蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用的製作方法
2023-04-28 06:46:51
專利名稱：蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種細菌的應用，特別涉及蛭弧菌遊泳體菌液在 斑節對蝦等海產品養殖中的應用。
背景技術：
斑節對蝦(Penaeus monodon)俗稱鬼蝦、草蝦、花蝦、竹節蝦、斑節蝦、牛形對蝦，聯 合國糧農組織通稱大虎蝦。是對蝦中個體最大的一種，成熟個體一般體長22cm-32cm，體重 137g-211g，為當今世界上蝦類養殖最普遍的品種之一。近年來，由於養殖者為了追求高產量，對蝦的放養密度過大。在養殖過程中因過量 投餌和對蝦排洩物引起底質極端惡化，水質發生突變，極易引起蝦體的免疫力下降，從而引 發蝦病的發生。傳統方法具有低成本的優點的同時，缺點也比比皆是。中草藥對斑節對蝦生長性 能具有無藥物殘留、經濟效益高的優點，但有見效慢的缺點。抗生素對抑制病原微生物的繁 殖，減少其代謝毒素對蝦的毒害作用等方面起到了積極的作用，但是長期使用抗生素，特別 是濫用抗生素，其種種弊端也逐漸顯露出來。如破壞蝦塘中自然生態平衡，對蝦的機體免疫 力產生不良影響，產生耐藥性和藥物殘留等副作用，給養殖業和作為消費者的人類的健康 都帶來了潛在的危害。因此，開發一種簡便易行、安全、優質的無公害健康的斑節對蝦養殖 新技術已經成為當今社會的共識。蛭弧菌是寄生於其他細菌，並能導致宿主細菌裂解的一類細菌；比一般細菌小，能 通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用；革蘭氏染色呈陰性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻 弧菌等引發對蝦病害的潛在致病菌。蛭弧菌遊泳體是指蛭弧菌侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌遊泳體侵入宿主細 菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。與蛭質體相比，遊泳體具有起效快、活力強的優 點。這些特性使得蛭弧菌遊泳體同樣適合作為一種微生物製劑。筆者通過實驗，證明了蛭 弧菌遊泳體在成蝦養殖過程中能夠顯著地提高蝦的存活率以及促進蝦生長。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的弊端，提供蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖 中的應用方法。其特徵按照養殖生態學原理，海洋生物的生長環境要求，生物之間的相互關 系及無公害養殖標準，人工營造良好的養殖環境，減少投入成本，提高斑節對蝦免疫力，促 進其快速生長，提高經濟效益。本發明的目的通過下述方案實現蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用。所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，於2009年8月7日保藏於中國 典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用是將飼料在蛭弧菌遊泳體菌液中浸泡15-45min。所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌遊泳體 菌液，使水體中蛭弧菌遊泳體濃度為IO1 l(fpfu/mL。所述蛭弧菌遊泳體菌液的製備方法為接種宿主於營養肉湯液體培養基中，在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經 4 "C，5000 8000rpm離心10 20min後，沉澱加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌 BDFM05，在溫度25 ;35°C下，以150 300rpm搖床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和 蛭弧菌遊泳體的培養液，培養液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min後，上清 經16000 18000rpm離心15 20min後，沉澱用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0. 2mol/ L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO11 1012pfu/mL的蛭弧菌遊泳體 菌液。本發明的優點及效果發展無公害養殖，提高斑節對蝦的免疫力，促進斑節對蝦的 快速生長，降低生產成本，提高經濟效益，是我國海水養殖業發展的必由之路。蛭弧菌能改 善養殖生物腸道環境，提高免疫力，促進生長。對蝦類無毒性作用，對人類無致病性。蛭弧 菌遊泳體侵入宿主細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。相對於蛭弧菌蛭質體而言， 雖然存在著製備繁瑣、不易保存的弱點，但蛭弧菌遊泳體控制和消除弧菌及其它致病菌起 效快、活力強的優點，使得它同樣適合作為抑止或清除生物體及其環境中致病菌的生物淨 化因子。由於蛭弧菌對水產養殖生物的致病或潛在致病菌，特別是弧菌有強的裂解力，對 水質也有一定的淨化作用，用蛭弧菌遊泳體浸泡飼料，並在池水中潑灑一定濃度的蛭弧菌 遊泳體菌液，既能促進斑節對蝦的生長，提高免疫力，又能淨化水質，最長可達到30天不換 水。從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和養殖廢水汙染環境，為人類提供安全、綠色、無 公害的水產品，提高養殖戶的收入。
