誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法及專用培養基的製作方法

2023-04-28 07:50:16

專利名稱：誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法及專用培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及誘導人胚胎幹細胞分化的方法及其專用培養基，特別是涉及一種體外 誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法及其專用培養基。
背景技術：
由各種原因(病毒、藥物、腫瘤及遺傳性疾病等)引發的終末期肝病嚴重威脅人 類健康。據統計，全國每年僅死於終末期肝衰竭的患者就超過ll萬人。目前，這類 疾病的治療主要依賴於原位肝移植，但是，供體的極度短缺、移植及手術本身相關的 死亡、終生服用免疫抑制劑及其所致的致死性併發症等一系列問題極大地限制了這一 治療手段的廣泛開展。肝細胞移植和生物人工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩 解上述問題，但其來源細胞同樣也面臨著存活期短，難以大量擴增，特別是隨著培養 時間的延長，肝功能逐漸降低等問題，因此，尋求合適的肝細胞來源已屬迫在眉睫。
1998年，人胚胎幹細胞(human embryonic stem cells, hES cells)的成功建系打 開了體外生產可供移植治療的所有類型的人體細胞、組織乃至器官的大門。因此，體 外定向誘導人ES細胞分化為肝臟細胞成為目前研究的熱點。
擬胚體(embryoid body, EB)是ES細胞在體外一定條件下自發形成的類似早期 胚胎的球體結構，其三胚層的形成與分化基本模擬了體內胚胎早期發育中組織細胞分 化的過程，可以作為研究哺乳動物胚胎發育尤其是早期譜系決定、胚層相互誘導等現 象的理想體外模型。
活化素A (activinA)是TGF P家族成員之一，研究發現，在低血清的條件下
它能高效誘導胚胎幹細胞向定型內胚層的分化。
鹼性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,簡稱bFGF或FGF2)是 成纖維細胞生長因子家族的基本成員，在多種細胞(成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌 細胞、神經細胞等)的增殖、遷移、分化和生存中起到重要的支持作用，尤其在啟動 肝芽形成的過程中發揮不可忽視的基礎性作用(Jung J, et al. Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblasts growth factors. Science 1999; 284(5422): 1998-2003)。人bFGF有五個亞型，分別為18、 22、 22.5、 24和34ku，其中18ku為基本亞型，其通過旁分泌和自分泌途徑來促進細胞增殖和遷 移。慢病毒載體(lentiviral vectors)系統具有如下特點病毒不具備自身複製能 力，具有自身滅活機制；宿主範圍廣，人、鼠等多種屬多類型細胞都能被高效感染； 在穩定整合宿主基因組的基礎上增加了高效感染靜止期細胞，高效表達外源蛋白，同 時還能逃避甲基化抑制的特點。

發明內容
本發明的目的是提供用於體外誘導人胚胎幹細胞(human embryonic stem cells, hES cells)定向分化為肝細胞的專用培養基。
為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案用於體外誘導人胚胎幹細胞定 向分化為肝細胞的專用培養基，包括以下4種培養基其中，分化培養基I (擬胚體 分化培養基)是在DF-12培養基的基礎上添加了 15-25% (體積百分濃度，V/V)血 清替代物，0. 05-0. 15mM p-巰基乙醇和0. 5-1. 5mM穀氨醯胺，pH 7. 2-7. 6;分化培養 基II (定型內胚層分化培養基)是在DF-12培養基的基礎上添加了 0.5-1.5% (體積 百分濃度，V/V)胎牛血清(FBS) ， 0.05-0. 15raM p-巰基乙醇，0. 5-1. 5mM穀氨醯胺 和lOOng/ mL活化素A (activin A) ， pH 7.2-7.6;分化培養基III (肝細胞誘導條件 培養基)是按體積比l-4: 4-1比例混合的FLSC條件培養液與H叩atoZYME-SFM(可購 自GIBCO公司)，pH 7. 2-7. 6，所述FLSC條件培養液的配方為每lOOmL培養基含HDMEM 培養基45mL， DF-12培養基45mL，胎牛血清lOraL;分化培養基IV (肝細胞誘導分化 培養基)是在分化培養基UI的基礎上添加了 15-25ng/mL肝細胞生長因子(HGF)， 5-15ng/mL制瘤素(0SM)禾P 10—6-10—8M地塞米松(DEX) ， pH 7.2-7,6。
上述用於體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的專用培養基的配方中，分化 培養基I和分化培養基II中P-巰基乙醇的濃度均優選為0. lmM，穀氨醯胺的濃度均優 選為lmM;分化培養基III中FLSC條件培養液與HepatoZYME-SFM的混合比例優選為 1: 1;分化培養基IV中肝細胞生長因子HGF的濃度優選為20ng/mL，制瘤素OSM的濃 度優選為10ng/mL，地塞米松DEX的濃度優選為10—7mM。
所述分化培養基I和分化培養基II中還添加有作為營養物質的0. 5-1. 5% (體積 百分濃度，V/V)非必需胺基酸。
本發明的第二個目的是提供一種體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法。
本發明所提供的體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法，可包括以下步
驟
1)擬胚體(EB)的形成及向定型內胚層的分化將人胚胎幹細胞用分化培養基I
(擬胚體分化培養基)懸浮，再將細胞懸液移入低吸附性細菌培養皿中，在37"C、 5
5% C02下培養l-3天形成擬胚體後，再將擬胚體用分化培養基II (定型內胚層分化培養 基)在相同條件下培養2-4天後分化為定型內胚層細胞；
2)誘導定型內胚層細胞向肝細胞分化將步驟1)分化的定型內胚層細胞接種到 表達鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的人胎肝基質細胞(FLSCs)飼養層上，加入 分化培養基III (肝細胞誘導條件培養基)，在37"、 5% C02下共培養4-6天後，再 更換為分化培養基IV (肝細胞誘導分化培養基)，在相同條件下繼續培養5-20天， 得到肝細胞。
