一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母及構建方法和應用的製作方法
2023-04-28 05:27:26 1
專利名稱：一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母及構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母及構建方法和應用。
背景技術：
由於礦物燃料資源的不可再生性，急需尋找替代能源。以廉價穀物為原料可生產生物能源。澱粉酶包括α-澱粉酶和葡萄糖澱粉酶，前者是澱粉液化酶，後者是澱粉糖化酶，兩種酶共同作用可將澱粉徹底水解為葡萄糖，進而通過發酵微生物如酵母的發酵可進一步生成生物乙醇。因此，開發高活力澱粉酶對於發展生物能源具有重要意義。
目前已研製的澱粉酶主要存在以下問題啟動酶重組表達的啟動子的活力不足， 從而使酶的重組表達量不足；酶的重組表達方式一般是細胞內表達和分泌表達。細胞內表達時由於酶不能與細胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細胞內形成反饋抑制，也影響表達效率。分泌表達的主要缺點是表達效率不高，而且也不能實現完全分泌表達，總有相當一部分表達產物滯留於細胞內，從而也不能實現酶與細胞外底物的完全接觸。
綜上所述，啟動酶重組表達的啟動子活力不足以及酶的細胞內表達和分泌表達方式都嚴重影響澱粉酶活力。發明內容
本發明提供了一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母，利用該重組釀酒酵母表面展示澱粉酶，表達效率較高，表達量較大，能獲得較高酶活的澱粉酶。
一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母，為含有重組質粒的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；所述釀酒酵母的GALl基因被GAL4基因替換；所述的重組質粒由釀酒酵母表達載體pGMAK和插入釀酒酵母表達載體pGMAK中GALl啟動子下遊MF α 1 信號肽與釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因之間的澱粉酶基因組成。
所述的釀酒酵母為釀酒酵母ZD-I (Saccharomyces cerevisiae ZD-1)，為 2010 年 3月從柑橘果皮表面分離、篩選得到的，保藏於浙江大學生物系統工程與食品科學學院發酵工程實驗室。
所述的澱粉酶基因為α -澱粉酶基因或葡萄糖澱粉酶基因。澱粉酶由α -澱粉酶和葡萄糖澱粉酶組成，前者是澱粉液化酶，後者是澱粉糖化酶，兩種酶共同作用可將澱粉徹底水解為葡萄糖。分別以二種酶的酶基因作為外源目的基因構建重組質粒，可獲得能表面展示相應酶的重組釀酒酵母。
所述釀酒酵母的GAL4基因序列的Genbank號為NC 001148. 3 ；所述釀酒酵母的 GALl基因序列的Genbank號為NC 001134. 7。GAL4蛋白是釀酒酵母表達載體pGMAK上GALl 啟動子的激活子，GALl基因缺失的重組釀酒酵母不能以乳糖為碳源，但具有雙重GAL4基因的重組釀酒酵母可表達雙倍量的GAL4蛋白，進而能顯著增強GALl啟動子的活力，提高外源目的基因在GALl啟動子和MF α 1信號肽引導下的分泌表達水平。
所述釀酒酵母表達載體PGMAK的表達框從5』端到3』端依次為GAL1啟動子 (Genbank號:AY428072)、MF α 1信號肽(Genbank號M17301)、釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因(Genbank號iC8164) ,ADHl終止子。所述的GALl啟動子能啟動外源目的基因的表達；所述的MFa 1信號肽能引導酶向細胞外分泌；所述的釀酒酵母的細胞壁α凝集素能錨定在釀酒酵母的細胞壁中，作為載體蛋白能使酶分子高密度展示表達在釀酒酵母細胞壁外表面，能有效提高酶的活性。
所述的α-澱粉酶基因可以來自鏈球菌(Sti^ptococcus bovis)，Genbank號為 AB000829. 1 ；所述的葡萄糖澱粉酶基因可以來自米麴黴(Rhizopus oryzae)，Genbank號為 D00049. 1。
本發明還提供了所述的重組釀酒酵母的構建方法，包括以下步驟將澱粉酶基因插入釀酒酵母表達載體PGMAK中GALl啟動子下遊MF α 1信號肽與釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因之間，構建獲得重組質粒；採用同源重組技術將所述釀酒酵母的GALl基因替換為 GAL4基因，將所述重組質粒轉入該細胞，獲得重組釀酒酵母。
