酶-孔構建體的製作方法

2023-04-28 08:57:36 6

酶-孔構建體的製作方法
【專利摘要】本發明涉及包含跨膜蛋白孔亞基和核酸操作酶的構建體。所述孔亞基與所述酶共價結合，從而所述亞基與所述酶均保留其活性。所述構建體可用於產生其上結合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。這些孔特別可用於測序核酸。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通過隨機傳感來檢測其組成核苷酸。
【專利說明】酶-孔構建體
[0001]本申請為分案申請，其原申請的申請日為2009年7月6日，申請號為200980134886.6 (國際申請號為PCT/GB2009/001679)，名稱為「酶-孔構建體」。
【技術領域】
[0002]本發明涉及包含跨膜蛋白孔亞基和核酸操作酶(nucleic acid handlingenzyme)的構建體。所述孔亞基與所述酶共價結合使得所述亞基與所述酶均保留其活性。所述構建體可用於產生結合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。這些孔特別可用於核酸測序。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通過隨機傳感來檢測其每個組成核苷酸。
【背景技術】
[0003]隨機傳感是一種依賴於對分析物分子與受體之間個體結合事件的觀察結果的傳感方法。隨機傳感器可通過如下方式形成:將納米尺寸的單孔置入絕緣膜中，並且在存在分析物分子的情況下測量電壓驅動的穿過所述孔的離子轉運。電流波動的發生頻率可揭示在所述孔中結合的分析物的濃度。分析物的種類通過其特徵性的電流特徵特別是電流阻斷的持續時間和程度而示出(Braha, 0., Walker, B., Cheley, S., Kasianowicz, J.J., Song, L., Gouaux, J.E., and Bayley, H.(1997) Chem.Biol.4, 497-505 ; andBayley, H., and Cremer, P.S.(2001)Nature413, 226-230)。
[0004]形成細菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用於對許多類型的分子進行隨機傳感(Bayley, H., and Cremer, P.S.(2001) Nature413, 226-230; Shin, S., H., Luchian, T., Cheley, S., Braha, 0., and Bayley, H.(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41, 3707-3709; Guan, X., Gu, L.-Q., Cheley, S., Braha, 0., and Bayley, H.(2005)ChemBio Chem6，1875-1881)。在這些研究的過程中，已發現，試圖將a-HL改造以直接結合小的有機分析物的嘗試是很費力的，並且鮮有成功的實例(Guan，X.，Gu, L.-Q.，Cheley, S., Braha, 0., and `Bayley, H.(2005) ChemBio Chem6, 1875-1881)。幸運地是，人們發現了一種不同的策略，該策略利用了非共價結合的分子銜接體，特別是環糊精(Gu，L? -Q., Braha, 0., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H.(1999) Nature398, 686-690)、環妝(Sanchez-Quesada, J., Ghadiri, M.R., Bayley, Η., and Braha, 0.(2000) J.Am.Chem.Soc.122，11758-11766)和葫蘆脲(Braha, 0.，Webb, J.，Gu, L.-Q.，Kim, K.，and Bayley, H.(2005) ChemPhysChem6, 889-892)。環糊精可短暫地進入所述a -HL孔中，並產生很大程度但不完全的通道阻斷。有機分析物在環糊精的疏水內部發生結合，它們可加強這種阻斷，使得可實現分析物檢測(Gu, L.-Q., Braha, 0., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H.(1999)Nature398, 686-690)。
[0005]現在在大範圍應用中需要快速且廉價的DNA或RNA測序技術。現有的技術速度慢且價格昂貴，這主要是由於其倚賴於擴增技術產生大量核酸並且需要大量專用的螢光化學物質進行信號檢測。隨機傳感有可能通過減少所需核苷酸和試劑的量提供快速且廉價的DNA測序。
【發明內容】

[0006]發明人出人意料地證明了跨膜蛋白孔亞基與核酸操作酶的共價結合，可產生既能形成孔又能操作核酸的構建體。發明人還出人意料地證明了所述構建體可用於產生一種既能操作核酸又能通過隨機傳感測序核酸的跨膜蛋白孔。所述酶與所述孔的固定性質與緊密接近是指靶核酸中的核苷酸的一部分會與所述孔相互作用並以特徵性的方式影響流過所述孔的電流。因此，包含這種構建體的跨膜蛋白孔是用於隨機傳感特別是用於測序核酸的有用工具。
[0007]因此，本發明提供了一種包含跨膜蛋白孔亞基和核酸操作酶的構建體，其中所述亞基與所述酶共價結合，其中所示亞基保留其形成孔的能力並且其中所述酶保留其操作核酸的能力。本發明還提供了:
[0008]-一種編碼本發明構建體的核酸序列；
[0009]-一種用於測序核酸的改性孔，包含至少一種本發明構建體；
[0010]-一種產生用於測序核酸的經改變的孔的試劑盒，包含:
[0011](a)至少一種本發明構建體；和
[0012](b)形成孔所需的任何其他亞基；
[0013]-一種產生用於測序核酸的經改變的孔的試劑盒，包含:
[0014](a)至少一種本發明的多核苷酸；和
[0015](b)編碼形成孔所需的任何其他亞基的多核苷酸序列；
[0016]-一種產生本發明構建體的`方法,包括:
[0017](a)使核酸操作酶與跨膜蛋白孔亞基共價結合；和
