一種耐高溫脂肪酶及其編碼產物的製作方法

2023-04-28 12:17:01

一種耐高溫脂肪酶及其編碼產物的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種耐高溫脂肪酶，所述耐高溫脂肪酶核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述耐高溫脂肪酶的胺基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明還公開了所述耐高溫脂肪酶的製備方法以及含有所述耐高溫脂肪酶基因的重組質粒及耐高溫重組脂肪酶及其製備方法。本發明基因表達的產物具有較高的催化活性，具有良好的耐高溫及熱穩定性特性，具有較大的工業化生產和應用潛力。
【專利說明】一種耐高溫脂肪酶及其編碼產物
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，涉及一種利用宏基因組文庫篩選的方法從紅樹林土壤微生物中獲得一種耐高溫脂肪酶及其編碼產物。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類能催化長鏈脂肪酸酯水解、合成和酯交換的酶類，具有廣泛的底物特異性、高度的位置選擇性和異構體選擇性等特點，應用前景廣泛。在食品行業應用於食用油脂的轉化、乳製品工業以及食品添加劑工業中；醫藥行業用於手性藥物的合成和旋光異構體的拆分中；生物能源行業用其催化動物油脂、植物油等與甲醇或乙醇進行酯交換反應，進而得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯等生物燃料；洗滌業和紡織工業也廣泛使用脂肪酶。深入開展脂肪酶的研究具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。
[0003]上述各種工業應用均要求脂肪酶在不同反應條件下與不同的底物作用，如製漿需要脂肪酶在高鹽鹼和高溫的環境下作用，然而目前所研究的脂肪酶的酶學性質在應用方面仍然存在缺陷，限制了脂肪酶的廣泛應用。因此，如何從環境中獲得具有優良特性的脂肪酶，並研究其 結構與功能之間的關係，是當前在脂肪酶研究中面臨的一項重要任務。
[0004]自然界中存在的微生物99%是不可培養的，因此從用傳統的培養技術分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免陪養技術-宏基因組技術(Metagenomics),直接從環境中提取DNA,將其克隆到不同的載體中，構建宏基因組文庫，再從中進行篩選。該技術在挖掘和利用未培養微生物資源和篩選新穎生物活性物質方面表現出巨大的潛力，已成為當前國際上微生物學研究的前沿領域和熱點。至今國內外學者已經通過該技術克隆到如澱粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學特性及工業應用潛力。因此該方法為發現脂肪酶新基因提供了新思路。

【發明內容】

[0005]本發明的第一個目的在於提供一種耐高溫、高穩定性的耐高溫脂肪酶。
[0006]本發明的第二個目的在於提供上述耐高溫脂肪酶的宏基因組學克隆方法。
[0007]本發明的第三個目的在於提供一種耐高溫重組脂肪酶基因的重組質粒pET32a-lip906o
[0008]本發明的第四個目的在於提供一含有上述耐高溫脂肪酶DNA的表達載體。
[0009]發明的第五個目的在於提供一種耐高溫重組脂肪酶及其製備方法。
[0010]本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的:一種耐高溫脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名為lip906，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本發明提供的上述新型脂肪酶，它的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的:一種耐高溫脂肪酶，其核苷酸全長序列(命名為lip906)如下(SEQ ID N0.1)如下:
[0013]
【權利要求】
1.一種耐高溫脂肪酶，其特徵在於:其核苷酸序列如下:
2.一種根據權利要求1所述耐高溫脂肪酶的宏基因組學克隆方法，其特徵在於:其步驟包括:提取紅樹林植物根泥土壤樣品的總DNA，並將得到的總DNA純化；將純化後的總DNA經Bam HI內切酶酶切，連接至載體pUCl 18/Bam HI，電擊轉化至大腸桿菌DH5 α超級感受態建立宏基因組文庫，通過點在以三丁酸甘油酯為篩選底物的LB固體平板，篩選有水解圈的單菌落得到陽性克隆子。
3.一種根據權利要求1所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質粒，其特徵在於:是根據脂肪酶基因lip906的序列設計引物，以提取的質粒pUC118-lip906為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳並回第一收產物，凝膠回收的第一產物經限制性內切酶EcoR1、HindIII雙酶切並第二回收產物，質粒pET32a經EcoR1、HindIII雙酶切後與第二回收產物連接，獲得連接產物，為重組質粒pET32a-lip906 ;其中，所述序列設計引物序列如下: Iip906~F:5 ? CCGGAATTC ATGACAACAC CAGCAGCTAC CATCGAA GG3』；Iip906-R:5』 CCCAAGCTT TCAGGGGCAAACACCGGTGGG3』。
4.一種含有權利要求1所述耐高溫脂肪酶DNA的表達載體，其特徵在於:構建方法包括:採用電轉法，將上述耐高溫脂肪酶基因的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養並稀釋塗布於氨苄青黴素抗性培養板上培養，挑取陽性轉化子。
5.一種重組脂肪酶，其特徵在於:是用權利要求4所述含有耐高溫脂肪酶DNA的表達載體轉化宿主菌細胞，培養轉化體，從培養物中獲得的。
6.根據權利要求5所述一種重組脂肪酶，其特徵在於:所述宿主菌是大腸桿菌BL21。
7.根據權利要求5或者6所述一種重組脂肪酶的製備方法，其特徵在於:其包括的步驟如下:用所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質粒轉化的大腸桿菌塗布於含氨苄青黴素抗性的平板上，培養過夜，挑取單克隆接種於LB液體培養基，振蕩培養過夜，轉接至新鮮的含氨苄青黴素抗性LB培養基，培養至OD6tltl=0.8，加入IPTG誘導培養；培養後經鎳柱親和層析純化。
8.根據權利要求7所述一種重組脂肪酶的製備方法，其特徵在於:其包括的步驟如下:用所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質粒轉化的大腸桿菌塗布於含氨苄青黴素抗性的平板上，37°C倒置培養過夜，挑取單克隆接種於LB液體培養基，37°C、以轉速為180rpm振蕩培養過夜，按體積比1:100的比例轉接至新鮮的含氨苄青黴素抗性LB培養基，於37°C、轉速為180rpm培養至0D_=0.8，加入IPTG誘導培養培養後經鎳柱親和層析純化。
9.根據權利要求8所述一種重組脂肪酶的製備方法，其特徵在於:所述IPTG終濃度為ImM，誘導溫度為30°C。
10.根據權利要求8所述一種重組脂肪酶的製備方法，其特徵在於:所述IPTG終濃度為0.08~0.1mM,誘導溫度為25~37°C。
【文檔編號】C12N15/55GK103834626SQ201310753995
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】李荷, 劉悅 申請人:廣東藥學院