一種用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的製作方法

2023-04-28 06:06:01 2

本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒。
背景技術：
：血管生成(Angiogenesis)是指源於已存在的毛細血管和毛細血管後微靜脈的新的毛細血管性血管的生長。腫瘤血管生成是一個極其複雜的過程，一般包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。由於腫瘤組織這種新生血管結構及功能異常，且血管基質不完善，這種微血管容易發生滲漏，因此腫瘤細胞不需經過複雜的侵襲過程而直接穿透到血管內進入血流並在遠隔部位形成轉移。越來越多的研究表明，良性腫瘤血管生成稀少，血管生長緩慢；而大多數惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發展轉移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發展和擴散轉移。血管生成機制複雜，參與並促進血管生成的因子也眾多，VEGF在血管發生和形成過程中起著中樞性的調控作用，是關鍵的血管形成刺激因子。它是針對內皮細胞特異性最高，促血管生長作用最強的有絲分裂原。TNF-α是一類具有血管活性的細胞因子，可誘導異位子宮內膜炎性細胞因子MCP-1、IL-6和IL-8等的釋放，促進異位內膜及基質細胞增殖及炎性細胞浸潤，新生血管形成，組織粘連，從而形成異位病灶。基質金屬蛋白酶(MMP)通過降解基底膜糖蛋白及細胞外基質成分，啟動了內皮細胞的激活和遷移，整合素家族通過和不同配基結合，介導血管內皮細胞的遷移和黏附，有助於新生血管的成熟和穩定，細胞黏附因子(ICAM-1)可產生免疫抑制和降低自然殺傷細胞的殺細胞毒性，有助於異位組織逃避機體免疫系統和自然殺傷細胞的的殺傷，促進異位組織侵入後的血管生成。轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、乙醯肝素酶、血管生成素(angs)、骨生成素(OPN)、環氧化酶(COX－2)、缺氧誘導因子-1、層粘連蛋白(LN)、胎盤生長因子 (PLGF)、Survivin、促紅細胞生成素(Epo)均參與了EMT血管形成過程。VEGF在血管發生和形成過程中起著中樞性的調控作用，是關鍵的血管形成刺激因子。目前常用的血管生成因子檢測方法主要包括：酶聯免疫吸附法(ELISA)，流式細胞儀(Flow-Cytometry)等。其中，酶聯免疫吸附法是最普遍的方法，具靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優點，但一次試驗只能檢測單一指標，通量低、成本高，在具有多指標特性的血管生成因子檢測中，該方法存在明顯的不足。流式細胞儀能在細胞水平上檢測血管生成分子的水平，但卻存在低靈敏、低通量、高成本等缺點。技術實現要素：針對現有技術的操作繁瑣、檢測指標單一、靈敏度低等不足，本發明的目的在於提供一種用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒，該試劑盒能夠通過一次實驗而檢測20種血管生成因子，具有高通量、高靈敏度、高特異性和低成本、標本用量少的特點，能在普通實驗室推廣和規模化等優點。本發明所述的一種用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒，包括：由用於點樣的標準載玻片、用於防止漏液的軟質矽膠墊、劃分為若干個小格的硬質框架、U形框夾形成的反應槽，所述U形框夾從兩側將由下至上放置的尺寸對應的所述硬質框架、所述軟質矽膠墊和所述標準載玻片夾緊在一起，以致所述標準載玻片貼緊封閉所述硬質框架的底部，使所述硬質框架上的每個小格形成一個小的反應槽，各個小的反應槽裡的標準玻片結合有相應濃度的抗血管生成因子的特異性抗體；所述硬質框架劃分為1×4或者2×8個小孔，形成4或16孔框架。根據本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的進一步特徵，所述特異性抗體為針對選自如下20種血管生成因子的抗體：ANG、EGF、ENA-78、bFGF、GRO、IFN-γ、IGF1、IL6、IL8、Leptin、MCP1、PDGF-BB、PIGF、RANTES、TGF-β1、TIMP1、TIMP2、THPO、VEGF、VEGF-D。