在上述體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法中，為了提供足夠的細 胞數量，所述步驟l)中將人胚胎幹細胞進行分化培養前，還包括對其進行傳代擴增 的步驟，方法為將人胚胎幹細胞接種在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)飼養層上，用培養基V (無血清人胚胎幹細胞培養液)，在37。C、 5%0)2下培養，每天更換培養液，培養至第5-7天細胞呈集落狀匯合生長，然後用 機械法 (Methods for expansion of human embryonic stem cells. Stem Cell, 2005， 23:605-609)分離克隆進行傳代，即按1:4-6的比例接種於新的含MEF 詞養層的培養mi中，在相同條件下進行培養；所述培養基V是在分化培養基I的基 礎上添加了 4ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF) ， pH 7.2-7.6。
步驟l)中擬胚體的形成培養時間優選為2天，由擬胚體分化為定型內胚層細 胞的培養時間優選為3天。
為提高分化效率，步驟2)中將定型內胚層細胞接種到表達鹼性成纖維細胞生 長因子的人胎肝基質細胞(FLSCs)飼養層之前，還包括先對其用體積/體積(V/V)百 分比濃度0. 1-0. 4% (優選為0. 25% )的胰酶消化成單個細胞的步驟。
步驟2)中表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉化有鹼性成纖 維細胞生長因子基因的轉基因人胎肝基質細胞；所述鹼性成纖維細胞生長因子基因 優選為18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子基因。
可按照常規方法將鹼性成纖維細胞生長因子基因轉染人胎肝基質細胞，如通過含 有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載體或利用慢病毒載體系統等將鹼 性成纖維細胞生長因子基因導入人胎肝基質細胞。
所述利用慢病毒載體系統將鹼性成纖維細胞生長因子基因導入人胎肝基質細胞 的方法，可包括以下步驟
A) 將鹼性成纖維細胞生長因子基因導入慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體 中，得到攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒載體；
B) 將攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統
6中的兩種包裝質粒和包膜質粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1. 5-2. 5:2. 3-3. 3的重量份數比 混合後，用脂質體介導法轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子 基因的重組慢病毒；
C)將攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒轉染人胎肝基質細胞， 得到表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。
在上述表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的構建方法中，所述步驟 A)中的鹼性成纖維細胞生長因子基因優選為18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子基 因；慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體為pBPLV，是將pMAl載體(該載體參考文獻 (Amendola M， et <3義 Coordinate dual—gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat
Biotechnol, 2005， 23(1) :108-116))用限制性內切酶屍"I和5W I進行雙酶切(切除 兩個酶切位點之間的基因片段)後與正義鏈為5， -ggctagcatgctctagagcgctg-3，， 反義鏈為3' -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5'的多克隆位點序列連接得 到。)。
步驟B)中的慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒可為pLPl和pLP2 (均可購自 Invitrogen公司)，該包裝質粒主要起到病毒包裝作用，其轉錄表達後形成病毒衣殼 結構蛋白及酶蛋白；包膜質粒可為pLP/VSVG (可購自Invitrogen公司)，該包膜質 粒轉錄表達後形成病毒包膜蛋白；慢病毒包裝細胞可為293-FT細胞(可購自 Irrvitrogen公司)。
用上述方法誘導得到的肝細胞也屬於本發明的保護範圍。
本發明提供了一種利用人胚胎幹細胞高度自我更新和增殖的生物學特性，將其體 外定向誘導分化為肝細胞的方法。該方法是利用專用培養基，第一步先將胚胎幹細胞 形成類似早期胚胎的球體結構一擬胚體並向定型內胚層細胞分化(這是肝臟發育的必 經階段，通過activinA的作用使定型內胚層細胞在這一階段達到高度富集)，第二步 再通過與轉bFGF基因的人胎肝基質細胞(飼養層)共培養，以進一步誘導定型內胚 層細胞向肝細胞分化，從而實現體外定向分化為肝細胞的目的(這裡有兩點因素在起 作用，其一，分泌的bFGF因子促進了向肝細胞的分化；其二，共培養的基質細胞由
於是胎肝來源，因而能夠提供更適於肝細胞發育分化的微環境。此外，在這一階段的 後期，在培養基中又添加了一些常規的促肝細胞成熟的因子HGF、 0SM和DEX。)。本 發明提供的將人胚胎幹細胞高效誘導分化為肝細胞的方法提供了一個肝細胞損傷缺 失後的補充來源，並具有操作簡單、成本低廉和分化效率高等優點，為千細胞移植、 用生物人工肝治療重症肝炎及肝衰竭等疾病奠定了基礎。本發明將在醫學領域發揮重
7要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為人胚胎幹細胞(hES)與經activin A作用3天的擬胚體(EB)
圖2為經activin A作用後的擬胚體表達的胚層標誌基因的半定量RT-PCR檢測
結果