具體實施例方式下面結合實施例及表格對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。實施例1蛭弧菌遊泳體菌液的製備所述的蛭弧菌遊泳體菌液通過以下方法製備接種ImL濃度為IO7CfVmL嗜水氣 單胞菌(Aeromonas hydrophila，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)於 IL營養肉湯液體培養基中，培養20h，培養液經6000rpm離心15min後，沉澱加入至IL DNB液體培養基(營養肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶於IOOOmL蒸 餾水中，PH值為7. 6)中，接入ImL濃度為103pfu/mL蛭弧菌BDFM05，培養48h，培養液 經6000rpm離心15min後，將上清液經16000rpm離心15min後，沉澱用IOOmL DNB液體培 養基懸浮，得到蛭弧菌遊泳體菌液，蛭弧菌BDFM05遊泳體菌液的濃度為109pfu/mL。實施例2蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦普通養殖中的應用實驗本發明的具體實施地點為華南地區某養殖場，實施時間為3個月。(1)養殖池塘條件，養殖池底面積為10畝，池深2m，池底為泥沙質，池底平整，養殖 池配備水泵、增氧機，並配備泵站間門和較完備的進排水系統；
(2)放養前的準備，試驗地海域的水源水質符合中華人民共和國國家標準漁業水 質標準(GB11607-89)要求，海水經過砂濾、沉澱處理後進入養殖池，符合農業部《無公害食 品海水養殖用水水質》(NY5052-2001)要求。放苗前10天，用80目的袖狀網過濾後進水， 同時施氮、磷、鉀複合肥培養餌料生物，使池水透明度達到40cm，養殖池水鹽度10%。；(3)蝦苗選擇與放養，蝦苗選擇個體大小整齊，體長1. 1-1. 3cm的黑殼蝦苗，群體 發育整齊，肌肉飽滿透明，附肢中色素正常，胃腸充滿食物，蝦苗活動活潑，對水流刺激反應 靈敏，無外部寄生物及附著汙物，放苗時水溫20°C，3月20日放苗。養成池水色為黃綠色、 透明度30cm，pH在8. 5，投放密度為5萬隻/畝。蝦苗運至養殖池邊，用充氧氣頭向苗袋內 充氧半小時，同時逐步加入養殖池水，使逐步縮小溫差和醒苗；(4)投飼管理，配合飼料1號(購買於廣東恆興集團有限公司，下同)為常規的 對蝦養殖飼料，符合中華人民共和國農業行業標準《無公害食品漁用配合飼料安全限量》 (NY5072-2002)的規定。每次投餌前，將飼料用蛭弧菌遊泳體菌液浸泡30min，菌液中的蛭 弧菌遊泳體的濃度達到IO1UO3UO5UOWmL,養殖前期和中期，蝦體長平均6cm以下時， 日投2次，日投放量控制在蝦重的15% ；養殖後期，平均體長達到6cm時，日投5次，日投放 量控制在蝦重的8% ；(5)養殖期的水環境管理，養殖期間正常曝氣，使水中溶解氧達到5mg/L。採取不 同換水周期，5、10、15、20、25、30天換水一次，每次換掉25cm深的水(量)，透明度保持在 30cm,每次換水後加蛭弧菌遊泳體菌液，使水體中的菌體濃度達到101、ΙΟ3、105、107pfu/mL, 加菌方法為用相應的池水稀釋菌液後，均勻潑灑全池，使菌液混合均勻。實驗分組採用隨機區組試驗設計，平均分為A-D 4個試驗組，B、C、D、每個試驗組有6個小 組，分別為 B1、C1、D1 ；B2、C2、D2 ；B3、C3、D3、；B4、C4、D4 ；B5、C5、D5 ；B6、C6、D6 ；B1-D6 每小 組再分為4組，即Bl-l-Bl-4. . . D6-1-D6-4，每組2個重複。對4組試驗對蝦初始體重進行 方差整齊性檢驗，組間差異不顯著(P > 0. 05)。四組試驗組的處理如下A組工廠生產的養殖方式，池塘水透明度低於20cm時進行換水，每次換水換掉 50cm深的水(量)，維持池水透明度在35cm，投放顆粒配合飼料1號B組在水中潑灑蛭弧菌遊泳體菌液，使水體中遊泳體菌體濃度分別達到10\103、 105、l(fpfu/mL，投放顆粒配合飼料1號C組投餵濃度為IO1UO^ 105、107pfu/mL的蛭弧菌遊泳體菌體浸泡後的配合飼料 1號D組在水中加入蛭弧菌遊泳體菌液，使菌體濃度分別達到IO1UO3UO5UObfu/ mL,同時分別投餵濃度為IO1UO3UO5UOYfuAiL的蛭弧菌遊泳體菌液浸泡後的配合飼料1 號；Bi、Cl、Dl組每5天換水一次，換掉25cm深的水(量)B2、C2、D2組每10天換水一次，換掉25cm深的水(量)B3、C3、D3組每15天換水一次，換掉25cm深的水(量)B4、C4、D4組每20天換水一次，換掉25cm深的水(量)B5、C5、D5組每25天換水一次，換掉25cm深的水(量)B6、C6、D6組每30天換水一次，換掉25cm深的水(量)
Bl-I、Cl-I、D1-1. . . D6-1換水後加入蛭弧菌遊泳體使水體中菌體濃度為l(^pfu/mLBl-2、Cl-2、Dl_2... D6_2換水後加入蛭弧菌遊泳體使水體中菌體濃度為103pfu/mL