[0018](b)確定所得構建體是否能夠形成孔和操作核酸；
[0019]-一種產生本發明的經改變的孔的方法，包括:
[0020](a)使核酸操作酶與跨膜蛋白孔共價結合；和
[0021](b)確定所得孔是否能夠操作核酸並檢測核酸；
[0022]-一種產生本發明的經改變的孔的方法，包括:
[0023](a)使至少一種本發明構建體與其他合適的亞基形成孔；和
[0024](b)確定所得孔是否能夠操作核酸並檢測核苷酸；
[0025]-一種純化包含至少一種本發明構建體的跨膜孔的方法，包括:
[0026](a)提供所述至少一種構建體與形成孔所需的其他亞基；
[0027](b)使所述至少一種構建體與其他亞基在合成脂質囊泡上寡聚體化；和
[0028](C)使所述囊泡與非離子表面活性劑接觸；和
[0029](d)回收所述寡聚體化的孔；
[0030]-一種測序靶核酸序列的方法，包括:
[0031](a)使所述靶序列與本發明的孔一其包含核酸外切酶一接觸，從而使所述核酸外切酶從所述靶序列的一端消化單個核苷酸；
[0032](b)使所述核苷酸與所述孔接觸從而使所述核苷酸與所述銜接體相互作用；
[0033](C)測量在相互作用過程中通過所述孔的電流並且從而確定所述核苷酸的種類；和[0034](d)在靶序列的同一端重複步驟(a)到(C)從而確定所述靶序列的序列；以及
[0035]-一種測序靶核酸序列的方法，包括:
[0036](a)使所述靶序列與本發明的孔接觸從而使所述酶將所述靶序列推過或拉過所述孔，所述靶序列中核苷酸的一部分與所述孔相互作用；和
[0037](b)測量在每個相互作用過程中通過所述孔的電流並且從而確定所述靶序列的序列。【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1示出了核酸外切酶如何催化磷酸二酯鍵的水解。在所述核酸外切酶的活性位點內，水分子能夠與多核苷酸(DNA)的3』末端的磷酸基反應。磷酸基與糖之間的鍵向5』端的斷裂可釋放出單磷酸(脫氧)核苷。
[0039]圖2示出了實施例中所用的核酸外切酶的晶體結構，對每種核酸外切酶均示出了N和C末端及活性位點:i)適應性修改形式的EcoExoIII ；ii)EcoExoI ；iii)TthRecJ-cd ;和iV)Lambda exo。
[0040]圖3示出了裝配有a-HL孔的核酸外切酶的示意圖。核酸外切酶與所述七聚體的七個單體之一在基因上融合，其中連接臂足夠長以使得核酸外切酶部分和a -HL部分可正確蛋白摺疊。
[0041]圖4示出了所產生的蛋白構建體的通式圖，其示出了在α-HL基因中的BspEI插入位點。由編碼(絲氨酸/甘氨酸)X5重複物(顯示為陰影)的兩段DNA界定的連接物AfuExoIII可產生一個融合蛋白，其中在所示T7啟動子的轉錄控制下會產生64.5kDa的蛋白。
[0042]圖5示出了 a -HL環I融合構建體與野生型a -HL以不同蛋白比例的寡聚體化。i) HL-Wt-EcoExoII1-L1-H6 ;ii)HL-RQC-EcoExo1-Ll-H6 ;和 iii) HL-RQC-TthRecJ-L1-H6。
[0043]圖6示出了通過不同單體比例控制同七聚體和異七聚體的產生。HL-RQ亞基以白色示出，融合亞基以黑色示出。增大融合亞基與野生型亞基的比例可增加2: 5、1:6和0:7的異七聚體和同七聚體的產生。類似地，升高HL-RQ單體的濃度可增加6:1和5:2的異七聚體的產生。
[0044]圖7示出了含有剛性聚脯氨酸EcoExoIII C末端接頭的HL-RQC-EC0EX0II1-L1-H6融合蛋白的寡聚體化。在純化的兔紅細胞膜的存在下，IVTT表達以5:1的野生型與融合蛋白的比例混合的蛋白。i)HL-RQC-EC0Ex0II1-Ll-{SG}5+{SG}5-H6 ； ii)HL-RQC-EcoExoII1-Ll-{SG}5+5P-H6 ； iii)HL-RQC-EcoExoII1-Ll-4SG+5P-H6;和iv) HL單體。
[0045]圖8示出了具有成熟七聚體的單α-溶血素亞基的環2區。亞基I以白色示出，亞基2-7以灰色示出，亞基I的環2區以黑色示出。
[0046]圖9示出了其他環2EcoExoIII融合蛋白的寡聚體化。i)
[0047]HL-(RQ)7 ；ii) HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExoII1-L2a-H6)! ；iii)
[0048]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111 -L2a-8P_H6)! ; i v)
[0049]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo111-L2-H48 Δ -H6)! ；v)
[0050]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo111-L2-D45 Δ -H6)! ；vi)[0051]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo111-L2-D45-K46 Δ -H6)!;和 vii)
[0052]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111-L2-D45-N47 Λ -H6)!。
[0053]圖10示出了其他環2EcoExoIII融合蛋白的寡聚體化。i)
[0054]HL-(RQ)7 ； i i) HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111-L2a-H6)! ；iii)
[0055]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111-L2-D45-N47 Δ -H6)! ；iv)
[0056]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo111-L2-D46-K56 Δ -Η6)! ；ν)
[0057]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo111-L2-D46 Δ -Η6)! ；ν?)
