一種C‑肽免疫抗原和抗C‑肽多克隆抗體及其製備與應用的製作方法
2023-04-28 09:30:44 7
本發明屬於免疫學技術領域，具體涉及一種c-肽免疫抗原和抗c-肽多克隆抗體及其製備與應用。
背景技術：
c肽是含31個胺基酸的多肽，它和胰島素的a、b鏈組成胰島素原，是a、b鏈的連接鏈，在胰島素原分子的摺疊，二硫鍵的正確配對中起重要作用。c肽由胰島素原裂解產生，一分子胰島素原合成一分子c肽與一分子的a、b鏈，後二者合成胰島素。c肽與胰島素共同存在於同一顆粒囊內最終以等分子分泌。c肽不通過肝酶代謝，而主要經過腎臟清除，其清除速率慢，半衰期為20min，明顯較長，其基礎水平平均值為0.4nml/l，當人進食葡萄糖後1h升至1.68nmol/l，反映早期的胰島素功能，3h降至0.65nmol/l。故檢測人血清中的c-肽，能準確測定血循環中c肽水平，能反映β細胞合成與釋放胰島素功能。
糖尿病是一組由胰島素分泌絕對或相對不足所導致的以慢性高血糖為特徵的代謝症候群。最新研究顯示，該疾病在中國成年人群中，約有9240萬例病例，佔總人口數的9.7％，此外，另有1482萬成年人具有前驅糖尿病症狀，約佔總人口數的1.55％。目前臨床診斷篩查中，血清c肽水平對糖尿病的分型診斷、治療方案選擇和療效監測具有重要的臨床參考意義，是篩查診斷糖尿病患者主要的常規必檢項目，此外，對於胰島素瘤的診斷亦有重要參考價值。
技術實現要素：
為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的在於提供一種c-肽免疫抗原的製備方法，該製備方法以c-肽作為原料偶聯載體蛋白多聚賴氨酸(pll)製得c-肽免疫抗原。
本發明的另一目的在於提供上述製備方法製備得到的c-肽免疫抗原。
本發明的再一目的在於提供一種抗c-肽多克隆抗體，該抗c-肽多克隆抗體利用上述c-肽免疫抗原製備。
本發明的第四個目的在於提供上述c-肽免疫抗原和抗c-肽多克隆抗體的應用。
本發明的目的通過下述技術方案實現：
一種c-肽免疫抗原的製備方法，包含如下步驟：
(1)8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂的合成：將王樹脂和賴氨酸混合進行偶聯合成，得到8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂；
(2)樹脂裂解和去保護：將步驟(1)製得的8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂與裂解試劑混合，然後攪拌反應；反應後將反應液過濾，收集濾液，濃縮，濃縮物用水溶解並用乙醚萃取，得到七聚賴氨酸水溶液；
(3)七聚賴氨酸的分離與純化：採用高效反相液相色譜儀對步驟(2)製得的七聚賴氨酸水溶液進行分離，檢測280nm吸收值，收集主峰析出液，濃縮，乾燥，得到七聚賴氨酸；
(4)將步驟(3)製得的七聚賴氨酸與mbs(3-馬來醯亞胺基苯甲酸琥珀醯亞胺酯)混合，攪拌反應，得到mbs活化的七聚賴氨酸；將c-肽與mbs活化的七聚賴氨酸混合，攪拌反應，得到c-肽免疫抗原粗品；
(5)在-15～-20℃鹽水浴，氮氣保護下，將甲基嗎啡啉和氯甲酸異丁酯依次滴加到fmoc-cys-oh中，反應5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃鹽水浴，氮氣保護下，繼續反應1～1.5h，得到反應產物1；然後將反應產物1從鹽水浴中取出，室溫繼續反應15～30min，得到反應產物2；在反應產物2中加入水和乙酸乙酯進行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入質量分數為10％的碳酸氫鈉溶液進行萃取，將fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水進行萃取，將殘留的碳酸氫鈉洗出；加入無水硫酸鈉，除去乙酸乙酯相中殘留水分；除去無水硫酸鈉，乙酸乙酯相濃縮，加入2倍fmoc-cys-oh質量的矽膠，混勻，並乾燥；
(6)將步驟(5)製得的產物裝柱，步驟(4)製得的c-肽免疫抗原粗品溶於pbs緩衝液，然後使用中壓過柱，採用pbs緩衝液為洗脫劑，收集含目標峰的流份；將得到的流份與等體積的乙醚混合，收集沉澱物；沉澱物與4-甲基-3-硝基苯胺反應，產物用pbs緩衝液洗滌；洗滌後的產物在365nm紫外光下照射30～60min，得到c-肽免疫抗原；
步驟(1)中所述的王樹脂和賴基酸的摩爾比優選為1∶7；
