不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及克隆方法
2023-04-25 08:14:01 1
不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及克隆方法
【專利摘要】本發明涉及一種不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發明的基因來源於不動桿菌屬細菌，為SEQIDNO1所示的鹼基序列。該基因編碼穀氨醯胺合成酶，能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，能恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
【專利說明】不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及克隆方法。
【背景技術】
[0002]氮元素是生物體必須也是需求量最大的礦物質元素，用於合成生物體所需的胺基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮的利用在農作物生產中佔非常重要的地位，植物氮代謝及其調控一直備受全世界關注，氮肥利用率低及過量施用氮肥造成水環境汙染的問題也是世界性難題。正因為如此，如今需要降低氮肥的使用量，並尋找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保證在產量不下降的前提下，減少氮肥的使用量。
[0003]對於生物體的生長和發育而言，氮素的同化是個十分重要的生理過程，無機氮必須同化為穀氨醯胺形式的有機氮才能被生物體所吸收和利用。穀氨醯胺合成酶(glutaminesynthetase, GS)是GS-GOGAT氮同化路徑上的關鍵酶，它和穀氨酸合成酶聯合作用，催化NH4+同化成穀氨醯胺，而穀氨醯胺又在穀氨酸合酶的催化下，將其醯胺轉移到α -酮戊二酸上，從而生成兩分子的穀氨酸。穀氨醯胺在生物體內含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界的無機氮元素也通過這個途徑進入生物體內的整個氮素循環。因此穀氨醯胺合成酶在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。
[0004]土壤是微生物的大本營，含有種類豐富的細菌類群。來自細菌的穀氨醯胺合成酶涵蓋了目前所發現的三大 類穀氨醯胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的穀氨醯胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優越性。不動桿菌sp.)是一種常見的土壤細菌，其穀氨醯胺合成酶基因的克隆及功能鑑定對於新型氮高效基因的分離並應用於逆境下農作物的生理性狀改善有著潛在的重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一在於提供了一種不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因。
[0006]本發明的目的之二在於提供了該基因的編碼蛋白。
[0007]本發明的目的之三在於提供該基因的克隆方法。
[0008]本發明的目的之三在於提供該基因在恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力中的應用。
[0009]一種不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因的序列為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。
[0010]一種上述的基因編碼的蛋白，其特徵在於該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨
基酸序列。
[0011]一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。
[0012]一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組載體。
[0013]一種克隆上述的不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為:參考NCBI資料庫中的不動桿菌屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計了兼併引物，從河岸土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增得到穀氨醯胺合成酶基因；所述的兼併引物為:AcnebIF: 5，-ATGAGCATGGCGAACAAGGT-3，和 AcnebIR: 5，-TTACARGCTRTARTACATAT-3，。
[0014]上述的不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的條件為:94°C 5 分鐘；94°C 50 秒，48°C 50 秒，72°C I 分 30 秒，25 個循環；72°C 8 分鐘。
[0015]本發明的互補實驗驗證了不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，能恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1和圖2為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白亞細胞定位預測圖，表明該編碼蛋白定位在細胞質的可能性很大；
圖3為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白的進化分析圖，表明該編碼蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族；
圖4為本發明的不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養基中添加穀氨醯H鑄X Acinebl和未轉入的菌株均可以正常生長； 圖5為本發明的穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養基中未添加穀氨醯胺，只有轉入h.沉的菌株可以正常生長。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照製造廠商所建議的條件。
[0018]實施例一 -.Acinebl基因全長編碼區的克隆與分析:
不動桿菌iAcinetobacter spp.)主要分布於水體和土壤中，易在潮溼環境中生存。採集河岸土壤樣本少量，取I克土壤，抽提其宏基因組DNA。通過分析NCBI資料庫中的不動桿菌屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計了兼併引物，該引物為=AcneblF:5』 -ATGAGCATGGCGAACAAGGT-3』 和 AcneblR: 5』 -TTACARGCTRTARTACATAT-3』。用這對引物從所抽提的土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個穀氨醯胺合成酶基因，命名為Acinebl。將該基因插入克隆載體pMD18_T，挑選相應的陽性克隆，對該基因進行了全長DNA測序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測序結果表明.Acinebl的ORF全長1416bp。DNAstar軟體的分析結果顯示:該基因編碼一個含471個胺基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為53kDa，等電點為5.05。利用Cell-PLoc網站的Gneg-PLoc 2.0以及Softberry網站的ProtComp Version 9.0軟體對基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測,預測數據顯示該蛋白定位在細胞質的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的穀氨醯胺合成酶的定位信息相符。進化分析表明基因編碼的蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族，參見圖30
[0019] 實施例二 -.Acinebl在大腸桿菌突變體中的功能分析
通過DNA測序分析，挑選如i/?d7基因ORF轉錄方向與載體pMD18-T上乳糖啟動子轉錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質粒,並轉入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請參見文獻:Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriol, 1992, 174(2):650-654.。該突變體由於缺失編碼穀氨醯胺合成酶的基因，所以在不添加穀氨醯胺的培養基中無法正常生長。該菌株購買於E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明Acinebl能夠互補大腸桿菌突變體ET6017的穀氨醯胺合成酶缺失表型。Acinebl的表達，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加穀氨醯胺的培養條件下生長。該互補實驗在大腸桿菌中驗證了基因所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
[0020]儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
【權利要求】
1.一種不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的鹼基序列。
2.一種根據權利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特徵在於該蛋白的序列為SEQ IDN0.2所示的胺基酸序列。
3.—種重組表達載體，該重組載體含有根據權利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞,該宿主細胞含有根據權利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據權利要求1所述的不動桿菌穀氨醯胺合成酶基因的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為:參考NCBI資料庫中的不動桿菌屬細菌的穀氨醯胺合成酶基因序列，設計了兼併引物，從河岸土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增得到穀氨醯胺合成酶基因；所述的兼併引物為:Acneb IF: 5 』 -ATGAGCATGGCGAACAAGGT-3 』 和 Acneb IR:5』 -TTACARGCTRTARTACAT AT - 3』。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的PCR擴增的條件為:94°C5分鐘；94°C 50 秒，48°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個循環；72°C 8 分鐘。
【文檔編號】C12N15/52GK103966240SQ201410130424
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2013年4月15日
【發明者】朱晨光, 王欣珍, 陸定, 王偉, 唐遠平, 梅冰, 宋任濤 申請人:上海大學