[0058]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111-L2-D46-N47 Δ -Η6)! ；vii)
[0059]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExoII1-L2-Al-S16 Δ /D46-N47 Δ -Η6)! ；viii)
[0060]HL-(RQ) 6 (RQC-EcoExoII1-L2-F42-D46 Δ -Η6)!;和 ix)
[0061 ] HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo 111-L2-143-D46 Δ -H6)!。
[0062]圖11示出了 EcoExoIII C末端融合蛋白的寡聚體化。a)指示溶血素和酶融合蛋白單體均被放射性標記，b)指示僅融合蛋白單體被放射性標記。i)HL-(RQ)6(RQC-EcoExo1-Cter-{SG}8-H6)1；ii)
[0063]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo1-Cter-DG {SG} 8-H6) 1；iii)
[0064]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo1-Cter-ffPV {SG} 8-H6)!; iv)
[0065]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExoI—Cter—DGS {P} 12—H6) 1；和 v)
[0066]HL- (RQ) 6 (RQC-EcoExo1-Cter-ffPV {P} 12-H6)
[0067]圖12示出了不同表面活性劑對EcoExoIII活性的效應。左圖一十二烷基硫酸
鈉(SDS):a:0% ；b:0.1% ；c:0.5%。右圖-正十二烷基 _D_ 麥芽糖苷(DDM):a:0% ；b:0.1% ；
c:0.25% ;d:0.5%ο
[0068]圖13示出了大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)pLyS表達的α-溶血素單體的寡聚體化，用於優先形成和純化6:1異七聚體。將His-標籤純化用於在異七聚體和野生型同七聚體之間進行選擇，以得到大量過量的6:1異七聚體。
[0069]圖14示出了單體和異七聚體融合蛋白的核酸外切酶活性。左圖——野生型和融合單體的活性:a，10_2稀釋的
[0070]HL-RQC-EcoExoII1-L1-H6 ；b, 10-4 稀釋的
[0071]HL-RQC-EcoExoII1-L1-Η6 ；c, 1(T6 稀釋的
[0072]HL-RQC-EcoExoII1-L1-Η6 ；d, 1(T2 稀釋的 HL-RQ。右
[0073]圖——HL-(RQ) 6 (RQC-EcoExoII1-Ll-H6)!的活性:a，DDM 粗提取物；b，純化的N1-NTA ；c,純化的N1-NTA和緩衝液置換。
[0074]圖15示出——HL-(RQ)6(RQc-EcoExoII1-Ll-He)1異七聚體的鹼基檢測。上跡線獲自與ame-amPDP1- β CD銜接體分子共價結合的異七聚體。可觀察到其他阻斷事件，所述阻斷事件是由進行鹼基識別的單個單磷酸核苷造成的。下圖表示出了上跡線的DNMP事件的相應直方圖。從左到右，峰分別對應G、T、A和C。數據在400/400mM KC1、180mV和10 μ MdNMP下獲取。
[0075]序列表說明
[0076]SEQ ID NO:1示出了編碼野生型α -溶血素(a -HL)的一個亞基的多核苷酸序列。
[0077]SEQ ID NO: 2示出了野生型a-HL的一個亞基的胺基酸序列。胺基酸2_6、73_75、207-209,214-216 和 219-222 構成 α -螺旋。胺基酸 22-30、35-44、52-62、67-71、76_91、98-103、112-123、137-148、154-159、165-172、229-235、243-261、266-271、285-286 和291-293 構成 β-鏈。所有其他非末端胺基酸，即 7-21、31-34、45-51、63-66、72、92-97、104-111、124-136、149-153、160-164、173-206、210-213、217、218、223-228、236-242、262-265,272-274和287-290構成環區。胺基酸I和294為末端胺基酸。
[0078]SEQ ID Ν0:3示出了編碼a-HL Ml13R/N139Q(HL-RQ)的一個亞基的多核苷酸序列。
[0079]SEQ ID Ν0:4示出了 a-HL Ml 13R/N139Q (HL-RQ)的一個亞基的胺基酸序列。在野生型α-HL中構成α-螺旋、β _鏈和環區的相同胺基酸在此亞基中構成相應的區域。
[0080]SEQ ID N0:5*m7pT7a-HL BspEI 敲除的多核苷酸序列(pT7-SCl_BspEI_K0)。a -HL編碼序列在核苷酸2709和3593之間。BspEI其餘部分位於核苷酸3781和3782。
[0081]SEQ ID N0:6示出了在位置I(Ll)含有BspEI克隆位點的編碼野生型a -溶血素的一個亞基的多核苷酸序列。
[0082]SEQ ID NO: 7示出了在位置2 (L2a)含有BspEI克隆位點的編碼野生型α -溶血素的一個亞基的多核苷酸序列。
[0083]SEQ ID Ν0:8示出了在位置2 (L2b)含有BspEI克隆位點的編碼野生型α -溶血素的一個亞基的多核苷酸序列。
[0084]SEQ ID NO:9示出了源於大腸桿菌的xthA基因的密碼子優化的多核苷酸序列。其編碼大腸桿菌的核酸外切酶III。