步驟(1)中所述的偶聯合成的具體操作優選為：以dcm溶漲樹脂，然後按照去保護、活化、偶聯步驟，在abi431多肽合成儀上依次連接第1級到第3級賴氨酸；
步驟(2)中所述的裂解試劑優選包含如下組分：tfa900ml/l、苯甲硫醚50ml/l、二巰基乙烷30ml/l、苯甲醚20ml/l；
步驟(2)中所述的攪拌反應的時間優選為2h；
步驟(2)中所述的濃縮優選為低壓旋轉濃縮；
步驟(2)中所述的乙醚的用量優選為與水等體積；
步驟(3)中所述的分離的具體操作優選為：在watersdelta600高效反相液相色譜儀上，選用c18製備柱(phenomenex，300i，15μm，id4.6mm×250mm)，以梯度洗脫方式進行分離，486檢測器檢測280nm吸收值，收集主峰析出液；其中，流動相a為1ml/ltfa/h2o，流動相b為1ml/ltfa/乙晴；
步驟(3)中所述的濃縮優選為低壓旋轉濃縮；
步驟(3)中所述的乾燥優選為冷凍乾燥；
步驟(4)中所述的c-肽和七聚賴氨酸的摩爾比優選為≥16∶1；
步驟(4)中所述的mbs活化的七聚賴氨酸優選通過如下步驟製備得到：
將0.002mmol步驟(3)製得的七聚賴氨酸與1mlpbs緩衝液混合，得到七聚賴氨酸溶液；將10mgmbs溶於100μldmf中，得到mbs/dmf溶液；攪拌狀態下，將mbs/dmf溶液滴加到七聚賴氨酸溶液中，加完後，於室溫中攪拌反應2h；
步驟(4)中所述的c-肽免疫抗原粗品優選通過如下步驟製備得到：
將60mgc-肽溶解於2mlpbs緩衝液中，得到c-肽溶液；攪拌狀態下，將c-肽溶液滴加到mbs活化的七聚賴氨酸中，加完後於室溫中攪拌反應3h；
步驟(5)中所述的fmoc-cys-oh、甲基嗎啡啉和氯甲酸異丁酯的體積比優選為1:1:1；
步驟(5)中所述的乙酸酐的用量優選為100mg/100μlfmoc-cys-oh；
步驟(5)中所述的氯甲酸異丁酯加時需慢速滴加，以控制反應體系溫度，滴加速度優選為20～30滴/min；
步驟(5)中所述的水和乙酸乙酯萃取的次數優選為2～3次；
步驟(5)中所述的碳酸氫鈉溶液萃取的次數優選為2～3次；
步驟(5)中所述的水萃取的次數優選為2～3次；
步驟(6)中所述的中壓優選為5～10mpa；
所述的pbs緩衝液濃度優選為0.1mol/l，ph優選為7.0；
一種c-肽免疫抗原，通過上述製備方法製備得到；
一種抗c-肽多克隆抗體，利用上述c-肽免疫抗原製備得到；
所述的抗c-肽多克隆抗體的製備方法，包含如下步驟：
採用步驟(1)合成的c-肽免疫抗原免疫兔子，取血，離心得到抗血清，即為抗c-肽多克隆抗體；
所述的抗c-肽多克隆抗體的製備方法還包括純化步驟：
將上述抗血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，混勻，然後離心，收集上清液，將濾液用10×pbs緩衝液混合，在2～4℃下緩慢加入硫酸銨，使其終濃度為40～45％w/w；離心，收集沉澱；沉澱用pbs緩衝液溶解，置於pbs緩衝液中透析然後乾燥，得到c-肽多克隆抗體；
所述的pbs緩衝液濃度為0.01mol/l，ph為7.4；
所述的離心優選為8000～10000r/min，離心15～30min；
所述的透析的條件優選為透析3～4天，10～14小時換一次液；
所述的乾燥優選為冷凍乾燥；
所述的抗c-肽多克隆抗體的製備方法，具體包含如下步驟：
選取兩隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡3～4個月，體重1.5～2公斤；用pbs緩衝液將上述c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑混合進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1～2ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1～2ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫3～5次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於0～10℃靜置12～15h，然後以8000～10000r/min的離心速度，離心分離5～10min，分離取上清液，得到抗c-肽多克隆抗體；
所述的pbs緩衝液濃度為0.01mol/l，ph為7.4；
所述的抗c-肽多克隆抗體在製備c-肽快速免疫檢測產品中的應用；
本發明的原理：
首先，本發明採用間接偶聯法以c-肽作為半抗原與載體蛋白多聚賴氨酸(pll)偶聯製得抗原，其中，偶聯後所獲不同分支的map，其結構的基本組成均為七聚賴氨酸的map核心結構加上不同分支的c肽，相互之間的差別只是不同數目的c肽線性肽，故不同分支的map之間的極性差異不大，用rp-hplc層析很難將它們完全進行分離，已成為多肽合成後純化的難題；本發明在製得c-肽免疫抗原粗品中引入琉基，然後與光敏化合物反應，與光敏化合物反應的完整肽段(含琉基)就可以通過引入的琉基相互作用而被吸附，其餘的不完整肽鏈及雜質就會被洗掉，將多肽進行紫外光照射消解，光敏基團與多肽的連接處會發生斷裂，從而得到純化後的完整肽(c-肽免疫抗原)。
第二，本發明提供的抗c-肽多克隆抗體的提取及純化採用了較為安全的方法，即採用辛酸-硫酸銨沉澱法純化多克隆抗體，純化效果好，得到的抗c-肽多克隆抗體純淨。
與現有的方法相比，本發明具有以下優點及有益效果：
(1)本發明製得的c-肽免疫抗原純度高，結構穩定。
(2)本發明製得的抗c-肽多克隆抗體具有較強特異性。
(3)本發明採用採用辛酸-硫酸銨沉澱法純化抗c-肽多克隆抗體，純化效果好，得到的抗c-肽多克隆抗體純淨，純度可達到90％以上。
(4)本發明製得的抗c-肽多克隆抗體可用於檢測人體血清中的c-肽，以此判斷糖尿病分型；可用於c-肽的快速免疫檢測，具有良好的應用價值。
(5)本發明提供的合成方法簡便，成本低廉。
附圖說明
圖1是本發明製得的c-肽免疫抗原結構圖。
圖2是實施例6製得的抗c-肽多克隆抗體效價圖。
圖3是不同純化方法純化得到的抗c-肽多克隆抗體的電泳圖，其中，1：實施例6純化得到的抗c-肽多克隆抗體，2：對比實施例1純化得到的抗c-肽多克隆抗體，3：對比實施例2純化得到的抗c-肽多克隆抗體。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1～3中pbs緩衝液濃度為0.1mol/l，ph為7.0；
實施例4～6以及對比實施例1～2中緩衝液濃度為0.01mol/l，ph為7.4；
實施例1c-肽免疫抗原的合成
(1)8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂的合成
稱量0.11g王樹脂(約0.1mmol)，再按照樹脂∶胺基酸＝1:7的反應比例稱量供3次反應的賴氨酸，在abi431多肽合成儀上設置標準程序進行偶聯合成：以dcm溶漲樹脂，然後按照去保護、活化、偶聯步驟，依次連接第1級到第3級賴氨酸，得到8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂。
(2)樹脂裂解和去保護
將步驟(1)製得的8分支map核心結構七聚賴氨酸樹脂放入10ml圓底燒瓶中，倒入5ml預先配製的裂解試劑(tfa900ml/l、苯甲硫醚50ml/l、二巰基乙烷30ml/l、苯甲醚20ml/l)，密閉，旋轉攪拌反應2h；反應後將反應液倒出過濾，收集濾液，將濾液進行低壓旋轉濃縮，濃縮物以三蒸水溶解，然後加入乙醚(與水體積相同)，震蕩混合，萃取水相，得到七聚賴氨酸水溶液；
(3)七聚賴氨酸的分離與純化
在watersdelta600高效反相液相色譜儀上，選用c18製備柱(phenomenex，300i，15μm，id4.6mm×250mm)，以梯度洗脫方式對步驟(2)製得的七聚賴氨酸水溶液進行分離，其中，流動相a為：1ml/ltfa/h2o，流動相b為：1ml/ltfa/乙晴；486檢測器檢測280nm吸收值，收集主峰析出液，低壓旋轉濃縮，直至剩餘約5ml時停止，然後冷凍乾燥過夜，最後獲得的白色凍乾粉即為七聚賴氨酸；
(4)mbs連接c-肽與七聚賴氨酸
將0.002mmol七聚賴氨酸與1mlpbs緩衝液混合，得到七聚賴氨酸溶液；稱取10mgmbs，溶於100μldmf中，得到mbs溶液；攪拌狀態下，將mbs溶液緩慢滴加到七聚賴氨酸溶液中，加完後，於室溫中攪拌反應2h，得到mbs活化的七聚賴氨酸；將60mgc-肽(約0.035mmol)溶解於2mlpbs緩衝液(c-肽：七聚賴氨酸≥16：1)中，攪拌狀態下，將c-肽溶液滴加到mbs活化的七聚賴氨酸中，加完後於室溫中攪拌反應3h，得到c-肽免疫抗原粗品；