根據本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的進一步特徵，所述的特異性抗體是通過全自動點樣儀完成點樣操作，將特異性抗體固定於玻片的方法包括：1)特異性抗體與含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸鹽緩衝液混合形成抗體混合物；2)於抗體混合物中將每個抗體含量以0.01至2ng固定於所述點樣孔，每個抗體設置2至4個重複孔；3)抗體晶片點陣排布於玻片，玻片每平方釐米點10至100個特異性抗體。各特異性抗體的排布可以按照實驗設計需要進行調整，根據不同的抗體晶片排布陣列，通過控制全自動點樣儀，製備出所需要的中間產品。根據本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的進一步特徵，所述玻片上還有陽性對照孔，點樣對應特異性抗體的具有相應濃度的生物素化IgG抗體，每個反應的生物素化的IgG抗體的濃度一致；根據本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的進一步特徵，所述玻片上還有陰性對照孔，點樣具有相應濃度的生物素化的無關抗體，每個反應的生物素化的無關抗體的濃度一致。根據本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的進一步特徵，所述樣本處理液為包含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩衝液，用於裂解細胞沉澱物，可處理血漿、血清、尿液、咽拭子、細胞培養物、組織等樣本。本發明還提供了根據本發明所述的抗體晶片試劑盒用於檢測人受體酪受酸激酶的磷酸化抗體的方法，其特徵在於：通過改良的夾心酶聯免疫吸附法測定RTK磷酸化蛋白，所述的特異性抗體與樣品中的目標抗原結合，經過篩選的檢測抗體與目標抗原的另一區域結合形成穩定的化合物；結果判定根據以下計算方式：X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)，減去背景信嗓值後，其中P1表示陽性對照在參考組中的信號強度，P(y)表示陽性對照在反應組中的信號強度，X(y)表示樣本在反應組中的信號強度,表示樣本在反應組中的檢測值。當檢測值大於參考值1.5倍或者小於參考值0.65倍，可分別判定為陽性或者陰性。本發明所述的抗體晶片試劑盒結合了玻片式抗體晶片平臺與半定量晶片平臺的優勢：(1)在一個實驗中，同時檢測出20種血管生成因子；(2)無需進行蛋白沉澱和蛋白印記等實驗；(3)不需要特殊的設備，普通實驗室即可應用；(4)工作流程短，不需要同位素放射性物質；(5)靈敏度高(可檢測出pg量的蛋白質)；(6)檢測的特異性高、樣品範圍廣、信號檢測多樣。本發明所述的抗體晶片試劑盒可通過監測血管生長因子表達水平的變化，能對相關癌症如肝癌、肺癌、食道癌、腎癌、淋巴癌進行輔助診斷。附圖說明圖1是本發明所述的用於檢測血管生成因子的抗體晶片試劑盒的一個實施例的抗體點樣示意圖。圖2為本發明所述的用於檢測凋亡因子的抗體晶片試劑盒所採用的1×4晶片框架以及2×8晶片框架的示意圖。圖3為用間接ELISA法測定本發明所述試劑盒中的抗Angiogenin抗體的靈敏度。圖4為本發明所述抗體晶片試劑盒檢測腫瘤組織樣本的結果，圖中，T1為第一種腫瘤組織樣本，N1為T1對應的正常組織樣本，T2為第二種腫瘤組織樣本，N2為T2對應的正常組織樣本。圖5為本發明所述試劑盒的抗體交叉反應結果。具體實施方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1：試劑盒的製備。1、抗體的篩選與來源抗體來源信息如下：表1：這些特異性抗體通過全自動點樣儀完成點樣操作，將特異性抗體固定於玻片的方法包括：1)特異性抗體與含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸鹽緩衝液混合形成抗體混合物；2)於抗體混合物中將每個抗體含量以0.01至2ng固定於所述點樣孔，每個抗體設置2至4個重複孔；3)抗體晶片點陣排布於玻片，玻片每平方釐米點10至100個特異性抗體。各特異性抗體的排布可以按照實驗設計需要進行調整，根據不同的抗體晶片排布陣列，通過控制全自動點樣儀，製備出所需要的中間產品。圖1顯示了本發明所述的用於檢測人RTK磷酸化抗體晶片試劑盒的一種抗體點樣示意圖。全自動點樣儀為美國鉑金艾爾默公司生產的產品；玻片為美國康寧公司產品。