採用所述的同源重組技術，用釀酒酵母的GAL4序列替換釀酒酵母染色體組中的 GALl序列，該酵母系統染色體組中原有的GAL4基因仍然保留，從而可使該酵母系統具有雙重GAL4基因並且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)。
本發明還提供了所述的重組釀酒酵母在製備澱粉酶製劑中的應用，包括以下步驟將所述的重組釀酒酵母接種於含生澱粉和半乳糖的YPD培養基中進行發酵培養，發酵培養36 72小時後離心收集菌體，製得澱粉酶製劑。
所述的生澱粉和半乳糖可協同誘導澱粉酶的分泌表達。優選地，以重量百分比計， 所述YPD培養基中生澱粉的濃度為3-8%，半乳糖的濃度為0. 5-2%，最有利於酵母的生長和澱粉酶的表達。
優選地，所述的發酵培養時間為40-45小時，此條件下分泌表達的澱粉酶酶活最尚ο
本發明通過同源重組技術將釀酒酵母細胞內的GALl基因替換為GAL4基因，獲得具有雙重GAL4基因的重組釀酒酵母，可有效提高重組質粒GALl啟動子的表達效率，增加澱粉酶的表達量；同時，重組質粒末端連接的細胞壁α凝集素基因所表達的細胞壁α凝集素，能將澱粉酶高密度展示表達在釀酒酵母細胞壁外表面，能顯著提高澱粉酶的酶活。試驗證明，與使用出發菌株釀酒酵母作為展示表達宿主相比，使用本發明所構建的重組釀酒酵母展示表達澱粉酶，表達獲得的澱粉酶酶活更高。
具體實施方式
實施例1具有雙重GAL4基因且GALl基因缺失的釀酒酵母的構建
採用同源重組技術，用釀酒酵母ZD-I (Saccharomyces cerevisiae ZD-1)的 GAL4 基因(GerAank號NC 001148. 3)替換該釀酒酵母染色體組中的GALl基因(Genbank號NC 001134. 7)，使該酵母系統具有雙重GAL4基因並且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)，具體步驟如下
(1)人工合成KanMX抗性基因(Genbank號S78175. 1)，該基因兩端分別含GALl蛋白5』端和3』端序列，各為47bp。
(2)將兩端分別含GALl蛋白5』端和3』端序列的KanMX抗性基因通過電擊轉化入釀酒酵母ZD-I，以置換GALl基因。電擊轉化程序為
①從YEPD平板上挑取單個酵母菌落，接種於5ml YEPD培養基中，30°C、200rpm振蕩培養過夜後，取100 μ 1菌液接種於含IOml YEPD培養基的三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養 8-IOh 至 OD6qq = 1.3-1.5。
②分裝菌液到滅菌的2ml離心管中，冰上放置15min後5500rpm 4°C離心5min收集細胞。去離子水洗滌1-2次，棄上清，每管用320 μ 1滅菌超純水重懸，加40 μ 1 10ΧΤΕ 以及 40 μ 1 lOXLiAc，混勻，30°C 85rpm 振蕩 45min，加 20μ 1 DTT 至終濃度為 25mM， 30°C 85rpm 振蕩 15min。5500rpm 4°C離心 5min 收集細胞。
③用Iml預冷過的滅菌超純水重懸細胞沉澱，5500rpm 4°C離心5min收集細胞，重複該步驟2次。
④用Iml預冷過的IM D-山梨醇重懸細胞沉澱，5500rpm 4°C離心5min，再用 100 μ 1預冷過的IM D-山梨醇重懸細胞沉澱，輕輕旋轉混勻，此為酵母感受態細胞，置於冰上用於電擊轉化。
⑤取40μ 1酵母感受態菌，與5μ 1 IOmM KanMX抗性基因溶液混合，移入電擊轉化杯，冰浴5min後，置電轉儀上電擊轉化。條件為電壓1.51^，電容2511 ，電阻200 0，時間5毫秒。
⑥立即加入Iml冰浴的YEPD培養基，將混合物轉到1. 5ml Ependorf管中，30°C振蕩池，其間每隔30min輕輕顛倒混勻一次。
⑦5500rpm室溫離心5min，棄上清，用滅菌超純水洗滌一次後，5500rpm室溫離心5min，用200μ1滅菌超純水懸浮細胞，將菌液塗布於含G418 QOO μ g/ml)或 Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培養板，30°C倒置培養培養2_3天，長出的陽性菌落即為GALl基因被KanMX抗性基因置換成功者。
(3)人工合成GAL4蛋白基因，該基因兩端分別含GALl蛋白5』端和3』端序列，各為 47bp。
(4)將兩端分別含GALl蛋白5』端和3』端序列的GAL4蛋白基因通過電擊轉化入釀酒酵母ZD-I，以置換KanMX抗性基因。電擊轉化程序為
①-⑥同步驟⑵中的相關部分；