(5)在-18℃鹽水浴，氮氣保護下，將100μl甲基嗎啡啉和100μl氯甲酸異丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反應8min，其中，氯甲酸異丁酯的滴加速度為25滴/min；加入100mg乙酸酐，在-18℃鹽水浴，氮氣保護下，繼續反應1.2h，得到反應產物1；然後將反應產物1從鹽水浴中取出，室溫繼續反應25min，得到反應產物2；在反應產物2中加入水和乙酸乙酯進行萃取2次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入質量分數為10％的碳酸氫鈉溶液進行萃取2次，將fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水進行萃取2次，將殘留的碳酸氫鈉洗出；加入無水硫酸鈉，除去乙酸乙酯相中殘留水分；除去無水硫酸鈉，乙酸乙酯相濃縮，加入2倍fmoc-cys-oh質量的矽膠，混勻，並乾燥；
(6)將步驟(5)製得的產物裝柱，步驟(4)製得的c-肽免疫抗原粗品溶於pbs緩衝液，然後使用中壓8mpa過柱，採用pbs緩衝液為洗脫劑，收集含目標峰的流份；將得到的流份與等體積的乙醚混合，收集沉澱物；沉澱物與4-甲基-3-硝基苯胺反應，產物用pbs緩衝液洗滌；洗滌後的產物在365nm紫外光下照射45min，得到c-肽免疫抗原(圖1)。
實施例2c-肽免疫抗原的合成
本實施例步驟(1)、(2)、(3)、(4)具體操作同實施例1；
(5)在-15℃鹽水浴，氮氣保護下，將100μl甲基嗎啡啉和100μl氯甲酸異丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反應5min，其中，氯甲酸異丁酯的滴加速度為30滴/min；加入100mg乙酸酐，在-15℃鹽水浴，氮氣保護下，繼續反應1h，得到反應產物1；然後將反應產物1從鹽水浴中取出，室溫繼續反應15min，得到反應產物2；在反應產物2中加入水和乙酸乙酯進行萃取3次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入質量分數為10％的碳酸氫鈉溶液進行萃取3次，將fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水進行萃取3次，將殘留的碳酸氫鈉洗出；加入無水硫酸鈉，除去乙酸乙酯相中殘留水分；除去無水硫酸鈉，乙酸乙酯相濃縮，加入2倍fmoc-cys-oh質量的矽膠，混勻，並乾燥；
(6)將步驟(5)製得的產物裝柱，步驟(4)製得的c-肽免疫抗原粗品溶於pbs緩衝液，然後使用中壓10mpa過柱，採用pbs緩衝液為洗脫劑，收集含目標峰的流份；將得到的流份與等體積的乙醚混合，收集沉澱物；沉澱物與4-甲基-3-硝基苯胺反應，產物用pbs緩衝液洗滌；洗滌後的產物在365nm紫外光下照射30min，得到c-肽免疫抗原。
實施例3c-肽免疫抗原的合成
本實施例步驟(1)、(2)、(3)、(4)具體操作同實施例1；
(5)在-20℃鹽水浴，氮氣保護下，將100μl甲基嗎啡啉和100μl氯甲酸異丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反應10min，其中，氯甲酸異丁酯的滴加速度為20滴/min；加入100mg乙酸酐，在-20℃鹽水浴，氮氣保護下，繼續反應1.5h，得到反應產物1；然後將反應產物1從鹽水浴中取出，室溫繼續反應30min，得到反應產物2；在反應產物2中加入水和乙酸乙酯進行萃取2次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入質量分數為10％的碳酸氫鈉溶液進行萃取2次，將fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水進行萃取2次，將殘留的碳酸氫鈉洗出；加入無水硫酸鈉，除去乙酸乙酯相中殘留水分；除去無水硫酸鈉，乙酸乙酯相濃縮，加入2倍fmoc-cys-oh質量的矽膠，混勻，並乾燥；
(6)將步驟(5)製得的產物裝柱，步驟(4)製得的c-肽免疫抗原粗品溶於pbs緩衝液，然後使用中壓5mpa過柱，採用pbs緩衝液為洗脫劑，收集含目標峰的流份；將得到的流份與等體積的乙醚混合，收集沉澱物；沉澱物與4-甲基-3-硝基苯胺反應，產物用pbs緩衝液洗滌；洗滌後的產物在365nm紫外光下照射30min，得到c-肽免疫抗原。
實施例4多克隆抗體的製備
實驗採用2隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡3個月，體重1.5～2公斤，飼養在標準動物房內，連續觀察一周，確定其狀態良好後，開始進行免疫：