當然，在發明技術方案的上述步驟中，儀器和材料的採用並不局限於本實施例的列舉，而是以能夠解決本發明的技術問題，並實現相應的技術效果為依據。2、試劑盒的化學組份固相載體：已包被抗體的標準玻片洗滌液：含吐溫20的20X濃縮洗滌液。1X洗滌液為pH7.2，含0.1％吐溫20、0.1mol/L的磷酸鹽緩衝液。稀釋液：2瓶用於稀釋樣本的15ml5X濃縮稀釋液D，1瓶用於稀釋抗體和HRP-鏈親和素的15ml5X濃縮稀釋液B。1X稀釋液B為15mM,pH7.4的PBS緩衝液，溶質及其在所述稀釋液B中的質量濃度或摩爾濃度或體積濃度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mMNaCl。1X稀釋液D為15mM,pH6.5的PBS緩衝液，溶質及其在所述標本稀釋液中的質量濃度或摩爾濃度或體積濃度如下：2-4％蔗糖，150mMNaCl。檢測抗體：生物素化的檢測抗體混合物。200μl300X濃縮螢光素-鏈親和素溶液。樣本處理液：2X細胞裂解液10ml，1X細胞裂解液包含10mMpH7.5，Tris.HCl，25mMNaCl，1％脫氧膽酸鈉，1％TritonX-100，包含磷酸酶及蛋白酶抑制劑。實施例2：用本發明的試劑盒檢測血管生成因子的實驗。1、玻片晶片的完全乾燥將玻片晶片從盒子中取出來，在室溫平衡20-30min後，將包裝袋打開，揭開密封條，然後將晶片放在真空乾燥器或者室溫乾燥1-2小時。2、晶片操作流程每個孔中加50-100μl的樣品，不同樣品的加樣量不一樣：血漿，血清使用前用樣品稀釋液1：1稀釋；細胞上清液可用原液；細胞或組織裂解液經蛋白濃度測定後加入50－500ug/ml的量。3、清洗抽去每個孔中的樣品，洗滌液清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的1×洗滌液，每次清洗要抽乾淨洗液，用去離子水稀釋20×洗滌液。4、檢測抗體混合物的孵育離心檢測抗體混合物小管，然後加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻後再次快速離心。添加80μl的檢測抗體到每個孔中，室溫搖床上孵育2小時。5、清洗抽去每個孔中的檢測抗體，洗滌液清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的洗滌液，每次清洗要抽乾淨洗液。6、Cy3-鏈黴親和素的孵育離心Cy3-鏈黴親和素小管，然後加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻後再次快速離心。添加80μl的Cy3-鏈黴親和素到每個孔中，用鋁箔紙包住玻片避光孵育，室溫搖床上孵育1個小時。8、清洗抽去每個孔中的Cy3-鏈黴親和素，洗滌液清洗5次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔150μl的洗滌液，每次清洗要抽乾淨洗液。9、螢光檢測9.1將玻片框架拆掉，小心不要用手接觸到玻片印製抗體的一面。9.2將玻片放置在玻片清洗管中，添加約30ml的洗滌液，能整個覆蓋住玻片，在室溫搖床上震蕩15min，棄去洗滌液。9.3去除玻片的殘留洗液。將玻片放置在玻片清洗管/乾燥管中，不蓋蓋子，在1000rpm離心3min。9.4採用雷射掃描儀例如AxonGenePix掃描信號，採用Cy3或者綠色通道(激發頻率＝532nm)。10、晶片的數據提取以及用分析軟體來進行數據分析。利用GenepixPro6.1軟體獲取晶片上所有點的信號強度。利用自行開發的電子表格版的分析軟體計算每個蛋白的表達水平和標準曲線，利用陽性對照信號標準化。背景閾值設置對照組的平均強度加上2倍標準偏差(SD)進行統計，表達水平高於背景加上2×SD的蛋白用於校正的T檢驗分析。結果判定根據以下計算方式：X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)，減去背景信嗓值後，其中P1表示陽性對照在參考組中的信號強度，P(y)表示陽性對照在反應組中的信號強度，X(y)表示樣本在反應組中的信號強度,表示樣本在反應組中的檢測值。當檢測值大於參考值1.5倍或者小於參考值0.65倍，可分別判定為陽性或者陰性。實施例3：試劑盒的質量檢測1)本發明的試劑盒的檢測靈敏度。以抗Angiogenin抗體舉例說明晶片中各抗體的靈敏度，檢測限的檢測結果。