圖3為經activin A作用後的擬胚體表達的胚層標誌蛋白的免疫螢光檢測結果 圖4為FLSCs的流式細胞分析
圖5為穩定表達bFGF的FLSCs與轉空載體的FLSCs (對照)經Co,照射後作為飼
養層
圖6為穩定表達bFGF的FLSCs與轉空載體的FLSCs中bFGF基因的半定量RT-PCR 檢測結果
圖7為穩定表達bFGF的FLSCs與轉空載體的FLSCs中bFGF蛋白的Western檢測
結果
圖8為穩定表達bFGF的FLSCs、轉空載體的FLSCs及它們經C,照射後生長曲線 的檢測
圖9為定型內胚層細胞與FLSCs/bFGF共培養後的細胞形態學觀察結果
圖10為誘導分化末期細胞表達肝細胞特異性的基因的半定量RT-PCR檢測結果
圖11為誘導分化末期細胞表達肝細胞早期標誌AFP與成熟肝細胞特異性標誌ALB
的免疫螢光檢測結果
圖12為ICG攝取、排泌實驗結果
圖13為PAS實驗結果
圖14A和圖14B為白蛋白分泌實驗結果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別均為常規方法，所用引物均由上海英俊合成，所
述百分比濃度均為質量/體積(w/v)百分比濃度或體積/體積(v/v)百分比濃度。
實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達 到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物 材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的同類生物材料都可以按
照實施例中的提示替換使用；在產業實施中，來源於大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物 的各種細胞均為離體的，並包括從細胞庫中取得、或商業購買獲得，還包括按照已有 文獻的介紹製備獲得，以及經可以商業獲取的多種幹細胞用已知方法誘導而來的。實施例1、體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞實施例中使用以下培養基-
分化培養基K擬胚體培養基)在DF-12培養基(Gibco)的基礎上添加20%( 15-25%均可，體積百分濃度，V/V)血清替代物(SR， Gibco)， 0. lmM (0. 05-0. 15mM均可)卩-巰基乙醇(Gibco)和lmM (0.5-1. 5mM均可)穀氨醯胺(Gibco) ， pH 7.2-7.6。為增加營養，該分化培養基I中可再添加0.5-1.5% (體積百分濃度，V/V)的非必需胺基酸(HyClone)。
分化培養基II (定型內胚層分化培養基)是在DF-12培養基的基礎上添加1%(0. 5-1.5%均可，體積百分濃度，V/V)胎牛血清(FBS) ， 0. lmM (0. 05-0. 15raM均可)p-巰基乙醇，lmM (0. 5-1. 5mM均可)穀氨醯胺和100ng/mL活化素A (activin A)，pH 7. 2-7. 6。
分化培養基III (肝細胞誘導條件培養基)按體積比l: 1 (1-4: 4-l比例均可)
混合的FLSC條件培養液與H印atoZYME-SFM(可購自GIBC0公司)，pH 7. 2-7. 6; FLSC條件培養液的配方為每lOOmL培養基含HDMEM培養基45mL， DF-12培養基45mL，胎牛血清lOmL。
分化培養基IV (肝細胞誘導分化培養基)在分化培養基III的基礎上添加20ng/mL(15-25ng/mL均可)肝細胞生長因子(HGF) ， 10ng/mL (5-15ng/mL均可)制瘤素(0SM)和10 7M (10—6-10—、均可)地塞米松(DEX) ， pH 7.2-7.6。
培養基V (無血清人胚胎幹細胞培養液)用於人胚胎千細胞的培養擴增，是在分化培養基I的基礎上再添加4ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF，Chemicon) ， pH7. 2-7. 6。
用本發明的方法體外誘導人胚胎幹細胞(human embryonic stem cells， hEScells)定向分化為肝細胞，具體過程包括以下步驟一、人胚胎幹細胞的傳代擴增
將人胚胎幹細胞(hES，H9，購自WiCell公司)接種在小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonic fibroblast, MEF)飼養層(經Y射線照射滅活有絲分裂活性，然後按3X105個細胞/3.5cm培養皿的密度接種在0. 1%明膠包被的培養皿中，置於37T:培養箱中培養12-24小時，得到用於培養人胚胎幹細胞的飼養層)上，用培養基V (無血清人胚胎幹細胞培養液)，在37'C、 5%0)2的條件下培養，每天更換培養液，培養至第5-7天細胞呈集落狀匯合生長，然後用機械法(Methods for expansion of humanembryonic stem cells. Stem Cell, 2005， 23:605-609)分離克隆進行傳代，即按1:5(1:4-6均可)的比例接種於新的含MEF飼養層的培養皿中，在相同條件下進行培養。型內胚層的分化與驗證
1、 擬胚體的形成及向定型內胚層的分化
人胚胎幹細胞呈集落狀生長，用機械法分離步驟一匯合生長的人胚胎幹細胞，離 心，將細胞沉澱用分化培養基I (擬胚體分化培養基)懸浮，再將細胞懸液移入35mm 的低吸附性細菌培養皿(購自Greiner公司)中，在37。C、 5% 0)2條件下培養2天(1-3 天均可)形成擬胚體後，再將擬胚體用分化培養基II (定型內胚層分化培養基)在低 血清(體積/體積(V/V)百分比濃度為0.5-1.5X)條件下培養3天(2-4天均可)，使 之分化為定型內胚層細胞。在光學顯微鏡下觀察的人胚胎幹細胞(hES)與經activin A作用3天的擬胚體(EB-activin A)如圖l所示。
2、 轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)驗證