(1)用新鮮配製的pbs緩衝液將實施例1製得的c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射2ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射2ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫4次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於4℃冰箱靜置14h，然後以10000r/min的離心速度，離心分離10min，分離取上清液；
(2)將步驟(1)所獲取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然後8000r/min，離心30min，收集上清液，將濾液用10×pbs緩衝液混合，在4℃下緩慢加入硫酸銨粉末，使其終濃度為45％w/w；8000r/min，離心30min，收集沉澱；沉澱用8mlpbs緩衝液溶解，置於pbs溶液中透析3天，12小時換一次液；將透析過的多克隆抗體在冷凍乾燥機中凍幹，即得抗c-肽多克隆抗體粉末，-20℃保存。
實施例5多克隆抗體的製備
實驗採用2隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡4個月，體重1.5～2公斤，飼養在標準動物房內，連續觀察一周，確定其狀態良好後，開始進行免疫：
(1)用新鮮配製的pbs緩衝液將實施例1製得的c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫5次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於0℃冰箱靜置15h，然後以8000r/min的離心速度，離心分離10min，分離取上清液；
(2)將步驟(1)所獲取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然後10000r/min，離心15min，收集上清液，將濾液用10×pbs緩衝液混合，在2℃下緩慢加入硫酸銨粉末，使其終濃度為40％w/w；10000r/min，離心15min，收集沉澱；沉澱用5mlpbs緩衝液溶解，置於pbs溶液中透析4天，10小時換一次液；將透析過的多克隆抗體在冷凍乾燥機中凍幹，即得抗c-肽多克隆抗體粉末，-20℃保存。
實施例6多克隆抗體的製備
實驗採用2隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡3個月，體重1.5～2公斤，飼養在標準動物房內，連續觀察一周，確定其狀態良好後，開始進行免疫：
(1)用新鮮配製的pbs緩衝液將實施例1製得的c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1.5ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射51.ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫3次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於10℃冰箱靜置12h，然後以10000r/min的離心速度，離心分離10min，分離取上清液；
(2)將步驟(1)所獲取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然後9000r/min，離心20min，收集上清液，將濾液用10×pbs緩衝液混合，在3℃下緩慢加入硫酸銨粉末，使其終濃度為42％w/w；9000r/min，離心20min，收集沉澱；沉澱用10mlpbs緩衝液溶解，置於pbs溶液中透析3天，10小時換一次液；將透析過的多克隆抗體在冷凍乾燥機中凍幹，即得抗c-肽多克隆抗體粉末，-20℃保存。
對比實施例1
實驗採用2隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡3個月，體重1.5～2公斤，飼養在標準動物房內，連續觀察一周，確定其狀態良好後，開始進行免疫：