[0085]SEQ ID NO: 10示出了大腸桿菌的核酸外切酶III的胺基酸序列。此酶以3』到5』方向從雙鏈DNA(dsDNA)的一條鏈持續消化5』單磷酸核苷。酶在鏈上的啟動需要大約4個核苷酸的 5，突出。胺基酸 11-13、15-25、39-41、44-49、85-89、121-139、158-160、165-174、181-194、198-202、219-222、235-240 和 248-252 構成 α -螺旋。胺基酸 2-7、29_33、53_57、65-70、75-78、91-98、101-109、146-151、195-197、229-234和 241-246 構成 β -鏈。所有其他非末端胺基酸 8-10、26-28、34-38、42、43、50-52、58-64、71-74、79-84、90、99、100、110-120、140-145、152-157、161-164、175-180、203-218、223_228、247 和 253-261 構成環。胺基酸 I 和267和268為末端胺基酸。酶活性位點通過連接β廠α η β 3- β 4、β 5- β 6、β ΙΠ- Q1^iv-Q11和 βν_βνι 的環區(分別由胺基酸 8-10、58-64、90、110-120、152-164、175-180、223-228 和253-261構成)形成。單個二價金屬離子結合於殘基Ε34並通過D229和Η259組氨酸-天門冬氨酸催化對輔助對磷酸二酯鍵的親核攻擊。
[0086]SEQ ID NO: 11示出了源於大腸桿菌的sbcB基因的密碼子優化的多核苷酸序列。其編碼大腸桿菌的核酸外切酶I (EcoExoI)。
[0087]SEQ ID NO: 12示出了大腸桿菌的核酸外切酶I (EcoExoI)的胺基酸序列。此酶以3』到5』方向從單鏈DNA(ssDNA)持續消化5』單磷酸核苷。酶在鏈上的啟動需要至少12個核苷酸。胺基酸 60-68、70-78、80-93、107-119、124-128、137-148、165-172、182-211、213-221、234-241、268-286、313-324、326-352、362-370、373-391、401-454 和 457-475 構成 α-螺旋。胺基酸 10-18、28-26、47-50、97-101、133-136、229-232、243-251、258-263、298-302 和308-311 構成 β-鏈。所有其他非末端胺基酸 19-27、37-46、51-59、69、79、94-96、102-106、120-123、129-132、149-164、173-181、212、222-228、233、242、252-257、264-267、287-297、303-307、312、325、353-361、371、372、392-400、455 和 456 構成環。胺基酸 1-9 為末端胺基酸。所述酶的整體摺疊使得三個區域聯合以形成一個字母C外形的分子，但無序分布在所述晶體結構中的殘基355-358有效地將此C形轉化為類O形。氨基末端(1-206)可構成外切酶結構域並與DnaQ超家族具有同源性，如下殘基(202-354)構成SH3樣結構域並且羧基結構域(359-475)伸出外切酶結構域，以形成該分子的C形。EcoExoI的4個酸性殘基與DnaQ超家族的活性位點殘基是保守的(對應於D15、E17、D108和D186)。已經提出，單個金屬離子被殘基D15和108結合。DNA的水解似乎通過以活性水分子攻擊易切斷的磷酸基進行催化，以H181為催化殘基並比對所述核苷酸底物。
[0088]SEQ ID NO: 13示出了源於嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)的recj基因的密碼子優化的多核苷酸序列。其編碼嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。
[0089]SEQ ID NO: 14示出了嗜熱棲熱菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的胺基酸序列。此酶以5』到3』方向從單鏈DNA持續消化5』單磷酸核苷。酶在鏈上的啟動需要至少4個核苷酸的鏈。胺基酸 19-33、44-61、80-89、103-111、136-140、148-163、169-183、189-202、207-217、223-240、242-252、254-287、302-318、338-350 和 365-382 形成 α -螺旋。胺基酸36-40、64-68、93-96、116-120、133-135、294-297、321-325、328-332、352-355 和 359-363 構成鏈。所有其他非末端胺基酸 34、35、41-43、62、63、69-79、90-92、97_102、112-115、121-132、141-147、164-168、184-188、203-206、218-222、241、253、288-293、298-301、319、320、326、327、333-337、351-358和364構成環。胺基酸1-18和383-425為末端胺基酸。僅對嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的RecJ的核心結構域(殘基40-463)解析了晶體結構。為確保所述RecJ核心結構域的翻譯和體內表達的啟動，在其氨基末端添加一個甲硫氨酸殘基，這不包含在晶體結構信息中。所解析的結構示出了由一個長α-螺旋(254-287)連接的兩個結構域:氨基區(2-253)和羧基區(288-463)。催化殘基(D46、D98、H122和D183)配位單二價金屬離子用於對磷酸二酯鍵進行親核攻擊。D46和H120被認為是催化對；然而，大腸桿菌的RecJ中這些保守殘基的任一個的突變均顯示會完全破壞活性。
[0090]SEQ ID NO: 15示出了源於噬菌`體λ的exo (redX)基因的密碼子優化的多核苷酸序列。其編碼噬菌體λ的核酸外切酶。