具體步驟按照間接ELISA法：(1)酶標板的包被：用包被液(Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N31.2g，加ddH2O到1L，調pH到9.6)將抗原蛋白濃度按梯度稀釋加入到96孔酶標板中，每孔100μL，將板密封於4℃過夜。(2)酶標板的封閉：將包被過夜的酶標板拍幹，加入200μL/well的封閉液，370C封閉2h，用洗板機洗板6次後將酶標板拍幹，並於4℃備用，或-200C長期保存。(3)加入抗Angiogenin抗體，100μL/well，於37℃溫育1h，用洗板機洗板6次後將酶標板拍幹，再加入一定濃度的HRP標記羊抗-小鼠IgG抗體(購自美國Raybiotech)，100μL/well，於37℃溫育1h；洗板後加入TMB顯色液，待顯色完全後，加入2M的濃硫酸終止顯色，並用酶標儀(美國Biotek)測定OD450。檢測結果見圖3。如圖3所示，抗Angiogenin抗體靈敏度為1.5pg/ml。以相同的原理和方法得到其他抗體的靈敏度數據如下表2：表2：實施例4：試劑盒的應用配製ProteaseInhibitorCocktail(蛋白酶抑制劑組合物)：將ProteaseInhibitorCocktail小管簡單離心一下，然後將蓋子打開，加入60μL稀釋好的1X樣本處理液在小管中，混勻溶解蛋白酶抑制劑。取10μL配製好的蛋白酶抑制劑，加入到990μL的1X樣本處理液中，混勻，即配製好的已添加蛋白抑制劑的細胞/組織裂解液，備用。將配製好的細胞/組織裂解液和1XPBS在冰上預冷。從-80度冰箱取出冰凍組織，取組織，用手術剪刀將其剪碎至1-3mm3，轉移至2ml離心管，加入150μL樣本處理液，置冰上保持低溫，勻漿機裂解組織，5-15min(根據具體組織而定)。冷凍離心機離心13000rpm10min；取上清備用。細胞裂解後，測定樣本蛋白濃度(BCA法Pierce公司，貨號：23227)。採用BCA試劑盒檢測組織裂解液蛋白濃度，測定結果如下：樣品ID蛋白濃度(mg/ml)T124.44N128.22T243.06N230.09玻片晶片的完全乾燥,將玻片晶片從盒子中取出來，在室溫平衡20-30min後，將包裝袋打開，揭開密封條，然後將晶片放在真空乾燥器或者室溫乾燥1-2小時.每個晶片孔中加入100μL樣品，一個陣列一個樣品，4℃振蕩過夜孵育。(樣品離心14000rpm4min，樣品0.5mg/ml上樣)使用ThermoScientificWellwashVersa晶片洗板機清洗玻片，首先用1×洗液I進行清洗，每孔250μl洗液I，清洗6次，每次震蕩10s，震蕩強度選擇高。配製生物素標記抗體，快速離心生物素標記抗體的小管，每個小管加入300μL的1×抗體稀釋液，混合均勻。每孔加入70ul生物素標記抗體；室溫震蕩孵育2個小時。清洗，清洗步驟同上。每孔加入70μl的1500倍稀釋的螢光劑-鏈黴親和素(快速離心後加入1.5ml的封閉液到螢光劑-鏈黴親和素的小管)，用密封條貼住玻片，然後用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育1-2個小時。(此步也可在4℃過夜孵育)清洗，清洗步驟同上。採用雷射掃描儀例如AxonGenePix掃描信號，採用Cy3或者綠色通道(激發頻率＝532nm)，掃描儀器為GenePix4000BMicroarrayScanner，掃描參數：PMT： 700,Wavelengh：532nm；resolution：42um。採用晶片分析軟體提取數據，採用AAH-ANG-G1及AAH-ANG-G2的數據分析軟體來進行數據分析。本發明所述抗體晶片試劑盒檢測腫瘤組織樣本的結果如圖4所示，T1圖顯示肺癌組織樣本在晶片上樣後的掃描結果，N1為T1對應的正常肺部組織樣本，T2為白血病細胞K562細胞裂解液樣本，N2為T2對應的正常白細胞裂解液樣本。通知雷射掃描儀對發光點進行微調，掃描結果顯示蛋白表達的細小變化。由結果可知，肺癌組織的蛋白EGF,ENA-78,Leptin的表達量顯著增加，白血病細胞蛋白EGF,bGFG,IL-8,Leptin,PLGF,VEGF-D的表達量顯著增加。經X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)公式判定為陽性表達，說明這九個蛋白在腫瘤細胞中有異常表達。實施例4：試劑盒的抗體交叉反應結果。具體操作步驟如實施例3如述，抗體交叉反應結果見圖5。由結果可知，每種抗體對可以特異地識別自己的檢測抗原，而與其他的抗原沒有交叉反應。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp