Y染色體微缺失SYBRGreenI實時螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法
2023-04-28 11:34:31 1
專利名稱：Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及染色體缺失檢測領域，尤其涉及一種Y染色體微缺失實時螢光定量 PCR檢測試劑盒。
背景技術：
世界範圍內有15%的育齡夫婦患有不孕不育症，其中男性不育的因素約佔50%， 在這50%的男性不育患者中，35%以上是由於遺傳學異常引起的。Y染色體微缺失是導 致男性不育的主要遺傳學因素之一，因此檢測Y染色體微缺失具有重要的臨床參考價值。 1976年，Ti印lolo和Zuffardi發現無精症患者有Y染色體長臂(Yqll)缺失，故稱該部位 為無精子因子(azoospermia factor，AZF)。目前認為控制精子生長的基因位於Y染色體長 臂遠側的常染色質區，該部位有無精子因子AZF，現已明確至少有3個精子生成部位(AZFa、 AZFb、AZFc)，分別位於Yqll的近端、中間和遠端。Y染色體微缺失發生在Y染色體上與AZF 相關的多個基因上。雖然由於各實驗室檢測對象的選擇標準不同，檢出率有比較大的差異， 但各區的缺失頻率基本穩定AZFc佔總缺失率的79%，AZFb佔9%，AZFa+b佔6%，AZFa佔 3%，AZFa+b+c佔3%。這些區域的微缺失將導致精子發生障礙，少精，弱精，甚至無精。
AZFa、AZFb、AZFc 3個區域的STS位點模式圖如圖1所示。 本發明中的試劑盒分別針對其中3個STS位點，即sY86、sY127和sY255設計特異 的引物對進行SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測，同時提供sY86、sY127和sY2553個位 點的陽性對照樣品，確保檢測結果的準確性。 Y染色體微缺失是一種常見的染色體異常疾病，主要是生殖細胞減數分裂過程中 染色體分離不平衡的結果。該疾病可以從正常的帶微缺失的精子傳遞下來，也可以通過正 常精子受精後在胚胎發育過程中發生Y染色體的微缺失。隨著現代輔助生殖技術的進展， 卵細胞胞漿內精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術被認為是男性不 育症治療上的一次革命。然而該技術可能將攜帶染色體畸形、缺失或基因突變的精子注入 到卵胞漿內，使卵子受精，從而將上述各種遺傳缺陷傳給下一代。因此，為了確定是否需要 治療，臨床醫生建議所有精子濃度< 5X 106/mL的男性原則上都要進行Y染色體微缺失的 分子診斷。從1999年開始，歐洲男科學協會和歐洲分子遺傳實驗質控協作網(EMQN)為提 高診斷質量，出版了Y染色體微缺失分子診斷指南，並提供了客觀的質量評價實驗方法。最 新版的實驗室指南是根據2003年10月在佛羅倫斯舉行的"Best Practice Meeting"的成 果，在1999年版的基礎上修訂而成。對於Y染色體微缺失的篩查，1999年版的指南被證明 是準確、靈敏和易於操作的。根據Y染色體序列和微缺失機制的最新研究進展，1999年版的 指南能夠滿足準確診斷的需要，實踐證明是非常有效和合適的。 Y染色體微缺失的分子檢測方法主要有Southern blot印跡雜交、聚合酶鏈式反 應(polymerase chain reaction, PCR)結合電泳檢測技術等，其中常規PCR電泳技術是目 前各研究中最常用、最簡單和最有效的方法。然而影響常規PCR技術臨床應用的巨大障礙
3是擴增產物汙染的問題，其結果易出現假陰性和假陽性。儘管採取優化PCR條件和設立對 照安全保證(如使用女性DNA作為陰性對照)等多個嚴格質量控制措施，PCR的擴增仍可 能會失敗。 中國專利200410043918. 0公開了特異性擴增Y染色體微缺失基因STS中的sY87 和sY143的兩對引物序列；中國專利200710074317. X公開了特異性擴增Y染色體微缺失基 因AZF的30條引物和特異性擴增男性特有SRY基因的2條引物。以上兩個專利都是採用 常規PCR方法進行擴增反應，該方法的不足之處是採用電泳檢測，易引起PCR產物的交叉感 染，增加了假陽性結果的可能性。
發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在於提供一種可穩定、高效檢測Y染色體微缺失 的SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒。
為達到上述目的，本發明採用如下技術方案 —種Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包 括 特異性擴增Y染色體AZFa亞區sY86序列的引物，其鹼基序列如SEQID NO : 1和2 所示；Y染色體AZFa亞區sY86位點陽性對照樣品用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所
示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品；特異性擴增Y染色體AZFb亞區sY127序列的引物，其鹼基序列如SEQ ID N0:3和
4所示；Y染色體AZFb亞區sY127位點陽性對照樣品用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所 示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品；
特異性擴增Y染色體AZFc亞區sY255序列的引物，其鹼基序列如SEQ ID N0:5和 6所示；Y染色體AZFc亞區sY255位點陽性對照樣品用SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所