⑦5500rpm室溫離心5min，棄上清，用滅菌超純水洗滌一次後，5500rpm室溫離心5min，用200μ 1滅菌超純水懸浮細胞，將菌液塗布於不含G418 QOO μ g/ml) 或&0(^11(15(^8/1111)的YPD培養板後，再用硝酸纖維素膜覆蓋平板後，複印到含 6418(200 μ g/ml)或Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培養板，如此則2種平板互為影印平板。 30°C倒置培養培養2-3天，如果在含G418 (200 μ g/ml)或Zeocin (150 μ g/ml)的YPD培養板上的某位置無菌落長出，而在不含G418 QOO μ g/ml)或kocin (150 μ g/ml)的YPD培養板上相應長出菌落，則該菌落即為KanMX抗性基因被GAL4基因置換成功。
通過步驟(1)至步驟(4)的操作，釀酒酵母ZD-I的GALl基因先被KanMX抗性基因置換，然後KanMX抗性基因被GAL4基因置換，最終實現GALl基因被GAL4基因置換，構建獲得具有雙重GAL4基因並且GALl基因缺失(dGAL4 Δ GALl型)的釀酒酵母。
實施例2表面展示α -澱粉酶的重組釀酒酵母
(1) α -澱粉酶展示表達框的構建
將α -澱粉酶基因(來自鏈球菌 Mreptococcus bovis，Genbank 號ΑΒ000829· 1) 插入釀酒酵母表達載體PGMAK中GALl啟動子(Genbank號AY428072)下遊MFa 1信號肽 (Genbank號M17301)與釀酒酵母細胞壁α凝集素基因(Genbank號IC8164)之間，構建獲得α -澱粉酶展示表達框(從N端到C端):GAL1啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因，具體步驟如下
①人工合成MF α 1信號肽(5，端帶EcoR I位點，3，端帶BamH I位點)，GALl啟動子(GALlp，5』端帶BamH I位點，3，端帶Hind III位點)，α -澱粉酶基因(aAM，5，端帶 Hind III位點，3』端帶Mc I位點)和釀酒酵母細胞壁α凝集素基因C端序列(aAGc，5』 端帶Mc I位點，3，端帶Ml I位點)。
②BamH I酶切MF α 1信號肽序列和GALlp序列，將帶3，BamH I粘末端的MF α 1 信號肽序列和帶5，BamH I粘末端的GALlp序列通過T4DNA連接酶連接，成為MF α I-GALlp 嵌合序列。
③Hind III酶切MF α I-GALlp嵌合序列和aAM序列，將帶3，Hind III粘末端的 MFa I-GALlp嵌合序列和帶5，Hind III粘末端的aAM序列通過T4DNA連接酶連接，成為 MF α 1-GALlp-aAM 嵌合序列。
④&ic I酶切MF α 1-GALlp-aAM嵌合序列和α AGc序列，將帶3，SacI粘末端的 MF α 1-GALlp-aAM嵌合序列和帶5，Mc I粘末端的α AGc序列通過Τ4 DNA連接酶連接，成為MF α 1-GALlp-aAM- α AGc嵌合序列，S卩α -澱粉酶展示表達框(從N端到C端)=GALl啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因。
(2)展示表達α -澱粉酶的重組釀酒酵母的構建
將包含α -澱粉酶展示表達框的重組質粒轉化入dGAL4AGALl型釀酒酵母細胞中，構建重組釀酒酵母，具體包括
①將本實施例中步驟(1)構建的α -澱粉酶展示表達框通過電擊轉化入實施例1 構建的dGAL4AGALl型酵母中，電擊轉化步驟見實施例1。
②完成電擊轉化後，將酵母菌液塗布於含5%生澱粉的YPD平板，30°C倒置培養培養2-3天，菌落大且周圍出現透明圈者即為帶α -澱粉酶展示表達框的dGAL4 Δ GALl型酵母(Sc-dGAL4Δ GALl-aAM-α AGc)。
(3) α -澱粉酶的展示表達和酶活測定
將上述步驟(2)構建的重組釀酒酵母k-dGAL4AGALl-aAM_a AGc接種於IOml YEPD中，30°C、200rpm振蕩培養8-IOh至OD600 = 1. 3-1. 5後，取ImL菌液接種於5%生澱粉和半乳糖的YPD培養基中，經45小時後，培養體系中a -澱粉酶活力達到858U/mL。
其中，a -澱粉酶酶活的測定a _澱粉酶從生澱粉分子內部切斷糖苷鍵，使大分子澱粉斷裂為小分子澱粉，露出更多的還原端，故可通過測定還原糖增加量評價α-澱粉酶活力。α-澱粉酶活力定義以生澱粉為底物，ImL酶液每分鐘產生1 μ mol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為1個a -澱粉酶活力單位，記為U。
a -澱粉酶展示表達後酶活的比較