用TRIzol(Invitrogen公司)試劑並按照說明書中記載的方法提取步驟1中經 activin A作用3天的擬胚體的總RNA,然後反轉錄其中的mRNA為cDNA，反轉錄體系 為5XAMV反轉錄酶緩衝液(購自Takara公司)4nl， dNTPs(10mM) 2yl，腦Ase inhibitor (購自Takara公司)1 w 1， AMV反轉錄酶(購自Takara公司)0. 5 lU， mRNA2ul，水11.5yl。然後，以反轉錄形成的cDNA為模板，以人胚胎幹細胞(hES) 為陰性對照，分別在引物P1 (上遊引物)5' - ATACGCCAGTGACGACCA -3，和P2 (下 遊引物)5， - CGACTTGCCCAGCATCTT -3'的引導下PCR擴增目的基因S0X17,在引物 P3 (上遊引物)5， - TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA -3'和P4 (下遊引物)5，-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA -3，的引導下PCR擴增目的基因AFP，在引物P5 (上遊 引物)5， - GTACTCCTCGGTCCCTTTCC -3，和P6 (下遊引物)5， - CAAAAACCCTGGCACAAACT -3，的引導下PCR擴增乾性基因0CT-4，在引物P7 (上遊引物)5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG -3，禾P P8 (下遊引物)5， - AAGTGTGACGTTGACATCCG-3，的 引導下PCR擴增參照基因0 -acfi/7， PCR反應體系均為10XPCR緩衝液2u]， dNTPs(2. 5mM) 1.6ul，上、下遊引物各liU，模板lyl, rTaq酶O. 2yl，水14.2 yl。 RT-PCR檢測結果如圖2所示，經分化培養基II (定型內胚層分化培養基)作用 3天後的擬胚體(EB-activin A)中定型內胚層細胞標誌基因5ttW7獲得表達，而作為 陰性對照的人胚胎幹細胞(hES)未檢測出該基因，而且髒壁內胚層標誌基因 達缺失(因為作為陰性對照的hES細胞是最全能的幹細胞(a7W強陽性代表它的全能 乾性，A^和6'ftU7陰性代表它沒有向下分化)，它有可能向定型內胚層分化，也有可 能向髒壁內胚層分化，後者也表達許多與肝細胞相似的基因，但卻不能向前者一樣形 成肝臟等實質器官，AFP陰性能排除向它的分化)，證明用本發明的誘導方法已將人胚 胎幹細胞分化為定型內胚層細胞。
103、免疫螢光(Immunofluorescence)驗證
用免疫螢光(Immunofluorescence)的方法做進一步驗證，方法為先用4%多 聚甲醛固定步驟1中經activin A作用3天的擬胚體半小時，然後用0. 1%的Triton X-100破膜30分鐘，用正常山羊血清封閉，添加一抗， 一抗為S0X17和AFP (購自R&D 公司)，4。C過夜，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，再加入二抗，二抗為FITC標記的 山羊抗小鼠的抗體(購自北京中杉公司)，用PBS洗絡3次，每次5分鐘，用DAPI襯 染細胞核。免疫螢光檢測結果見圖3所示(FITC表示表達綠色螢光(即該標誌陽性) 的細胞，DAPI表示細胞核，Merge表示將前兩張圖合併之後的情況)，經分化培養基 II (定型內胚層分化培養基)作用3天後的擬胚體(EB)中定型內胚層細胞標誌S0X17 獲得表達，而作為陰性對照的人胚胎幹細胞未檢測出該標誌物，而且髒壁內胚層標誌 AFP表達缺失，從而進一步證明用本發明的誘導方法已將人胚胎幹細胞分化為定型內 胚層細胞。
三、穩定表達18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的人胎肝基質細胞 (FLSCs)的獲得、鑑定及其飼養層的建立
以穩定表達18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞為例，說明本 發明利用慢病毒載體系統構建穩定表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞 的方法，具體方法包括以下步驟
1、 骨髓間充質幹細胞(bone mar， mesenchymal stem cells, BMSCs)的分 離、純化及原代、傳代培養
取14周胎齡流產胎兒股骨骨髓，加入DMEM-F12培養液中充分混合，離心棄上 清及脂肪層，加入完全培養基充分混勻後，將骨髓液輕輕疊加到密度1.073g/mL的 Percoll分離液上，900rpm離心30分鐘(室溫下)，取白細胞膜層以上的部分，加 入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養液(預先加入青-鏈黴素100U/mL)中充分混勻， 離心洗滌備用，將分離的細胞按2X107cm2的濃度接種於50mL塑料培養瓶中，置於 37°C， 5%0)2和飽和溼度的孵箱中進行培養，48h後更換培養液，棄掉未貼壁細胞， 以後每2-3天換液一次。細胞長到80%融合時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，細巴 斯德吸管吹打成單細胞懸液後以1X107mL種植於新培養液中，每2-3天換液一次。
以上具體介紹了實驗中獲取骨髓間充質幹細胞的一種方法，不構成對獲取骨髓 間充質幹細胞的限制。實際應用中，胎兒骨髓間充質幹細胞BMSCs可從商業途徑購 買或從細胞庫中獲取，如胎兒來源的骨髓間充質幹細胞可以購自北京裕恆豐科技有 限公司，貨號7500。
2、 18kDa亞型bFGF基因的擴增根據18kDa亞型bFGF基因的核苷酸序列(GenBank號麗一002006)設計RT-PCR 引物，引物序列如下Pl (正向引物):5， -AACTGCAGATGGCAGCCGGGAGCATC-3'(帶 下劃線鹼基為限制性內切酶I識別位點)；
P2 (反向引物)5， -ACGCGTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAA-3'(帶下劃線鹼 基為限制性內切酶&7 I識別位點)
提取步驟1獲得的胎兒骨髓間充質幹細胞的總RNA，反轉錄合成其cDNA並以此為 模板，在引物Pl和P2的引導下PCR擴增18kDa亞型bFGF基因，並在所擴增的bFGF 基因的兩端分別添加上限制性內切酶屍"I和&7 I識別位點，其中退火溫度為54°C。 反應結束後，對PCR擴增產物進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了大小為486bp 的DNA片段，與預期結果相符。回收並純化該目的片段，將其連入T載體pGEM-T (購 自Promega公司)中，對該重組T載休用限制性內切酶I進行酶切鑑定，對酶 切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果經酶切獲得了約500bp的DNA片段，與預 期結果相符，再對該重組T載體進行測序，測序結果表明經PCR擴增獲得了序列正確 的18kDa亞型bFGF基因。該重組T載體用屍W I和5"W I雙酶切，回收並純化獲得的 486bp的DNA片段，將其連入經同樣酶雙酶切的慢病毒載體系統中的目的基因轉移載 體pBPLV (pBPLV是通過將pMAl載體(該載體參考文獻(Amendola M, et a義Coordinate dual-gene tr肌sgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol, 2005， 23(1): 108-116))用限制性內切酶屍"I和5"a〗I進行 雙酶切(切除兩個酶切位點之間的基因片段)後與正義鏈為 5， -ggctagcatgctctagagcgctg-3，，反義鏈為