[0091]SEQ ID NO: 16示出噬菌體λ的核酸外切酶的胺基酸序列。該序列是裝配為三聚體的三個相同亞基之一。該酶以3』到5』方向高度持續消化dsDNA的一條鏈的核苷酸。酶在鏈上的啟動優選地需要大約4個具有5』磷酸基的核苷酸的5』突出。胺基酸3-10、14-16、22-26、34-40、52-67、75-95、135-149、152-165 和 193-216 構成 α-螺旋。胺基酸 100-101、106-107、114-116、120-122、127-131、169-175 和 184-190 構成 β-鏈。所有其他非末端胺基酸 11-13、17-21、27-33、41-51、68-74、96-99、102-105、108-113、117-119、123-126、132-134、150-151、166-168、176-183、191-192、217-222 構成環。胺基酸 1、2 和 226 為末端胺基酸。λ外切酶是一個同三聚體，其形成具有通過中間的錐形通道的環狀體，所述通道明顯足夠大以使dsDNA在一端進入,並且只有ssDNA在另一端出來。催化殘基未確定,但單個二價金屬離子似乎通過殘基D119、E129和L130結合在每個亞基上。
[0092]SEQ ID NO: 17示出了編碼實施例中所用的HL-wt-EcoExoII1-Ll-H6的多核苷酸序列。
[0093]SEQ ID NO: 18示出了實施例中所用的HL-wt-EcoExoII1-Ll-H6的一個亞基的胺基酸序列。
[0094]SEQ ID NO: 19示出了編碼實施例中所用的HL-RQC-EcoExoII1-L1-H6的多核苷酸序列。
[0095]SEQ ID NO:20示出了實施例中所用的HL-RQC-EcoExoII1-Ll-H6的一個亞基的胺基酸序列。
[0096]SEQ ID NO: 21示出了編碼實施例中所用的HL-RQC-EcoExo 1-L1-H6的多核苷酸序列。 [0097]SEQ ID NO:22示出了實施例中所用的HL-RQC-EcoExo1-Ll_H6的一個亞基的胺基酸序列。
[0098]SEQ ID NO: 23示出了編碼實施例中所用的HL-RQC-TthRecJ-Ll_H6的多核苷酸序列。
[0099]SEQ ID NO: 24示出了實施例中所用的HL-RQC-TthRecJ-Ll_H6的一個亞基的胺基酸序列。
[0100]SEQ ID N0:25 示出了編碼實施例中所用的 HL-RQC-EcoExoII1-L2-D45-N47A-H6的多核苷酸序列。
[0101]SEQ ID N0:26 示出了實施例中所用的 HL-RQC-EcoExoII1-L2-D45-N47A-H6 的一個亞基的胺基酸序列。
[0102]SEQ ID N0:27 示出了編碼實施例中所用的 HL-RQC-EcoExo1-Cter-{SG}8-H6 的多核苷酸序列。
[0103]SEQ ID N0:28 示出了實施例中所用的 HL-RQC-EcoExo1-Cter-{SG}8-H6 的一個亞基的胺基酸序列。
[0104]SEQ ID N0:29 示出了編碼實施例中所用的 HL-RQC-EcoExo1-Cter-DG{SG}8-H6 的多核苷酸序列。
[0105]SEQ ID N0:30 示出了實施例中所用的 HL-RQC-EcoExo1-Cter-DG{SG}8-H6 的一個亞基的胺基酸序列。
[0106]SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32示出了實施例的核酸外切酶測定中所用的寡核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0107]應理解，所公開的產物和方法的不同用途可根據本領域內的具體需要進行調整。還應理解，本文所用的術語只是為了描述本發明的具體實施方案，而非意圖進行限制。
[0108]此外，除非上下文另有清楚的指明，否則本說明書和所附權利要求書中所用的單數形式「一個」、「一種」和「該」也包括複數指代物。因此，例如，提及「一個構建體」也包括「多個構建體」，提及「一個跨膜蛋白孔」包括兩個或更多個這類孔，提及「一個分子銜接體」包括兩個或多個所述銜接體，等等。
[0109]本文中——無論在上文還是下文——引用的全部出版物、專利和專利申請均以引用的方式全文納入本文。
[0110]構律體
[0111]本發明提供了可用於測序核酸的構建體。所述構建體包含跨膜蛋白孔亞基和核酸操作酶。所述亞基與所述酶共價結合。本發明構建體是形成能夠通過隨機傳感測序核酸的孔的有用工具。本發明構建體特別可用於產生既可操作靶核酸序列又可辨別靶序列中不同核苷酸的跨膜蛋白孔。如下文更詳細描述的，所述酶操作靶核酸的方式使得所述孔可識別靶序列中的核苷酸並從而測序所述靶序列。
[0112]所述亞基保留其形成孔的能力。構建體形成孔的能力可使用本領域任何已知方法測定。例如，可將所述構建體和其他合適的亞基一塊插入膜中，並可確定其寡聚體化以形成孔的能力。將構建體和亞基插入膜例如脂質雙層的方法為本領域所知。例如，可將構建體和亞基以純化形式懸浮於含有脂質雙層的溶液中，這樣使其擴散至所述脂質雙層，並且通過結合於所述脂質雙層並裝配為功能狀態而插入。或者，可使用M.A.Holden, H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005，127，6502-6503 和國際申請 PCT/GB2006/001057 (以 W02006/100484公開)記載的「拾取放置(Pick and place)」法將構建體和亞基直接插入到所述膜中。構建體形成孔的能力通常可如實施例中所述進行測定。
[0113]所述酶保留有其操作核酸的能力。這使得所述構建體可形成用於測序如下文所述核酸的孔。構建體操作核酸的能力可使用任何本領域已知的方法測定。例如，可測試構建體或由所述構建體形成的孔操作具體核酸序列的能力。構建體或孔操作核酸的能力通常可如實施例中所述進行測定。
[0114]本發明的一種構建體可形成孔的一部分。或者，構建體可以是分離的、基本上分離的、純化的或基本上純化的。如果構建體完全不含任何其他組分如脂質或其他孔單體，則該構建體是分離的或純化的。如果構建體與不幹擾其預計用途的載體或稀釋劑混合，則該構建體是基本分離的。例如，如果構建體以包含小於10%、小於5%、小於2%或小於1%的其他組分如脂質或其他孔單體的形式存在，則該構建體是基本分離或基本純化的。本發明的一種構建體可以以脂質雙層的形式存在。
[0115]結合