實施例2根據上述步驟(1)至步驟(3)的結果，本實施例使用dGAL4 Δ GALl型釀酒酵母作為展示表達宿主，α -澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因」；經測定，展示表達的α-澱粉酶活力達到858U/mL。
對比例1按照實施例2中步驟(1)至步驟(3)的操作，其中，使用出發菌株釀酒酵母ZD-I作為展示表達宿主，α -澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因」，其餘步驟相同；經測定，展示表達的α-澱粉酶活力達到 335U/mL0
對比例2按照實施例2中步驟⑴至步驟(3)的操作，其中，使用出發菌株釀酒酵母ZD-I作為分泌表達宿主，α -澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因」，其餘步驟相同；經測定，分泌表達的α -澱粉酶活力達到212U/mL。
對比例3按照實施例2中步驟⑴至步驟(3)的操作，其中，使用dGAL4 Δ GALl型釀酒酵母作為分泌表達宿主，α -澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+ α -澱粉酶基因」，其餘步驟相同；經測定，分泌表達的α-澱粉酶活力達到沈5^!^。
實施例3表面展示葡萄糖澱粉酶的重組釀酒酵母
(1)葡萄糖澱粉酶展示表達框的構建
將葡萄糖澱粉酶基因(來自米麴黴Rhizopus oryzae, Genbank號D00049. 1)插入釀酒酵母表達載體PGMAK中GALl啟動子(Genbank號AY428072)下遊MF α 1信號肽 (Genbank號Μ17301)與釀酒酵母細胞壁α凝集素基因(Genbank號IC8164)之間，構建獲得葡萄糖澱粉酶展示表達框(從N端到C端):GAL1啟動子+MF α 1信號肽+葡萄糖澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因，具體步驟如下
①人工合成MF α 1信號肽(5，端帶EcoR I位點，3，端帶BamH I位點)，GALl啟動子(GALlp，5』端帶BamH I位點，3』端帶Hind III位點)，葡萄糖澱粉酶基因(GLU，5』端帶 Hind III位點，3』端帶Mc I位點)和釀酒酵母細胞壁α凝集素基因C端序列(aAGc，5』 端帶Mc I位點，3，端帶Ml I位點)。
②BamH I酶切MF α 1信號肽序列和GALlp序列，將帶3，BamH I粘末端的MF α 1 信號肽序列和帶5，BamH I粘末端的GALlp序列通過T4DNA連接酶連接，成為MF α I-GALlp 嵌合序列。
③Hind III酶切MF α I-GALlp嵌合序列和GLU序列，將帶3，Hind III粘末端的 MFa I-GALlp嵌合序列和帶5，Hind III粘末端的GLU序列通過T4DNA連接酶連接，成為 MF a 1-GALlp-GLU 嵌合序列。
④&ic I酶切MF a 1-GALlp-GLU嵌合序列和a AGc序列，將帶3，SacI粘末端的 MF α 1-GALlp-GLU嵌合序列和帶5，Mc I粘末端的α AGc序列通過Τ4 DNA連接酶連接，成為MF α 1-GALlp-GLU- α AGc嵌合序列，即葡萄糖澱粉酶展示表達框(從N端到C端)GAL1 啟動子+MF α 信號肽+葡萄糖澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因。
(2)展示表達葡萄糖澱粉酶的重組釀酒酵母的構建
將包含葡萄糖澱粉酶展示表達框的重組質粒轉化入dGAL4AGALl型釀酒酵母細胞中，構建重組釀酒酵母，具體包括
①將本實施例中步驟(1)構建的葡萄糖澱粉酶展示表達框通過電擊轉化入實施例1構建的dGAL4AGALl型酵母中，電擊轉化步驟見實施例1。
②完成電擊轉化後，將酵母菌液塗布於含5%生澱粉的YPD平板，30°C倒置培養培養2-3天，菌落大且周圍出現透明圈者即為帶葡萄糖澱粉酶展示表達框的dGAL4AGALl型酵母(Sc-dGAL4 Δ GALl-GLU- α AGc)。
(3)葡萄糖澱粉酶的展示表達和酶活測定
將上述步驟O)構建的重組釀酒酵母k_dGAL4 Δ GALl-GLU-α AGc接種於IOml YEPD中，30°C、200rpm振蕩培養8-10h至OD600 = 1. 3-1. 5後，取ImL菌液接種於5%生澱粉和半乳糖的YPD培養基中，經45小時後，培養體系中葡萄糖澱粉酶活力達到763U/mL。
其中，葡萄糖澱粉酶酶活的測定葡萄糖澱粉酶通過從生澱粉分子端部切斷糖苷鍵產生葡萄糖而起糖化作用，所形成葡萄糖帶還原端，故可通過測定還原糖增加量評價葡萄糖澱粉酶活力。葡萄糖澱粉酶活力定義以生澱粉為底物，ImL酶液每分鐘產生1 μ mol葡萄糖所需酶量為1個葡萄糖澱粉酶活力單位，記為U。