(1)用新鮮配製的pbs緩衝液將實施例1製得的c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1.5ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射51.ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫3次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於10℃冰箱靜置12h，然後以10000r/min的離心速度，離心分離10min，分離取上清液；
(2)將步驟(1)所獲取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然後9000r/min，離心20min，收集上清液，將濾液用10×pbs緩衝液混合，9000r/min，離心20min，收集沉澱；沉澱用10mlpbs緩衝液溶解，置於pbs溶液中透析3天，10小時換一次液；將透析過的多克隆抗體在冷凍乾燥機中凍幹，即得抗c-肽多克隆抗體粉末，-20℃保存。
對比實施例2
實驗採用2隻紐西蘭大白兔，雌性，月齡3個月，體重1.5～2公斤，飼養在標準動物房內，連續觀察一周，確定其狀態良好後，開始進行免疫：
(1)用新鮮配製的pbs緩衝液將實施例1製得的c-肽免疫抗原配製成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進行乳化使其完全混為一相，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射1.5ml；首次免疫兩周後進行第一次加強免疫，用等體積的弗氏不完全佐劑與免疫抗原溶液混合乳化，採用皮下多點注射的免疫方式對每隻兔子注射51.ml，以後每隔兩周進行加強免疫一次；加強免疫3次後，於最後一次免疫一周後對兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置於10℃冰箱靜置12h，然後以10000r/min的離心速度，離心分離10min，分離取上清液；
(2)將步驟(1)所獲取的血清用10×pbs緩衝液混合，在3℃下緩慢加入硫酸銨粉末，使其終濃度為42％w/w；9000r/min，離心20min，收集沉澱；沉澱用10mlpbs緩衝液溶解，置於pbs溶液中透析3天，10小時換一次液；將透析過的多克隆抗體在冷凍乾燥機中凍幹，即得抗c-肽多克隆抗體粉末，-20℃保存。
效果實施例
採用間接elisa方法檢測兔子血清中抗體的效價，包括以下步驟：
(1)包被：將包被抗原bsa偶聯的c肽用碳酸鹽緩衝液稀釋至5μl/ml並充分混勻，使用移液槍100μl/孔添加到微孔板中，置於37℃水浴鍋溫浴1小時後，再放置於4℃冰箱中包被過夜；
(2)清洗：將孔中的液體甩幹，用pbst洗滌液清洗3次，再將孔中剩餘的液體在吸水紙上拍幹；
(3)封閉：用含濃度為30mg/ml的脫脂奶粉磷酸緩衝溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃溫浴1小時，重複步驟(2)；
(4)競爭反應：將實施例6製得的抗c-肽多克隆抗體用磷酸緩衝液倍比稀釋，濃度依次為1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000，以100μl/孔加入到微孔板中，同時增加空白對照，37℃溫浴1小時，重複步驟(2)；
(5)加酶標二抗：加入以磷酸緩衝液稀釋5000倍數的酶標二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置於37℃溫浴1小時，重複步驟(2)；
(6)顯色：在已配製得10ml底物緩衝液中，加入10μl30％過氧化氫並充分混勻，按照100μl/孔加到微孔板中，置於37℃下避光孵育15分鐘。
終止和讀數：向酶標版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸終止反應。設定酶標儀測定波長參數為450nm，並測定其光密度值。陽性的判定原則：樣品孔od值大於空白處讀數的2.1倍即可判定為陽性，結果見圖2。
圖3是不同提純方法製得的抗體的電泳圖，從圖中可以看出，實施例6辛酸-硫酸銨沉澱法提純的抗體條帶很純，有重鏈和輕鏈；而單獨的辛酸法(對比實施例1)和硫酸銨法(對比實施例2)雜蛋白是相對較多，不止有重鏈和輕鏈。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。