3， -acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5'的多克隆位點序列連接而得到的新的慢 病毒載體)中，對得到的重組慢病毒載體用限制性內切酶屍"I和I進行酶切鑑定， 對酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果經酶切獲得了約486bp的DNA片段， 與預期結果相符，表明獲得了攜帶有18kDa亞型bFGF基因的重組慢病毒載體，將其 命名為pBPLV-bFGF。 3、慢病毒包裝
培養293-FT (購自Invitrogen公司)慢病毒包裝細胞，培養基為添加10% FBS， 0.1 mmol/L NEAA， 2 ramol/L L-穀氨醯胺，1%青-鏈黴素，500嗎/mL G418的高糖 DMEM培養基(Sigma公司產品，Cat井D5648)。用步驟2構建的攜帶有18kDa亞型bFGF 基因的重組慢病毒載體pBPLV-bFGF以及空載體pBPLV分別和包裝質粒pLPl (購自 Invitrogen公司)、pLP2 (購自Invitrogen公司)及包膜蛋白質粒pLP/VSVG (購自 Invitrogen公司)按5ug: 4. 2ug: 2ug: 2. 8ug的比例混合後加入1. 5mL無血清Opti-MEM*
12I培養基(購自Invitrogen公司)中，輕輕混勻，在另一個無菌的5mL管中將42uL lipofectamine 2000 (購自Invitrogen公司)稀釋於1. 5mL的無血清Opti-ME, I培 養基中，室溫靜置5分鐘，混合以上兩種液體，室溫孵育20分鐘以形成 DNA-lipofectamine 2000複合物。用0.25%胰酶(Gibco公司產品，Cat# 25200-056) 消化收集培養的293-FT細胞，計數約6X106個細胞，將其重懸到5mL不含抗生素的 生長培養基(在高糖DMEM培養基(Sigma公司產品，Cat# D5648)的基礎上添加10 %胎牛血清(FBS) (Biochrom公司產品，cat# S0115) ， 0.1 mmol/L非必需胺基酸 (Non-Essential Amino Ac ids, NEAA)(購自HyClone公司)和2 mmol/L L-穀氨醯 胺)中，再將293-FT包裝細胞懸液與3mL含有DNA-lipofectamine 2000複合物的培 養基混勻後加入到含有5mL不含抗生素的生長培養基的10cm細胞培養皿中，混勻， 放於37。C、 5%0)2孵箱中培養，次日用含有l mmol/L丙酮酸鈉的完全培養基(在高 糖DMEM培養基的基礎上添加10%胎牛血清，0. 1 mmol/L非必需胺基酸，2 mmol/L L-穀氨醯胺，1%青-鏈黴素和l畫ol/L丙酮酸鈉)更換含有DNA-lipofectamine 2000 複合物的培養基進行包裝，並分別在包裝24、 72小時後取樣，對經包裝的293-FT細 胞在螢光顯微鏡下進行觀察，結果包裝24小時後即可見到293-FT細胞內有綠色螢光 蛋白eGFP表達(eGFP基因為慢病毒載體pBPLV攜帶)，表達綠色螢光蛋白eGFP的細 胞超過95%，表明包裝效率很高，且伴隨著包膜質粒pLP/VSVG中VSVG基因的表達， 逐漸出現293-FT細胞的多細胞合胞體，包裝72小時後培養上清為淡黃色，此時收集 病毒液上清於15mL的無菌離心管中，4'C、 3000rpm離心15rain去除細胞碎片，將病 毒上清凍存於-7(TC備用。
4、胎兒肝臟基質細胞的分離、培養及細胞表面標誌檢測
採用從14周胎齡流產胎兒分離的肝臟組織，用生理鹽水灌注血管，將組織中的血 液充分衝出，取體積約為0.5cm3的組織塊，去除筋膜等，用消毒滅菌剪刀將肝臟組織 剪碎成lmm3大小，將其排列於25腿2的培養瓶中，每瓶種20塊組織，然後將其倒置於37 °C、 5%0)2的孵箱中，約0.5小時後將培養瓶翻轉，加入約3mL胎兒肝臟基質細胞培養 基(高糖DMEM培養基和DF-12培養基(Sigma公司產品，Cattt D0547)按l:l體積比混 合後加入體積百分濃度為10%的胎牛血清(Biochrom公司產品，cattt S0115)，放入 孵箱中在相同條件下繼續培養，約2天後可見有細胞從組織塊邊緣爬出，繼續培養至 細胞鋪滿培養瓶底面積的80%時，將細胞用0.25%胰酶消化下來，連同組織塊一起種 入新瓶中，24小時後換液，去除不貼壁的細胞及殘留組織塊，細胞長滿以後進行常規 傳代培養。用0.25%胰酶消化並收集傳代至第15代的胎兒肝臟基質細胞，用PBS洗滌2 次，以去除細胞表面殘留血清蛋白的影響，細胞計數後等分成10管，分別標記待測抗體(PE標記的小鼠抗人CD29、 CD105抗體和FITC標記的小鼠抗人CD34、 CD44、 CM5、 CD71、 CD90抗體均購自BD公司)及相應對照抗體(PE和FITC標記的小鼠IgG抗體均購 自中杉金橋公司)，每管細胞數不少於5X105，室溫避光標記半小時後，用PBS洗滌細 胞2次，以去除殘留抗體，最後用1%多聚甲醛固定細胞，用流式細胞術檢測表面分子 表達情況；AFP，ALB (購自腿D公司)為間接標記，孵育半小時後，以FITC標記的山羊
抗小鼠的二抗(購自中杉金橋公司)標記一小時，再用ras洗滌細胞2次，以去除殘留
抗體，最後用1%多聚甲醛固定細胞，用流式細胞術檢測表面分子表達情況，結果如 圖4所示，由圖4可以看出，胎兒肝臟基質細胞基本不表達造血細胞表面標誌CD45和 CD34;而其它基質細胞表面標誌(CD90， CD71， CD44， CD29, CD105)卻高表達，表明 獲得的胎兒肝臟基質細胞是一群MSC樣細胞。
與胎兒來源的骨髓間充質幹細胞的獲取類似，實際應用中不推薦使用以上實驗方 法來獲取胎兒肝臟基質細胞，而可選用通過商業渠道購買或從細胞庫中獲取的胎兒肝 髒基質細胞。
5、 慢病毒感染人胎肝基質細胞(FLSCs)和感染後重組胎兒肝臟基質細胞的流式 細胞術分選