葡萄糖澱粉酶展示表達後酶活的比較
實施例3根據上述步驟(1)至步驟(3)的結果，本實施例使用dGAL4 Δ GALl型釀酒酵母作為展示表達宿主，葡萄糖澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+葡萄糖澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因」；經測定，展示表達的葡萄糖澱粉酶活力達到763U/mL。
對比例4按照實施例3中步驟⑴至步驟(3)的操作，其中，使用出發菌株釀酒酵母ZD-I作為展示表達宿主，葡萄糖澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+葡萄糖澱粉酶基因+細胞壁α凝集素基因」，其餘步驟相同；經測定，展示表達的葡萄糖澱粉酶活力達到445U/mL。
對比例5按照實施例3中步驟(1)至步驟(3)的操作，其中，使用出發菌株釀酒酵母ZD-I作為分泌表達宿主，葡萄糖澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+葡萄糖澱粉酶基因」，其餘步驟相同；經測定，分泌表達的葡萄糖澱粉酶活力達到218U/mL。
對比例6按照實施例3中步驟⑴至步驟(3)的操作，其中，使用dGAL4AGALl型釀酒酵母作為分泌表達宿主，葡萄糖澱粉酶表達框為「GAL1啟動子+MF α 1信號肽+葡萄糖澱粉酶基因」，其餘步驟相同；經測定，分泌表達的葡萄糖澱粉酶活力達到324U/mL。
權利要求
1.一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母，為含有重組質粒的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特徵在於，所述釀酒酵母的GALl基因被GAL4基因替換；所述的重組質粒由釀酒酵母表達載體PGMAK和插入釀酒酵母表達載體pGMAK中GALl啟動子下遊MF α 1信號肽與釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因之間的澱粉酶基因組成。
2.根據權利要求1所述的重組釀酒酵母，其特徵在於，所述的澱粉酶基因為α-澱粉酶基因或葡萄糖澱粉酶基因。
3.如權利要求1所述的重組釀酒酵母的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟將澱粉酶基因插入釀酒酵母表達載體PGMAK中GALl啟動子下遊MF α 1信號肽與釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因之間，構建獲得重組質粒；採用同源重組技術將所述釀酒酵母的GALl基因替換為GAL4基因，將所述重組質粒轉入該細胞，獲得重組釀酒酵母。
4.如權利要求1或2所述的重組釀酒酵母在製備澱粉酶製劑中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟將所述的重組釀酒酵母接種於含生澱粉和半乳糖的YPD培養基中進行發酵培養，發酵培養36 72小時後離心收集菌體，製得澱粉酶製劑。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，以重量百分比計，所述YPD培養基中生澱粉的濃度為3-8%，半乳糖的濃度為0. 5-2%。
7.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的發酵培養時間為40-45小時
全文摘要
本發明公開了一種表面展示澱粉酶的重組釀酒酵母及構建方法和應用。該重組釀酒酵母的構建方法為將澱粉酶基因插入釀酒酵母表達載體pGMAK中GAL1啟動子下遊MFα1信號肽與釀酒酵母的細胞壁α凝集素基因之間，構建獲得重組質粒；採用同源重組技術將釀酒酵母的GAL1基因替換為GAL4基因，將所述重組質粒轉入該細胞，獲得重組釀酒酵母。本發明通過同源重組技術獲得了具有雙重GAL4基因的重組釀酒酵母，可有效提高GAL1啟動子表達效率；同時，細胞壁α凝集素能將澱粉酶高密度展示表達在釀酒酵母細胞壁外表面。利用該重組釀酒酵母表面展示澱粉酶，表達效率較高，表達量較大，能獲得較高酶活的澱粉酶，且酵母發酵培養後可直接作為澱粉酶製劑使用。
文檔編號C12R1/865GK102517225SQ20111044669
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者何國慶, 吳淵, 周陳偉, 張延 , 徐娟, 杜珊珊, 楊璐, 紀曉燚, 阮暉 申請人:浙江大學