`[0116]所述亞基與所述酶共價結合。所述亞基可在不止一點例如兩點或三點上與所述酶結合。使所述亞基與所述酶在不止一點上結合的方法可用於限制所述酶的可動性。例如，多點結合可用於限制所述酶轉動或離開所述亞基的自由度。
[0117]當所述亞基與所述酶結合時(表達後修飾)，其可以是單體的形式。或者，當所述亞基與酶結合時(寡聚體化後修飾)，其可以是寡聚孔的一部分。
[0118]可使用任何本領域已知的方法使所述亞基與所述酶共價結合。所述亞基和酶可單獨產生，然後結合在一起。所述兩種組分可以以任意構型結合。例如，它們可通過其末端(即氨基末端或羧基末端)胺基酸結合。合適的構型包括但不限於所述酶的氨基末端結合於所述亞基的羧基末端，反之亦然。或者，所述兩種組分可通過它們序列內部的胺基酸結合。例如，所述酶可結合於所述亞基的環區的一個或多個胺基酸。在一個優選實施方案中，所述酶的末端胺基酸結合於一個亞基的環區中的一個或多個胺基酸。末端胺基酸和環區如上文所討論。
[0119]在一個優選實施方案中，所述亞基與所述酶在基因上融合。如果整個構建體由單個多核苷酸序列表達，則亞基與酶在基因上融合。所述亞基和酶的編碼序列可以以任何方式組合以形成編碼所述構建體的單個多核苷酸序列。
[0120]所述亞基和酶可以以任何構型在基因上融合。所述亞基和酶可以通過它們的末端胺基酸在基因上融合。例如，所述酶的氨基末端與所述亞基的羧基末端融合，反之亦然。優選將所述酶的胺基酸序列同框內加入所述亞基的胺基酸序列中。換言之，優選將所述酶插入所述亞基的序列內。在這些實施方案中，所述亞基和酶通常在兩點上結合，即經所述酶的氨基末端胺基酸和羧基末端胺基酸結合。如果將所述酶插入所述亞基的序列內，則優選使所述酶的氨基末端胺基酸與羧基末端胺基酸緊密接近，並且使每端均與所述亞基或其變體序列中的鄰近胺基酸結合。在一個優選實施方案中，將所述酶插入所述亞基的環區中。
[0121]在另一個優選實施方案中，所述亞基與所述酶在化學上融合。如果亞基與酶在化學上結合，例如通過一個接頭分子結合，則這兩部分在化學上融合。
[0122]所述亞基可通過六-組氨酸標籤或N1-NTA短暫地與所述酶結合。還可對所述亞基和酶進行修飾從而使它們短暫地相互結合。
[0123]所述構建體保留有所述亞基的形成孔的能力。所述亞基的形成孔的能力通常由其α-螺旋和β_鏈提供。β_桶狀孔包含由β_鏈構成的桶狀體或通道，而α-螺旋束狀孔包含由α-螺旋構成的桶狀體或通道。α-螺旋和β_鏈通常通過環區連接。為避免影響所述亞基的孔形成能力，優選使所述酶與所述亞基的環區在基因上融合，或插入所述亞基的環區中。下面更詳細地討論具體亞基的環區。
[0124]類似地，所述構建體保留有所述核酸操作所述酶的能力，所述能力通常由其二級結構元件(α-螺旋和β_鏈)和三級結構元件提供。為避免影響所述酶的核酸操作能力，優選使所述酶與所述亞基在基因上融合，或經不影響其二級或三級結構的殘基或區域插入所述亞基中。
[0125]所述亞基可與所述酶直接結合。優選使用一個或多個例如兩個或三個接頭使所述亞基與所述酶結合。可設計一個或多個接頭以限制所述酶的可動性。所述接頭可與所述亞基和/或酶中的一個或多個反應性半胱氨酸殘基、反應性賴氨酸殘基或非天然胺基酸結合。合適的接頭在本領域是公知的。合適的接頭包括但不限於化學交聯劑和肽接頭。優選的接頭是胺基酸序列(即肽接頭)。通常對所述肽接頭的長度、柔性和親水性進行設計使其不擾亂所述亞基和酶的功能。優選的柔性肽接頭為2-20個，例如4、6、8、10或16個絲氨酸和/或甘氨酸的片段。更優選的肽接頭包括(SG)」 (SG)2' (SG)」 (SG)4' (SG)5^P (SG)8，其中S為絲氨酸，G為甘氨酸。優選的剛性肽接頭為2-30個，例如4、6、8、16或24個脯氨酸的片段。更優選剛性接頭包括(P)12,其中P為脯氨酸。
[0126]接頭可先與所述亞基結合再與所述酶結合，先與所述酶結合再與所述亞基結合，或者與所述酶和亞基同時結合。當所述接頭與所述亞基結合時，其可為單體亞基、兩個或多個單體的寡聚體的一部分或完整寡聚孔的一部分。所述接頭優選在任何除去任何未結合接頭的純化步驟之前反應。
[0127]使所述亞基與所述酶結合的一個優選方法是經半胱氨酸連接。這可通過雙官能化學接頭或通過末端具有半胱氨酸殘基的多肽接頭介導。α-HUSEQ ID N0:2)無天然半胱氨酸殘基，因此將半胱氨酸引入到SEQ ID N0:2的序列中可實現所述酶與所述亞基受控制的共價結合。可在多個位置引入半胱氨酸，例如SEQ ID NO: 2的位置K8、T9或N17或在SEQ ID N0:2的羧基末端。可對任何雙官能接頭的長度、反應性、特異性、剛性和溶解度進行設計以確保所述酶相對所述亞基的位置正確並且所述亞基和所述酶的功能均得以保持。合適的接頭包括雙馬來醯亞胺交聯劑，例如1，4-雙(馬來醯亞胺)丁烷(BMB)或雙(馬來醯亞胺)己烷。雙官能交聯劑的一個缺點是需要酶不含其他表面可及的半胱氨酸殘基，因為所述雙官能接頭與這些殘基的結合不可控制並可影響底物結合或活性。如果所述酶含有幾個可及的半胱氨酸殘基，那麼可能需要對所述酶進行修飾以除去這些殘基同時確保所述修飾不影響所述酶的摺疊或活性。在一個優選實施方案中，與所述酶在基因上結合的肽接頭上存在一個反應性半胱氨酸。這意味著不需要其他修飾來從所述酶除去其他可及的半胱氨酸殘基。半胱氨酸殘基的反應性可通過修飾例如在肽接頭上的鄰近殘基進行增強。例如，側翼精氨酸、組氨酸或賴氨酸殘基的鹼性基團會將半胱氨酸硫醇基團的PKa改變為更大反應性的S_基團的pKa。半胱氨酸殘基的反應性可被巰基保護基團例如dTNB所保護。這些保護基團可在接頭結合之前與所述酶或亞基的作為單體或寡聚體的一部分的一個或多個半胱氨酸殘基反應。
[0128]亞基或酶與它們自身的交聯可通過保持接頭的濃度遠過量於所述亞基和/或酶而防止。或者，可使用「鎖匙」配置，其中使用了兩種接頭。每種接頭只有一端可一起反應以形成更長的接頭並且接頭的另一端各自與所述構建體(即亞基或單體)的不同部分反應。
[0129]選擇共價結合的位點以使得:當所述構建體用於形成孔時，所述酶操作靶核酸序列的方式使得靶序列中一部分核苷酸與所述孔相互作用。然後基於核苷酸在相互反應過程中影響流過所述孔的電流的不同方式來識別核苷酸。
[0130] 存在多種使用孔來測序核酸分子的方式。一種方式涉及使用核酸外切酶例如脫氧核糖核酸酶。在此方法中，所述核酸外切酶用於使核苷酸從靶核酸鏈上序貫分離。然後按核苷酸脫離的順序通過孔檢測並辨別所述核苷酸，從而讀出原始鏈的序列。對於這一實施方案，優選使所述核酸外切酶與所述亞基結合從而使從靶核酸上脫離的一部分核苷酸能夠進入一種包含所述構建體的孔的桶狀體或通道並與其相互作用。優選使所述核酸外切酶與所述亞基在這樣的位置結合，即與所述亞基中的某一部分緊密接近的位點，所述部分形成所述孔的桶狀體或通道的開口。更優選地，所述核酸外切酶與所述亞基的結合使所述核酸外切酶的核苷酸離去軌線位點朝向所述亞基中的某一部分，所述部分形成所述孔的開口部分。
[0131]測序核酸的另一種方式涉及使用將所述靶核酸鏈推過或拉過所述孔的酶。在此方法中，離子電流隨著靶鏈中的核苷酸通過所述孔而波動。所述電流波動指示該鏈的序列。對於這一實施方案，優選地，所述酶與所述亞基的結合使所述酶能夠將所述靶核酸推過或拉過包含所述構建體的孔的桶狀體或通道，並且不幹擾通過所述孔的離子電流的流動。優選使所述酶與所述亞基在這樣的位點上結合，即與所述亞基中的某一部分緊密接近的位點上，所述部分形成所述孔的桶狀體或通道的開口部分。更優選地，所述酶與所述亞基的結合使所述酶的活性位點朝向所述亞基中的某一部分，所述部分形成所述孔的開口部分。
[0132]第三種測序核酸鏈的方法是檢測與孔檢測器緊密接近的聚合酶的副產物(b1-product)。在此方法中，對核苷磷酸(核苷酸)進行標記從而使磷酸標記物質在將聚合酶加至核苷酸鏈後釋放，並且通過所述孔檢測所述磷酸標記物質。所述磷酸物質含有對每種核苷酸特異的標記物。隨著將核苷酸序貫加至所述核酸鏈，加入鹼基的副產物被檢測。所述磷酸標記物質被檢測的順序可用於確定所述核酸鏈的序列。
[0133]優選使所述酶與所述亞基的某一部分結合，所述部分形成包含所述構建體的孔的順面(cis side)部分。在電生理學中，所述順面為接地面。如果溶血素孔被正確插入電生理學裝置中，那麼帽區(Cap region)在所述順面上。公知的是，在正電勢下，核苷酸會從用於隨機傳感的孔的順面遷移向反面(trans side)。將所述酶置於孔的順面使得所述酶對靶核酸的操作可將所述序列中的一部分核苷酸進入所述孔的桶狀體或通道並與其相互作用。優選地，所述序列中至少20%、至少40%、至少50%、至少80%或至少90%的核苷酸進入所述孔的桶狀體或通道並與其相互作用。
[0134]優選地，選擇共價結合的位點和方法以使得所述酶的可動性受限。這可幫助確保所述酶以這樣的方式操作所述靶核酸序列，即所述方式可以使所述靶序列中的一部分核苷酸與所述孔相互作用。例如，限制酶移動的能力意味著所述酶的活性位點可永遠朝向所述亞基的某一部分，所述部分形成所述孔的桶狀體或通道的開口部分。所述酶的可動性可通過增加所述酶與所述亞基結合的點的數量和/或使用具體的接頭而限制。
[0135]亞基
[0136]本發明的構建體包含跨膜蛋白孔的一個亞基。跨膜蛋白孔是一個多肽或一系列多肽，所述多肽允許由外加電勢驅動的離子從膜的一面流過。優選地，所述孔允許核苷酸沿外加電勢從膜的一面流至另一面。優選地，所述孔可將核酸例如DNA或RNA推過或拉過所述孔。
[0137]所述亞基是孔的一部分。所述孔可為單體或寡聚體。優選地，所述亞基可構成由幾個重複亞基例如6、7或8個亞基構成的孔的一部分。更優選地，所述亞基可構成七聚體孔的一部分。所述亞基通常可構成其中可流過所述離子的桶狀體或通道的一部分。所述孔的亞基通常環繞一個中心軸，並促進鏈進入β桶狀體或通道或又跨者膜α-螺旋束狀體或通道。當作為本發明構建體的一部分時，所述亞基可為單體或寡聚體孔的一部分。
[0138]所述亞基通常構成孔的一部分，所述孔的桶狀體或通道包含有助於與核苷酸或核酸相互作用的胺基酸。優選地，這些胺基酸的位置靠近所述桶狀體或通道的收縮區處。所述亞基通常包含一個或多個帶正電的胺基酸，例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸。這些胺基酸通常通過與核苷酸或核酸中的磷酸基團相互作用或者通過與核苷酸或核酸中的鹼基的η-陽離子相互作用而有助於所述孔與核苷酸或核酸之間的相互作用。銜接體可有助於所述核苷酸檢測。
[0139]適合用於本發明的亞基可源於β -桶狀孔或α -螺旋束狀孔。β -桶狀孔包含由β -鏈構成的桶狀體或通道。合適的β -桶狀孔包括但不限於:β -毒素例如α-溶血素和殺白細胞素，細菌的外膜蛋白/孔蛋白例如外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷酸酯酶A和奈瑟球菌屬(Neisseria)自轉運脂蛋白(NalP)。α-螺旋束狀孔包含由α-螺旋構成的桶狀體或通道。合適的α-螺旋束狀孔包括但不限於:內膜蛋白和α外膜蛋白例如WZA。
[0140]優選地，所述亞基源於α -溶血素(a -HL)。野生型a -HL孔由7個相同的單體或亞基構成(即，其是七聚體)。α-溶血素的一個野生型單體或亞基的序列示於SEQ ID Ν0:2。本發明構建體中的亞基優選地包含SEQ ID Ν0:2中所示的序列或其變體。SEQ ID NO:2的胺基酸 1、7-21、31-34、45-51、63-66、72、92-97、104-111、124-136、149-153、160-164、173-206、210-213、217、218、223-228、236-242、262-265、272-274、287-290 和 294 構成環區。優選地，所述酶與SEQ ID Ν0:2的胺基酸8、9、17、18、19、44、45、50和51中的一個或多個結合。更優選地，所述酶插入SEQ ID NO:2的胺基酸18與19、44與45或者50與51之間。
[0141]SEQ ID NO:2的變體是具有從SEQ ID NO:2變化而來但保留有其孔形成能力的胺基酸序列的亞基。所述變體形成孔的能力可如上文所述進行測定。所述變體可包括有助於與所述核酸操作酶共價結合或與其相互作用的修改。優選地，所述變體包含有助於與所述酶結合的一個或多個反應性半胱氨酸殘基。例如，所述變體可在SEQ ID勵:2的8、9、17、18、19、44、45、50和51位中的一個或多個和/或氨基或羧基末端上包括半胱氨酸殘基。優選的變體包含對SEQ ID N0:2的位置8、9或17上的殘基的半胱氨酸置換(K8C、T9C或N17C)。
[0142]可修飾所述變體以有助於所述酶的基因融合。例如，可修飾例如缺失鄰近插入位點的一個或多個殘基以有助於所述酶和/或接頭的插入。如果將所述酶插入SEQ ID NO:2的環2中，那麼可缺失SEQ ID N0:2的殘基D45、K46、N47、H48、N49和K50中的一個或多個。含有所述缺失的一個優選構建體包含SEQ ID NO:26中所示的序列或其變體。
[0143]所述變體還可包括有助於與核苷酸的任何相互作用或有助於下文討論的分子銜接體的取向的修飾。所述變體還可含有有助於分子銜接體的共價結合的修飾。
[0144]所述亞基可以是要求美國專利申請61/078，687的優先權並與本申請同時提交的共同待決的國際專利申請[J A Kemp&Co Ref: N.104403A; Oxford Nanolabs Ref: ONLIP004]中記載的SEQ ID NO:2的變體中的任一種。該申請的所有教導均可同等地適用於本申請。具體地，所述變體 優選地在SEQ ID NO:2的139位上具有穀氨醯胺。所述變體優選地在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸。所述變體優選地在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。在所述共同待決申請的SEQ ID N0:4、6、8、10、12和14中所示的SEQ ID N0:2變體中的任一種均可用於形成本發明的構建體。
[0145]所述亞基可以是由生物體例如葡萄球菌屬(Staphylococcus)細菌表達的天然變體。變體還可包括通過重組技術產生的非天然變體。在SEQ ID NO:2的整個胺基酸序列長度上，基於胺基酸同一性，變體優選與該序列至少50%同源。在SEQ ID N0:2的胺基酸序列的整個序列上，基於胺基酸同一性，所述亞基多肽更優選地可以與該序列至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%並且更優選地至少95%、97%或99%同源。在200或更多個例如230、250、270或280或更多個連續胺基酸的片段上存在至少80%例如至少85%、90%或95%的胺基酸同一性(「硬同源性」)。
[0146]除上面討論的以外，還可對SEQ ID NO: 2的胺基酸序列進行胺基酸置換，例如最多多至1、2、3、4、5、10、20或30個置換。保守性置換可例如根據下表1進行。
[0147]表1.保守性置換
[0148]第二列同一格中的胺基酸，優選第三列同一行中的胺基酸可相互置換。
[0149]
【權利要求】
1.一種用於檢測核苷酸向核酸鏈的添加的方法，包括 (a)在存在孔的情況下，使所述核酸鏈與(i)聚合酶和(ii)經標記的核苷酸接觸，從而使得當核苷酸添加至所述核酸鏈時，磷酸標記物質依次釋放，其中所述磷酸物質含有對每種核苷酸特異的標記物；和 (b)使用所述孔檢測所述磷酸標記物質，並從而檢測所述核苷酸向所述核酸鏈的添加。
2.權利要求1所述的方法，其中所述孔結合至所述聚合酶。
3.權利要求2所述的方法，其中所述孔共價結合至所述聚合酶。
4.權利要求2所述的方法，其中所述孔在緊密接近所述孔的桶狀體或通道的開口的位點處結合至所述聚合酶，並且/或者其中所述聚合酶結合至所述孔從而使得所述酶的活性位點朝向所述孔的開口。
5.權利要求1所述的方法，其中所述磷酸標記物質是通過以下方式檢測:使所述物質與所述孔接觸從而使得所述物質依次與所述孔反應，並且測量每次反應期間通過所述孔的電流。
6.權利要求1所述的方法，其中所述方法用於測序所述核酸鏈，並且所述方法還包括(C)使用所述核酸標記物質的順序來確定所述核酸鏈的序列。
7.權利要求1所述的方法，其中所述孔來源自α-溶血素。
8.權利要求7所述的方法，其中所述孔包括七個亞基，基於胺基酸同一性，每個亞基與SEQ ID NO:2在其整個序列上具有至少55%的同源性。
9.權利要求8所述的方法，其中至少一個亞基在SEQID NO:2的139位上具有穀氨醯胺，在SEQ ID NO:2的113位 上具有精氨酸或者在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。
10.權利要求9所述的方法，其中(a)全部7個亞基均在SEQID NO:2的139位上具有穀氨醯胺並且所述亞基之一在135位上具有半胱氨酸，並且/或者(b)全部7個亞基均在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸。
11.權利要求1所述的方法，其中所述孔包括有利於所述孔與所述標記物質之間的相互作用的分子銜接體。
12.權利要求11所述的方法，其中所述分子銜接體為環糊精或其衍生物，七-6-氨基-β-環糊精(am7-13⑶)、6_單脫氧-6-單氨基-β-環糊精(amfi?⑶)或七_(6_脫氧_6_狐基)-環糊精(gu7- β CD)。
13.權利要求1所述的方法，其中所述聚合酶為(a)酶分類(EC)組2.7.7.6,2.7.7.7、2.7.7.19,2.7.7.48和2.7.7.49的任一組的成員，或(b)依賴DNA的DNA聚合酶、依賴RNA的DNA聚合酶、依賴DNA的RNA聚合酶或依賴RNA的RNA聚合酶。
14.權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸用螢光分子、放射性同位素、酶、抗體、抗原、多核苷酸或配體標記。
15.一種用於檢測核苷酸向核酸鏈的添加的試劑盒，包括孔、聚合酶和經標記的核苷酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695530SQ201310435243
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2009年7月6日 優先權日:2008年7月7日
【發明者】L·賈婭辛格, H·貝利, S·切裡, B·麥基翁, J·懷特, J·克拉克 申請人:牛津納米孔技術有限公司