病毒感染前一天於六孔板中接種人胎肝基質細胞(步驟4所指的胎兒肝臟基質細 胞)，至細胞密度為3乂105細胞/孔，感染時，每孔加入lraL步驟2獲得的病毒上清 和終濃度為8iug/mL的聚凝胺(polybrene，購自Sigma公司)促進病毒的轉染效率，晃 動培養瓶使病毒液能接觸到所有細胞，3小時後加入3mL人胎肝基質細胞培養基(高 糖DMEM培養基和DF-12培養基(Sigma公司產品，Cat# D0547)按1:1體積比混合後 加入體積百分濃度為10%的胎牛血清(Biochrom公司產品，cat#S0115)，再過3h， 更換新的培養基。螢光顯微鏡觀測結果表明慢病毒可高效率的轉染胎兒肝臟基質細 胞，轉染後的細胞通過流式細胞術進行分選，將感染有攜帶bFGF基因的重組慢病毒 載體pBPLV-bFGF和空載體pBPLV的人胎肝基質細胞分別命名為FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV (如圖5所示，a和b分別為光學顯微鏡和螢光顯微鏡下觀察的 FLSCs/bFGF， c和d分別為光學顯微鏡和螢光顯微鏡下觀察的FLSCs/pBPLV)。
6、 RT-PCR方法檢測轉染細胞bFGF基因的表達情況
分別取步驟5中經分選獲得的1 X 106個FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，提取細胞 總RNA後，用RT-PCR方法檢測bFGF基因在mRNA水平的表達情況(所用引物為Pl和 P2)，同時用e-actin基因作為內參(所用正向引物序列為 5， -GATCCACATCTGCTGGAAGG-3，，反向引物序列為
5， -AAGTGTGACGTTGACATCCG-3，)，退火溫度均為54。C。反應結束後，對PCR擴增產
14物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖6所示，FLSCs/bFGF經擴增分別獲得了大 小約為486bp的bFGF基因片段和大小約為222bp的0 -actin基因片段，而陰性對照 僅擴增出了 P-actin基因片段，表明bFGF基因在FLSCs/bFGF中獲得表達。
7、 Western blot方法檢測轉染細胞bFGF的表達水平
分別取步驟5中經分選獲得的1X 106個FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，用放射性 免疫沉澱裂解緩衝液RIPA (50mmol/L Tris HC1 (pH8. 0) ， 150mmol/L NaCl， l鵬ol/L DTT， 0. 5隱ol/LEDTA， 1.0% NP40， 0. 5%去氧膽酸鈉，0. 1%SDS， 100 ii g/mL PMSF， lPg/mL胰蛋白酶肽，2yg/mL亮抑制肽，100 u mol/L正釩酸鈉)裂解細胞，然後對 裂解細胞進行不連續SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再用半乾式電轉的方法 將蛋白質轉移至PVDF膜，接著用5X脫脂奶粉封閉2h，再與相應的一抗(小鼠抗人 bFGF宇-克隆抗體，購自Chemicon公司，Cat # : MAB120)和辣根過氧化物酶(HRP) 標記的羊抗小鼠二抗(購自中杉金橋公司)孵育後，用化學發光試劑(購自SemtaCruz 公司，Cat#:SC-2048)於暗室自顯影，同樣用P -actin蛋白作為內參(一抗為小鼠 抗人e-actin的多克隆抗體，購自Chemicon公司)。檢測結果如圖7所示，FLSCs/bFGF 中的bFGF基因和P -actin基因均可在蛋白水平上獲得表達，而陰性對照FLSCs/pBPLV 僅e-actin基因在蛋白水平上獲得表達。
8、 伺養層細胞的製備及cck-8法繪製生長曲線
取步驟5中獲得的FLSCs/bFGF和FLSCs/pBPLV，以25GY劑量的CcT進行照射， 得到穩定表達18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質飼養層細胞與作為對 照的轉空載體的人胎肝基質飼養層細胞，分支凍存備用。用0.25%胰酶消化步驟4中 獲得的FLSCs/bFGF、 FLSCs/pBPLV和步驟8中獲得的Co，照射後的FLSCs/bFGF、 FLSCs/pBPLV，以每孔104個細胞接種於96孔培養板中，每孔體積200uL，每塊板接 種20孔(每種細胞各5孔)，共6塊板。接種後，將培養板放入37。C、 5%0)2孵箱 中進行培養，待細胞貼壁後取一個培養板，每孔加入cck-8溶液10nL，然後繼續在 孵箱中孵育lh，選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，測3次， 記錄結果，作為第0天數據，以後每隔24小時取出一個培養板，用相同方法進行比 色，最後以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪製生長曲線，如圖8所示，FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV兩組的細胞數量逐漸增長,而經過C,照射後的FLSCs/bFGF和 FLSCs/pBPLV兩組(即y-irradiated FLSCs/bFGF和y- irradiated FLSCs/pBPLV)
的細胞數量不再增長，可作為飼養層細胞。
四、FLSCs/bFGF作為飼養層與定型內胚層細胞共培養(肝細胞的誘導分化)並觀 察促肝系分化的效果1、 肝細胞的誘導分化
將步驟二分化的定型內胚層細胞先用體積/體積(V/V)百分比濃度0. 25%的胰酶 消化成單個細胞，接種到步驟三預先鋪被的表達18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子 的人胎肝基質細胞飼養層FLSCs/bFGF和作為對照的轉空載體(pBPLV)的人胎肝基質 飼養層FLSCs/pBPLV上，加入分化培養基m (肝細胞誘導條件培養基)，在37。C、 5 % C02下共培養5天(4-6天均可)後，再更換為分化培養基IV (肝細胞誘導分化培 養基)，在相同條件下繼續培養6天(5-20天均可)，每2-3天更換培養液，用下述 方法觀察共培養促肝系的定向誘導分化效果。
2、 細胞形態觀察
在光學顯微鏡下觀察定型內胚層細胞細胞分別和表達18kDa亞型鹼性成纖維細胞 生長因子的人胎肝基質細胞伺養層FLSCs/bFGF和作為對照的轉空載體(pBPLV)的人 胎肝基質飼養層FLSCs/pBPLV共培養過程中形態的變化，記錄細胞誘導分化的過程， 並取誘導分化第0、 5、 ll天的細胞，吸棄培養液，用PBS洗滌2遍，在4°0下用3%戊二 醛於培養板原位前固定2小時，再用1%鋨酸後固定1小時，用蔗糖緩衝液反覆漂洗， 用梯度乙醇脫水，加入丙酮後，用樹脂滲透、包埋、聚合，用ULTRACUTE/S型切片機 超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，最後用Philips CM120透射電子顯微鏡觀察細 胞超微結構。
顯微鏡觀察結果如圖9所示(圖中A和B組分別為光學顯微鏡和透射式電子顯微鏡下 觀察所見的結果)，在光學顯微鏡下觀察到，在共培養之初(Oday)，細胞呈圓形， 細胞核大，核仁多個且明顯，隨著時間的推移(5day)，細胞逐漸由圓形變為多角形， 可見雙核細胞，在分化末期細胞體積變大，多數呈現多角形、鋪路石狀的上皮樣細胞。 在透射式電鏡下觀察到，共培養ll天后的細胞其內細胞器相當豐富，可見大量特徵性 的圓形或橢圓形、大小不一、嵴稀的線粒體、分布於光面內質網周圍的簇狀糖原顆粒、 溶酶體等細胞器，有些具有雙核，細胞之間呈現類似膽小管的管腔狀結構，兩端以緊 密連接封閉，腔內伸出許多微絨毛突起，符合肝細胞典型的超微結構。細胞形態觀察 結果表明用本發明的方法(即通過形成擬胚體並將其先預誘導為定型內胚層細胞，再 與轉bFGF基因的人胎肝基質細胞共培養)可將人胚胎幹細胞高效定向誘導分化為肝細 胞。
3、 半定量RT-PCR檢測人胚胎幹細胞誘導前、後相關基因mRNA的表達變化 用與步驟一相同的RT-PCR方法對步驟1經肝系誘導分化的定型內胚層細胞
(ES-h印a),同時以未經誘導分化的人胚胎幹細胞(hES)、步驟二中經activin A作 用3天的擬胚體(EB-actinA)、FLSCs/bFGF飼養層細胞和人胎兒肝細胞(fetal liver)
16為對照，在基因mRNA表達水平進行鑑定，鑑定的基因包括力屍尺MA(引物 P9 (上遊弓I物)5 ， - TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG -3 ，禾口 P10 (下遊弓I物)5 ，-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC -3 ， ) ， C認(弓l物Pll (上遊弓l物)5， _ GAGGCATCCAGAACGAGAAG-3 ，禾口 P12(下遊弓i物)5， - AGCCTCGATCTCTGTCTCCA-3 ， ) ， C7P7氾 (引物P13 (上遊引物):5， - GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3，和P14 (下遊引物):5， -GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT -3，(請提供擴增OP7A 的引物序列))禾B ac"仏
RT-PCR檢測結果如圖IO所示，niRNA水平證實經肝系誘導分化的定型內胚層細胞的 細胞乾性(^T-力逐漸減弱，並開始表達肝細胞特異性基因^^F、力^ 、 076>和6T屍7W， 進一步證明用本發明的方法可將人胚胎幹細胞高效定向誘導分化為肝細胞。
4、 免疫螢光(Immunofluorescence)驗證
用與步驟二相同的免疫螢光檢測方法對步驟1經肝系誘導分化的定型內胚層細 胞中表達的肝細胞早期標誌AFP與成熟肝細胞特異性標誌ALB進行鑑定，所用一抗 分別為AFP和ALB檢測抗體(購自R&D公司)，二抗為TRITC標記的山羊抗小鼠的抗 體(購自北京中杉公司)。檢測結果如圖11所示(TRITC表示表達紅色螢光(即該標 記陽性)的細胞，EGFP表示表達綠色螢光蛋白的FLSCs/bFGF作為飼養層，Merge表 示將前兩張圖片合併後的結果)，用本發明的方法誘導後的人胚胎幹細胞可表達肝細 胞早期標誌AFP與成熟肝細胞特異性標誌ALB，從而從蛋白水平證實用本發明的方法 可將人胚胎幹細胞高效定向誘導分化為肝細胞。
5、 靛青綠(indocyanine green， ICG)的攝取、排泌實驗 取步驟l經肝系誘導分化的定型內胚層細胞及與之共培養的轉bFGF基因的人胎肝
基質細胞(對照)用PBS充分洗滌後，加入lmg/mL ICG (Sigma)於37'C孵育30-60分鐘， 在顯微鏡下觀察細胞顏色的變化；再用PBS衝洗2遍，換回完全培養液(高糖DMEM培養 基和DF-12培養基(Sigma公司產品，Cat# D0547)按l: l體積比混合後加入體積百分 濃度為10%的胎牛血清(Biochrom公司產品，cattt S0115))繼續常規培養，並觀察 細胞顏色的變化。結果如圖12所示(a表示誘導後細胞攝取ICG的情況，b表示螢光顯 微鏡下原位觀察周圍表達綠色螢光的轉bFGF基因的人胎肝基質細胞，c表示兩張圖片 合併之後的情況)，多數誘導後的細胞被染成深綠色，而與之共培養的轉bFGF基因的 人胎肝基質細胞並不能攝取染料變成深綠色；換回完全培養基常規培養l小時之內， 著色細胞的顏色完全退去。上述檢測結果表明誘導後的細胞具有代謝染料的能力。
6、 原染色實驗(高碘酸-雪夫反應(periodic acid-Schiff， PAS)) 用PAS試劑盒(sigma)並參照試劑盒說明書檢測步驟l經肝系誘導分化的定型內
胚層細胞及與之共培養的轉bFGF基因的人胎肝基質細胞(對照)內的糖原，並在顯微
17鏡下觀察結果。鏡檢結果如圖13所示，誘導後細胞呈紫紅色，而周圍與之共培養的轉 bFGF基因的人胎肝基質細胞則呈陰性結果。上述檢測結果表明誘導後的細胞胞漿內富
含糖原顆粒，證明其具有貯存糖原的能力。
7、白蛋白(ALB)分泌實驗
用OLYMPUS AU-600全自動生化分析儀(01y卿us， Tokyo, J即an)檢測取步驟1 經肝系誘導分化的定型內胚層細胞及與之共培養的轉bFGF基因的人胎肝基質細胞培 養上清中ALB的分泌量。結果如圖14A所示(橫坐標為ALB的分泌量，縱坐標為分 化天數)，表示培養上清中ALB分泌量隨分化天數的變化情況；圖14B表示不同組間 ALB分泌量的比較(其中1和2分別代表單獨培養的hES細胞和FLSC/bFGF， 3和4 分別代表定型內胚層細胞分別與FLSC/bFGF和FLSCs/pBPLV詞養層細胞共培養，5 代表陽性對照(人胎肝基質細胞)，*表示差異顯著)，顯示隨誘導時間的延長ALB分 泌量逐漸增加，而且與FLSCs/bFGF共培養的分化細胞的ALB分泌量顯著高於與 FLSCs/pBPLV共培養的細胞，證明bFGF的確在促肝系分化中具有重要作用。
18
權利要求
1、用於體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的培養基，包括依次使用的以下四種培養基其中，分化培養基I即擬胚體分化培養基是在DF-12培養基的基礎上添加了15-25％血清替代物，0.05-0.15mM β-巰基乙醇和0.5-1.5mM穀氨醯胺，pH7.2-7.6；分化培養基II即定型內胚層分化培養基是在DF-12培養基的基礎上添加了0.5-1.5％胎牛血清，0.05-0.15mM β-巰基乙醇，0.5-1.5mM穀氨醯胺，和100ng/mL活化素A，pH7.2-7.6；分化培養基III即肝細胞誘導條件培養基是按體積比1-4∶4-1比例混合的FLSC條件培養液與HepatoZYME-SFM，pH7.2-7.6，所述FLSC條件培養液的配方為每100mL培養基含HDMEM培養基45mL，DF-12培養基45mL，胎牛血清10mL；分化培養基IV即肝細胞誘導分化培養基是在分化培養基III的基礎上添加了15-25ng/mL肝細胞生長因子HGF，5-15ng/mL制瘤素OSM和10-6-10-8M地塞米松DEX，pH7.2-7.6。