Bl-3、Cl-3、Dl_3... D6-3換水後加入蛭弧菌遊泳體使水體中菌體濃度為105pfu/mLBl-4、Cl-4、Dl_4. . . D6_4換水後加入蛭弧菌遊泳體使水體中菌體濃度為l(fpfu/mL斑節對蝦實驗效果檢測(1)生長指標的測定每組隨機抽取50尾對蝦檢測生長情況，對蝦長度測定採用精度為0. Imm的遊標卡 尺度量，體重採用電子天平稱量。試驗生長指標按如下公式計算成活率(%) = Nt/NoX100% ；增重率(％) = (Wt-W0)/W0X 100% ；體長增長率(%) = (Lt-L0)/L0X 100% ；式中N。為試驗開始時斑節對蝦總尾數；Nt為試驗結束時斑節對蝦總尾數；W。為試 驗開始時斑節對蝦體重；Wt為試驗結束時斑節對蝦體重；L。為試驗開始時斑節對蝦體長；Lt 為試驗結束時斑節對蝦體長；試驗測得的斑節對蝦各項生長指標見表一-表四與A組相比，B、C、D組的成活 率、增重率、體長增長率均有明顯提高，B、C、D組成活率的增加值分別> 25. 38%,26. 28%, 28. 55 % ；增重率的增加值分別彡40. 54%,65. 62 %,86. 3% ；體長增長率增加值分別 彡 1. 89%,2. 97%,2. 99%。從表一-表四可以看出，在對蝦養殖過程中，在相同的換水周期下，隨著蛭弧菌遊 泳體的濃度升高，成活率、增重率、體長增長率都明顯升高，且都明顯高於工廠生產對照A 組，說明採用新型的添加蛭弧菌遊泳體的方法，能明顯提高斑節對蝦的成活率、增重率、體 長增長率，這在實際生產過程中，不僅大大節約了用水量，而且節省了大量的人力，物力資 源，節約了養殖成本；從不同換水周期來看，相同濃度下的各組對蝦成活率、增重率、體長增 長率沒有顯著的變化。說明新型養殖方法下，5-30天不換水蛭弧菌遊泳體均可促進對蝦的 生長。就B、C、D三組不同處理方式而言，均提高對蝦的養殖成活率、增重率和體長增長率， 但同時在水體與飼料中添加蛭弧菌遊泳體菌液效果最佳。因此，無論在水中添加蛭弧菌遊泳體菌液，使水體蛭弧菌遊泳體菌體濃度為 IO1-IO7PfuZmL,或者飼料用濃度為IO1-KfpfuAiL蛭弧菌遊泳質體菌液浸泡，或是兩者兼 用，雖長達30天不換水，均可促進斑節對蝦的快速生長，並且同時在水中與飼料中添加菌 液的效果最好。表一斑節對蝦生長指標的檢測
權利要求
1.蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用。
2.根據權利要求1所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用，其特徵在於所 述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，於2009年8月7日保藏於中國典型培養物 保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209172。
3.根據權利要求1所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用，其特徵在於 所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用是將飼料在蛭弧菌遊泳體菌液中浸泡 15-45min。
4.根據權利要求1所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用，其特徵在於所 述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌遊泳體菌液，使水體 中蛭弧菌遊泳體濃度為IO1 l(fpfu/mL。
5.根據權利要求1所述蛭弧菌遊泳體菌液在斑節對蝦養殖中的應用，其特徵在於所 述蛭弧菌遊泳體菌液的製備方法為接種宿主於營養肉湯液體培養基中，在35°C和200rpm搖床培養12h，培養液經4°C， 5000 8000rpm離心10 20min後，沉澱加入至DNB液體培養基中，接入蛭弧菌BDFM05，在 溫度25 35°C下，以150 300rpm搖床培養36 48h，得到含蛭弧菌蛭質體和蛭弧菌遊泳 體的培養液，培養液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20min後，上清經16000 18000rpm離心15 20min後，沉澱用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩衝液懸浮，得到濃度為IO11 1012pfU/mL的蛭弧菌遊泳體菌液。
全文摘要
本發明特別涉及蛭弧菌遊泳體在斑節對蝦等海產品養殖中的應用，其通過在水體和飼料中添加蛭弧菌遊泳體實現。具體包括養殖池塘條件，放養前的準備工作，蝦苗選擇和放養，投飼管理和養殖期的水環境管理。關鍵技術是在水體中添加蛭弧菌遊泳體菌液，使水體中蛭弧菌遊泳體濃度為101-107pfu/mL，同時飼料要用濃度為101-107pfu/mL的蛭弧菌遊泳體菌液浸泡30min，養殖期間可達到30天不換水。本發明為生物養殖方法，綠色、安全、無汙染，效果顯著，能夠改善水質，促進斑節對蝦生長，提高免疫力，提高成活率，有極好的發展前景。對提高經濟效益和食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號A23K1/18GK102106470SQ20101026861
公開日2011年6月29日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者李智傑, 王沛賢, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學, 陽西程村蠔產業有限公司