示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品。 所述試劑盒進一步包括SYBR Green I螢光染料。 所述試劑盒進一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反應緩衝液。 所述MgCl2反應終濃度為4mM。 所述dNTPs反應終濃度為0. 2mM。 本發明的第二個目的在於提供SYBR Green I實時螢光定量PCR在Y染色體微缺 失檢測中的應用。 實時螢光定量PCR (real time fluorescence quantitative PCR)是一種新的基 因檢測技術，它通過對PCR擴增反應中每一個循環產物螢光信號的實時檢測從而實現對起 始模板定量及定性的分析。該技術在PCR基礎上提高了檢測特異性；擴增與自動分析一體 化，操作方便、簡單、快速；閉管操作，無需電泳，可降低PCR產物汙染可能性；實驗結果為實 時檢測所得動態曲線，較終點檢測可靠等。基於以上優點，實時螢光定量PCR技術呈現出取 代常規PCR技術的趨勢。
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SYBR Green I是一種結合於小溝中的雙鏈DNA結合染料。與雙鏈DNA結合後，其 螢光大大增強。SYBR Green I在核酸的實時檢測方面有很多優點，由於它與所有的雙鏈DNA 相結合，不必因為模板不同而特別定製，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。利用 螢光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質，通過熔解曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚 體，因而可以區分非特異擴增，進一步地還可以實現單色多重測定。此外，由於一個PCR產 物可以與多分子的染料結合，因此SYBR Green I的靈敏度很高。但是，由於SYBR Green I 與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的 假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度後螢光的變化可以幫助降低非特異產物的 影響。由熔解曲線來分析產物的均一性有助於分析由SYBRGreen I得到的定量結果。
本發明首次提供了 Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒， 該試劑盒具有如下優點 1)檢測時間短，速度快，高通量，可在4-6小時完成96個樣品的定量分析。
2)操作過程簡單，從PCR反應開始，就是在封閉的體系中完成擴增和實時測定，大 大降低了汙染的可能性，因此也就降低了結果偏差的機率。 3)對標本DNA獲取的質量要求較低，無論是石蠟組織還是新鮮組織，都能取得理 想的檢測結果。 4)螢光定量PCR法結果的判讀在閾值線以上有擴增曲線的標本均為陽性標本， 結果判讀簡單、明確、直觀，若需要亦可對結果進行定量分析。 5)檢測的靈敏度高，螢光PCR檢測技術是綜合了 PCR技術、螢光標記技術、雷射技 術、數碼顯像技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。 6)利用螢光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質，通過熔解曲線分析識別特異性產 物和非特異性產物，降低引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤擴增引起的非特異性產物的 影響，保證檢測結果的準確性。
圖1是AZFa、 AZFb、AZFc 3個區域的STS位點模式圖； 圖2是陽性對照樣品Y染色體AZFa亞區sY86位點、Y染色體AZFb亞區sY127位
點、Y染色體AZFc亞區sY255位點的FQ-PCR圖； 圖3、圖4、圖5是三名臨床正常已育男性樣本的FQ-PCR圖； 圖6、圖7、圖8是三名待檢測男性基因組DNA樣本的FQ-PCR圖； 圖9是pUCm-T-sY86質粒圖譜； 圖10是pUCm-T-sY127質粒圖譜； 圖11是pUCm-T-sY255質粒圖譜。 附圖標號說明S表示樣本，P表示陽性對照，N表示陰性對照。
具體實施方式
—、材料
1、儀器 實時螢光定量PCR儀，移液器，離心機。
本發明設計了 3對PCR引物分別特異的擴增AZF STSs序列，引物序列如下所示。 表l引物列表
引物名稱序號擴增對象
sY86-F sY86-RSEQIDNO :1 SEQIDNO :2特異性擴增Y染色 體AZFa亞區sY86序列
sY127-F sY127-RSEQIDNO :3 SEQIDNO :4特異性擴增Y染色 體AZFb亞區sY127序列
sY255-F sY255-RSEQIDNO :5 SEQIDNO :6特異性擴增Y染色 體AZFc亞區sY255序列 3、陽性對照重組質粒pUCm-T-sY86、 pUCm-T_sY127和pUCm-T_sY255。
4、試劑 10XPCR buffer、MgCl2、Taq酶、dNTPs、 1000X SYBR Green I螢光染料。
二、方法 1、人類基因組DNA的提取 用蛋白酶K裂解和酚_氯仿抽提法或市售試劑盒從人類抗凝外周血白細胞中提取
基因組DNA，分別提取三名臨床正常已育男性基因組DNA、三名待檢測男性基因組DNA和一
名女性基因組DNA。 2、螢光定量PCR擴增反應 取PCR反應管，在管壁上做好標記，分別加入螢光定量反應液9. 75ii L(包括 10XPCR Buffer 2. 5 ii L(無Mg2+) 、25mM MgCl2 4iiL、10mM dNTPs0. 5 ii L、 10 ii M上遊引物 0. 5 ii L、 10 ii M下遊引物0. 5 ii L、 10 X SYBR Green 11. 25 ii L、5U/ ii L酶0. 5 ii L)，已提取的 樣本基因組DNA 0. 625 y L(含基因組DNA約25ng)，最後加入無菌水至25 y L反應總體系。 該過程需在冰上操作，每個樣品同時做3個PCR擴增進行檢測，且每次檢測都同時設立一組 陽性對照和一組陰性對照(女性基因組DNA)。 螢光定量反應在ABI 7300檢測儀上進行，按以下條件進行擴增
第一階段95。C 15min ; 第二階段94。C 30sec， 57°C 45sec (螢光收集)，72°C 30sec， 35個循環;
第三階段(熔解曲線)95。C 15sec，60。C lmin，95。C 15sec，60。C 15sec。
三、結果判定 讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高 點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。
(1)樣品Ct值《30.0，出現典型的擴增曲線，則表示樣本Y染色體在該位點沒有 微缺失；若無典型的擴增曲線，則表示樣本Y染色體在該位點發生了微缺失。
(2)陽性對照Ct值《30. 0，出現典型的擴增曲線，如圖2所示。
(3)陰性對照無Ct值並且無擴增曲線。
從圖3、圖4、圖5可以看出，三名臨床正常已育男性樣本均擴增出典型陽性擴增曲 線，該三名男性未發生Y染色體的微缺失。 從圖6 、圖7、圖8可以看出，三名待檢測男性基因組DNA樣本也均擴增出典型陽性
擴增曲線，證實該三名男性也未發生Y染色體微缺失基因。 SEQUENCE LISTING 〈110〉深圳博睿祥暉生物技術有限公司 〈120>Y染色體微缺失基因SYBR Greenl實時螢光定量PCR檢測試劑盒 〈130>P10922 〈160>6 PatentIn version 3. 3 〈210〉1 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 gtgacacaca gactatgctt c 21 〈210>2 〈211>20 DNA 人工序列 〈400〉2 acacacagag ggacaaccct 20 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>3 ggctc3ca朋cg朋朋g朋3 20 4 〈211〉20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 ctgcaggcag taat朋ggga 20 〈210>5
〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列6〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ctcgtcatgt gcagccac18
i兌明 書 6/6頁
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權利要求
一種Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括特異性擴增Y染色體AZFa亞區sY86序列的引物，其鹼基序列如SEQID NO1和2所示；Y染色體AZFa亞區sY86位點陽性對照樣品用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品；特異性擴增Y染色體AZFb亞區sY127序列的引物，其鹼基序列如SEQ ID NO3和4所示；Y染色體AZFb亞區sY127位點陽性對照樣品用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品；特異性擴增Y染色體AZFc亞區sY255序列的引物，其鹼基序列如SEQ ID NO5和6所示；Y染色體AZFc亞區sY255位點陽性對照樣品用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示序列的引物對得到的擴增產物為插入子構建的重組質粒作為陽性參考品。
2. 根據權利要求1所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑 盒，其特徵在於，所述試劑盒進一步包括SYBR Greenl螢光染料。
3. 根據權利要求1或2所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測 試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒進一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反應緩衝液。
4. 根據權利要求3所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑 盒，其特徵在於，所述MgCl2反應終濃度為4mM。
5. 根據權利要求3所述的Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑 盒，其特徵在於，所述dNTPs反應終濃度為0. 2mM。
6. SYBR Green I實時螢光定量PCR在Y染色體微缺失檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種Y染色體微缺失SYBR Green I實時螢光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒利用實時螢光定量PCR可以檢測Y染色體AZFa亞區sY86位點，Y染色體AZFb亞區sY127位點，Y染色體AZFc亞區sY255位點的基因缺失，操作方便，檢測結果穩定。
文檔編號G01N21/64GK101701248SQ20091010634
公開日2010年5月5日 申請日期2009年3月23日 優先權日2009年3月23日
發明者汪朝暉 申請人:深圳博睿祥暉生物技術有限公司