2、 根據權利要求1所述的培養基，其特徵在於所述分化培養基I和分化培養 基II中p-巰基乙醇的濃度為0. lmM，穀氨醯胺的濃度為lmM;所述分化培養基III中FLSC 條件培養液與H印atoZYME-SFM按1: 1比例混合；所述分化培養基IV中添加了 20ng/mL 肝細胞生長因子HGF， 10ng/mL制瘤素0SM和10—7mM地塞米松DEX。
3、 根據權利要求1或2所述的培養基，所述分化培養基I和分化培養基II中。
4、 體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法，包括以下步驟1) 將人胚胎幹細胞用權利要求1或2或3所述的分化培養基I懸浮，再將細胞懸液 移入低吸附性細菌培養皿中，在37"C、 5% C02下培養l-3天形成擬胚體後，再將擬胚 體用權利要求1或2或3所述的分化培養基II在相同條件下培養2-4天後分化為定型內 胚層細胞；2) 將步驟1)分化的定型內胚層細胞接種到表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎 肝基質細胞飼養層上，加入權利要求l或2所述的分化培養基m，在37"C、 5% C02 下共培養4-6天後，再更換為權利要求1或2所述的分化培養基IV，在相同條件下繼 續培養5-20天，得到肝細胞。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述步驟l)中將人胚胎幹細胞 進行分化培養前，還包括對其進行傳代擴增的步驟，方法為將人胚胎幹細胞接種 在小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，用培養基V，在37'C、 5%0)2下培養，每天更換培養液，培養至第5-7天細胞呈集落狀匯合生長，然後用機械法分離克隆進行傳代， 即按1:4-6的比例接種於新的含MEF飼養層的培養皿中，在相同條件下進行培養； 所述培養基V是在分化培養基I的基礎上添加了 4ng/mL鹼性成纖維細胞生長因子 (bFGF) ， pH 7.2—7.6。
6、 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於步驟l)中擬胚體的形成培 養時間為2天，由擬胚體分化為定型內胚層細胞的培養時間為3天；步驟2)中將定 型內胚層細胞接種到表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞詞養層之前， 還包括先對其用體積/體積百分比濃度0. 1-0. 4%的胰酶消化成單個細胞的步驟。
7、 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於步驟2)中表達鹼性成纖維 細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉化有鹼性成纖維細胞生長因子基因的轉基因人 胎肝基質細胞；所述鹼性成纖維細胞生長因子基因優選為18kDa亞型鹼性成纖維細 胞生長因子基因。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於利用慢病毒載體系統將鹼性成纖 維細胞生長因子基因導入人胎肝基質細胞的方法，包括以下步驟A) 將鹼性成纖維細胞生長因子基因導入慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體 中，得到攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒載體；B) 將攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統 中的兩種包裝質粒和包膜質粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1. 5-2. 5:2. 3-3. 3的重量份數比 混合後，用脂質體介導法轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子 基因的重組慢病毒；C) 將攜帶有鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組慢病毒轉染人胎肝基質細胞， 得到表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述步驟A)中的鹼性成纖維細胞 生長因子基因為18kDa亞型鹼性成纖維細胞生長因子基因；慢病毒載體系統中的目的 基因轉移載體為pBPLV;步驟B)中的慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒為pLPl和pLP2; 包膜質粒為pLP/VSVG;慢病毒包裝細胞為293-FT細胞。
10、 用權利要求4-8任一項所述方法誘導得到的肝細胞。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導人胚胎幹細胞定向分化為肝細胞的方法及其專用培養基。該體外誘導方法包括以下步驟1)將人胚胎幹細胞用分化培養基I懸浮，再將細胞懸液移入低吸附性細菌培養皿中，在37℃、5％CO2下培養1-3天形成擬胚體後，再將擬胚體用分化培養基II在相同條件下培養2-4天後分化為定型內胚層細胞；2)將步驟1)分化的定型內胚層細胞接種到表達鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞飼養層上，加入分化培養基III，在37℃、5％CO2下共培養4-6天後，再更換為分化培養基IV，在相同條件下繼續培養5-20天，得到肝細胞。本發明具有操作簡單、成本低廉和分化效率高等優點，將在醫學領域發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N5/08GK101497872SQ200810057539
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月2日 優先權日2008年2月2日
發明者習佳飛, 雪 南, 文 嶽, 楊印祥, 王韞芳, 白宗良, 白慈賢, 裴海雲, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所