠產生漸增的離子強度梯度的緩衝液進行洗脫，利用該離子強度梯度，FvW，然後FVIII順序地解吸附。因此，如在此使用，對於上述方法步驟c)，"順序增加洗脫緩衝液的離子強度值"包括線性增加洗脫緩衝液的離子強度值，這可通過添加鹽，例如氯化鈉、氯化鈣而得到，這一列表非局限性的。可以通過增加緩衝液的離子強度值而首先獲得FvW洗脫物然後FVIII洗脫物。因此能夠回收FvW並在獲得FvW後停止洗脫，或者通過繼續洗脫獲得FVIII。如在此使用，"冷沉澱物"旨在意指通過低溫沉澱方法從人或動物血漿獲得的沉澱物。可使用本領域技術人員公知的方法獲得該冷沉澱物。作為實例，使冷凍血漿處於約-5t:至-i5t:的溫度，然後在攪拌下緩慢加熱至不超過rc或任選4t:的溫度。在這些條件下，冷凍血漿融化以得到液相和固相。然後通過離心回收固相(即冷沉澱物)。冷沉澱物基本上由纖維蛋白原、纖連蛋白、因子VIII和VonWillebrand因子(vWF)構成。冷沉澱物中，FVIII通常與穩定FVIII的FvW相伴。如在此使用，"選擇性回收"旨在意指根據洗脫方法，根據期望的蛋白質，回收FVIII或者FvW或者FVIII和FvW的混合物的能力。可以根據本領域技術人員公知的方法，通過改變pH值，或通過提高洗脫緩衝液的離子強度值來獲得FvW或者FVIII或者FVIII和FvW的混合物(參見例如實施例1)。其他實施方式中，待純化的溶液含有重組或轉基因來源的FVIII和FvW的混合物。這一實施方式包括下述步驟a)提供包括FVIII和FvW的細胞培養物上清或預純化的溶液，b)在所述離子交換色譜膜，並且尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲因子VIII和VonWillebrand因子，和c)通過連續增加洗脫緩衝液的離子強度值來選擇性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。根據本發明的進一步的實施方式中，待純化的溶液含有FVIII或FvW。這一實施方式包括下述步驟a)提供含有FVIII或FvW的細胞培養物上清或純化的溶液，b)在所述離子交換色譜膜，並且尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲因子VIII或VonWillebrand因子，和c)回收VonWillebrand因子或因子VIII。有利地，利用血漿級分，本發明的方法使得降低了維生素K依賴性因子纖維蛋白原和纖連蛋白的量。有利地，尤其在待純化的溶液含有FVIII和FvW混合物時，選擇性回收FvW和FVIII通過下述步驟實現cl)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫FvW。例如可通過添加0.25M氯化鈉至重量摩爾滲透壓濃度在約600至660m0sm/Kg範圍來增加離子強度值。C2)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值甚至高於用來回收VonWillebrand因子的值來洗脫FVIII。例如可通過添加0.7M氯化鈉，或0.35M氯化鈣至重量摩爾滲透壓濃度在約1400至170m0sm/Kg範圍來增加離子強度值。步驟cl)是選擇性回收FvW的步驟，此步驟期間使用離子強度適於從離子交換過濾型膜解吸附FvW的緩衝液。步驟c2)是選擇性回收FVIII的步驟，此步驟期間使用離子強度適於從離子交換過濾型膜解吸附FVIII的緩衝液。步驟c2)中，使用離子強度值高於步驟cl)所用緩衝液的離子強度值的緩衝液。在離子交換色譜過濾性膜上同時捕獲FVIII和FvW後進行這些步驟。在步驟cl)中洗脫的FvW含有極少FVIII。回收它並獲得了純化的FvW溶液。此外，在步驟c2)中獲得的FVIII含有比初始溶液更少的FvW。回收它並獲得了FVIII純化溶液。任選地，能夠實施額外步驟以解離高分子量FVIII-FvW複合物，例如如EP1037923所述。任選地，然後能在孔隙率小於或等於20nm，尤其是等於15mn的親水過濾膜上實施用於FVIII純化溶液的額外過濾步驟，如在WO2005/040214所述。進一步具體實施方式中，本發明的方法通過在所述離子交換色譜過濾型膜上的FVIII和FvW同時吸附步驟後進行下述步驟而能夠獲得純化的FvW溶液d)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫FvW，e)在離子交換色譜膜，更優選在與第一膜相同類型的膜上捕獲VonWillebrand因子，和f)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫VonWillebrand因子。這一實施方式中，任選地，能夠在通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值的FvW洗脫步驟d)後，通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值甚至高於用來回收VonWillebrand因子的值來洗脫FVIII。因此，在簡化的方法中，獲得純化的含FvW溶液和純化的含FVIII溶液。本發明方法因此有益地能夠獲得從含FVIII和FvW的溶液順序或同時純化FVIII和FvW。如果溶液是血漿源的，根據本發明的方法是尤其有益的，因為它能夠儘可能有利地使用人或動物血漿。有益地，這一具體實施方式還包括下述步驟g)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對步驟c)洗脫的富含VonWillebrand因子的級分進行色譜，禾口h)回收沒有滯留的且缺乏纖連蛋白的Willebrand因子級分。例如，可根據本領域技術人員公知的方法，通過免疫比濁法，進行纖連蛋白檢測。因此，根據本發明方法的實施方式能夠通過在離子交換色譜過濾型膜上的FVIII和FvW同時捕獲步驟後進行下述步驟而獲得純化的FvW溶液和純化的FVIII溶液a)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫FvW，b)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值甚至高於用來回收VonWillebrand因子的值來洗脫FVIII，c)在離子交換色譜膜上捕獲VonWillebrand因子，d)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫VonWillebrand因子，e)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對步驟d)洗脫的富含VonWillebrand因子的級分進行色譜，禾口f)回收沒有在凝膠親和上保留的富含VonWillebrand的級分。因此，這一實施方式中，順序獲得純化的FVIII溶液和純化的FvW溶液。根據本發明的方法，在其多種實施方式中，能夠因此以簡化的方式分離FVIII和FvW。根據本發明的純化步驟是唯一通過在陰離子交換色譜選擇性膜上同時捕獲兩種蛋白質而能夠從血漿分別或同時純化因子VIII和VonWillebrand因子的步驟。本發明的又一目的在於提供製備純化的FVIII的方法，包括實施根據本發明的純化方法。本發明的又一目的在於提供製備純化的FvW的方法，包括實施根據本發明的純化方法。將在下面實施例中描述本發明的其他方面和優點，這隻為說明的目的而不以任何方式限制本發明的範圍。附圖圖1:VonWillebrand因子純化方法的圖表。圖2:因子VIII純化方法的圖表。實施例實施例1:VonWillebrand因子的純化方法通過將新鮮的冷凍血槳融化至1°C和6°C之間的溫度來製備冷沉澱物。離心後，回收含有纖維蛋白原、纖連蛋白、VonWillebrand因子和因子VIII的冷沉澱物並在含有肝素鈉(3IU/mL)的水性溶液中成為漿液。然後將溶液pH調至7.0士0.1。通過在氧化鋁凝膠上吸附以除去維生素K依賴的因子以及通過冷沉澱來除去纖維蛋白原和纖連蛋白，對冷沉澱物漿液進行預純化。因此，攪拌中向懸液中加入氫氧化鋁，攪拌5分鐘。用乙酸0.1M將pH值調至6.5±0.2並在攪拌下冷卻溶液至溫度達到14至18t:的範圍。然後離心溶液至溫度為14-18°C。回收上清並通過在0.22iim過濾膜上過濾來澄清。然後通過在足以對抗有包膜病毒的在聚山梨酯80(1%，w/v)和磷酸三正丁酯(0.3%，v/v)存在下的溶劑/去汙劑處理來對預純化的溶液進行病毒滅活步驟。用溶劑/去汙劑的處理在pH值為7.1下進行至少6小時的時間。然後使溶劑/去汙劑處理的蛋白質溶液流經強陰離子交換接枝膜，例如MustangQ膜盒，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的鹼性緩衝液平衡以達到370至390mOsm/Kg範圍的重量摩爾滲透壓濃度。—旦該蛋白質溶液通過，用相同的緩衝液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。未被膜吸附的蛋白質級分含有大量纖維蛋白原以及被加入用於基於溶劑/去汙劑的病毒滅活處理的化學劑。然後通過施用因加入氯化鈉而增加離子強度以達到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9-7.1的鹼性緩衝液來洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。然後用不含氯化鈉的pH6.9-7.1的鹼性緩衝液稀釋洗脫後的級分直到達到重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg。然後使稀釋後的級分通過MustangQ膜盒類型的強陰離子交換接枝膜，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的鹼性緩衝液平衡以達到370至390mOsm/Kg範圍的重量摩爾滲透壓濃度。一旦該蛋白質溶液通過，用相同的緩衝液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。然後通過施用因加入氯化鈉而增加離子強度以達到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9_7.1的鹼性緩衝液來洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。然後使用明膠配體在凝膠上對洗脫後的級分進行親和色譜，該凝膠之前用因加入氯化鈉而增加離子強度以達到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9_7.1的鹼性緩衝液來平衡。一旦該蛋白質溶液通過，用相同的緩衝液(重量摩爾滲透壓濃度為600至660mOsm/Kg)洗滌親和凝膠直到柱洗脫液的光密度回到基線。包括凝膠衝洗液的未吸附級分表示高純度的富含VonWillebrand的級分。圖l示出了純化圖表。結果表1:VonWillebrand因子的純化14tableseeoriginaldocumentpage15實施例2:純化因子VIII的方法通過將新鮮的冷凍血槳融化至1°C和6°C之間的溫度來製備冷沉澱物。離心後，回收含有纖維蛋白原、纖連蛋白、VonWillebrand因子和因子VIII的冷沉澱物並在含有肝素鈉(3IU/mL)的水性溶液中成為漿液。然後將溶液pH調至7.0士0.1。通過在氧化鋁凝膠上吸附以除去維生素K依賴的因子以及通過冷沉澱來除去纖維蛋白原和纖連蛋白，來對冷沉澱物漿液進行預純化。因此，攪拌下向懸液中加入氫氧化鋁並攪拌5分鐘。用乙酸0.1M將pH值調至6.5±0.2並在攪拌下冷卻溶液至溫度達到14至18t:的範圍。然後離心溶液至溫度為14-18°C。回收上清並通過在0.22iim過濾膜上過濾來澄清。然後使溶劑/去汙劑處理的蛋白質溶液流經強陰離子交換接枝膜，例如MustangQ膜盒，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的鹼性緩衝液平衡以達到370至390mOsm/Kg範圍的重量摩爾滲透壓濃度。—旦該蛋白質溶液通過，用相同的緩衝液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。未被膜吸附的蛋白質級分含有大量纖維蛋白原以及被加入用於基於溶劑/去汙劑的病毒滅活處理的化學劑。然後通過施用因加入氯化鈉而增加離子強度以達到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9-7.1的鹼性緩衝液來洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。可按照實施例l所述繼續VonWillebrand因子的純化。然後通過施用因加入氯化鈉而增加離子強度以達到重量摩爾滲透壓濃度為1400-1700mOsm/Kg的pH6.9_7.1的鹼性緩衝液來洗脫吸附在膜上的因子VIII。有利地，用通過加入氯化鈣而獲得的高離子強度值的pH6.0的緩衝液洗脫因子VIII。圖2示出了純化圖表。結果表2:因子VIII的純化步驟產率(％)比活性(IU/mg)初始冷沉澱物1000.3815tableseeoriginaldocumentpage16權利要求從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源於非人動物的分泌物的溶液，和(iv)源於含有FVIII的植物提取物的溶液來純化FVIII或FvW的方法，所述方法的特徵在於，包括在離子交換色譜過濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。2.根據權利要求l的方法，其中所述過濾型膜為陰離子交換色譜膜。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述過濾型膜為強陰離子交換器。4.根據前述任一權利要求的方法，其中所述膜帶有包括季銨基團的包被。5.根據前述任一權利要求的方法，其中所述膜為大孔型膜。6.根據前述任一權利要求的方法，其中所述膜為聚醚碸型膜。7.根據前述任一權利要求的方法，其中所述溶液含有FVIII和FvW的混合物。8.根據權利要求7的方法，其中所述溶液為血漿源的。9.根據權利要求8的方法，其包括下述步驟a)提供來自血漿的冷沉澱物，b)在所述離子交換色譜膜上吸附因子VIII和VonWillebrand因子，c)通過使用具有適當離子強度值的洗脫緩衝液來回收因子VIII或VonWillebrand因子。10.根據權利要求9的方法，其中根據下述步驟進行VonWillebrand因子和因子VIII的選擇性回收cl)通過用具有適當離子強度值的緩衝液進行洗脫來選擇性回收FvW，c2)通過用具有高於步驟cl)所用緩衝液的離子強度值的適當離子強度值的緩衝液進行洗脫來選擇性回收FVIII。11.根據權利要求1-9中任一項的方法，其還包括下述步驟d)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫FvW，e)在離子交換色譜膜，更優選在與第一膜相同類型的膜上捕獲VonWillebrand因子，f)通過增加所述色譜膜的平衡緩衝液的離子強度值來洗脫VonWillebrand因子。12.根據權利要求11的方法，其還包括下述步驟g)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對權利要求11的步驟c)洗脫的富含VonWillebrand因子的級分進行色譜，h)回收沒有纖連蛋白的未被滯留的VonWillebrand因子級分。13.生產純化的FVIII的方法，其包括實施根據權利要求1-10中任一項的方法。14.生產純化的FvW的方法，其包括實施根據權利要求1-12中任一項的方法。全文摘要本發明涉及純化方法，包括從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源於非人動物的分泌物的溶液，和(iv)源於含有FVIII的植物提取物的溶液開始在離子交換色譜過濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。文檔編號C07K1/18GK101796065SQ200880104709公開日2010年8月4日申請日期2008年8月28日優先權日2007年8月30日發明者M·普勒,P·博內爾申請人:Lfb生物技術公司