中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達方法
2023-04-26 04:15:26
專利名稱：中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達方法
技術領域：
本發明涉及基因的表達方法，特別涉及到中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法。
背景技術：
脫皮是甲殼動物生長和發育的標誌特徵，它貫穿甲殼動物個體發育的始終，它受神經系統和內分泌系統共同調節。這個調節過程表現為兩種互為拮抗的激素作用。蛻皮激素的刺激作用和M IH的抑制作用。蟹類眼柄中所產生的MIH含量極微，並且家族其它神經肽在大小以及一級結構上的相似性限制了直接從動物體內分離並純化MIH蛋白。因此，常常用原核及真核蛋白表達系統來生產較大量的重組MIH(Yodmuang et al. , 2004 ；Lee and Watson, 2002 ；0hira et al.，1999 ;Sun，1997)。宋霞等(2003,2004)先後報導了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素基因Ers-MHII的部分cDNA序列及基因組DNA全序列(GeBnank檢索號 AY310313)。Ers-MIHI成熟肽包括75個胺基酸，相對分子質量(M) r約為7. 8kD，屬於小分子多肽。本實驗室的郭豫傑和姚燕曾將Ers-MIHI基因成熟肽的cDNA片段連接到原核表達載體PGEX-4T-1載體和pET-28a(+)載體上，在大腸桿菌中進行了融合表達(郭豫傑等，2004 ； 姚燕等，2006)，成功獲得融合蛋白。但以pGEX-4T-l為載體獲得的融合蛋白N端帶有26kD 的GST，龐大的標籤蛋白可能導致目的蛋白的空間構象不正確，因此需要在純化後用酶切去除標籤蛋白部分。但經凝血酶切除GST後獲得的目的蛋白一般N端殘留兩個胺基酸，而且切割後目的蛋白損失量較大，切割效率不高，從而導致融合蛋白往往檢測不出活性，影響了目的蛋白活性及功能的研究。而以pET-28a(+)為載體的融合蛋白沒有龐大的標籤蛋白，以 6His-tag為標籤，不僅便於純化而且分子量小，無免疫原性，不會影響被修飾蛋白質的生理 PH值，對目的蛋白的分泌、構象或胞內摺疊及純化後的功能活性幾乎無影響，不用設法切除 (王華等，2002)。但由於目的蛋白在原核細胞內表達不穩定，易被細菌蛋白酶降解。
基因工程的發展使許多微量蛋白大量表達，也使許多以前難以製備的蛋白得到表達成為可能。大腸桿菌E. coli表達系統是目前為止最為有效的和方便的表達系統，可以進行許多異源蛋白的高效表達。但在進行一些蛋白的表達時，會產生許多困難。外源蛋白在 E. coli中的大量表達是以不溶性的包涵體的形式存在於細胞內，而包涵體的分離破碎通常會造成目的蛋白的失活；真核蛋白在E. coli的表達會有更多的問題由於真核基因通常含有內含子，在E. coli中不能進行正確的剪切和拼接，因此必須表達它的cDNA序列。另外， 真核生物的許多蛋白都是糖蛋白，用E. coli作為表達宿主，不能對真核蛋白進行正確的糖基化等翻譯後加工，很難得到有活性的真核表達系統。發明內容
I、發明要解決的技術問題
針對現有對中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達上的缺陷和不足，特別畢赤酵母表達系統對許多蛋白表達不理想，甚至不表達，要實現中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核在畢赤酵母中的成功表達併兼顧其實用性和安全性。必須充分考慮影響表達和應用的以下因素(I)目的基因特性的改造；(2)啟動子的選擇；(3)糖基化的消除；(4)提高產物的穩定性，本發明提供了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I(Ers-MIHl)基因的真核表達方法，獲得實現生長發育和繁殖的人工調控奠定重要的基礎。
2、技術內容
(I)發明原理
巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是目前應用最為廣泛的酵母表達系統。由於該系統比原核生物及其它真核生物表達系統具有以下優點，已被廣泛地用於外源蛋白的表達。
①具有強有力的乙醇氧化酶(Alochol 0xidaSe，A0Xl)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；
②作為真核表達系統,可對表達的蛋白進行翻譯後的加工與修飾,從而使表達出的蛋白具有生物活性；
③營養要求低，生長快，培養基廉價，便於工業化生產；
④具有強烈的好氧生長偏愛性，使得它既能高密度發酵生長，亦有利於工業放大生產，可進行細胞高密度培養，此外，Pichia pastoris能夠忍耐較寬的pH範圍(3. 0-7. O)， 利於在發酵過程中通過調節PH來抑制蛋白水解酶的活性，防止表達的外源蛋白的降解；
⑤在P. Pastori中表達的蛋白既可存在於細胞內，又可分泌到胞外；
⑥糖基化程度低，其糖基化位點與哺乳類細胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，而且表達產物不含有毒物質和致熱原；
⑦胞內表達的分選和區域化。.
畢赤酵母的表達載體為整合型質粒，質粒載體與酵母染色體具有同源序列，線性化的質粒通過同源序列而整合到酵母染色體上。質粒PPIC9上帶有編碼組氨酸脫氫酶的基因HIS4，而宿主菌GSl 15為HIS4缺陷型，因此只有質粒轉化菌才能在缺少組氨酸的MD平板上生長。畢赤酵母一般先在含有甘油的培養基中生長，培養至高密度後，再以甲醇為唯一碳源，誘導表達外源蛋白，這樣可以提高表達產量(Cregg et al, 1993 ；Romanos et al, 1992)。
上述特點使得巴斯德畢赤酵母表達系統為中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIH) I 基因的表達提供了一個良好條件，利用酵母表達載體合成重組多肽的方法獲得具有生物活性的多肽，對於研究甲殼類眼柄神經激素的結構、功能和作用方式起到重大的作用。為進一步認識中華絨螯蟹生長蛻皮調控機制，最終實現生長發育和繁殖的人工調控奠定重要的基礎。
(2)技術方案
中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIHl)基因的真核表達方法，其步驟包括為
步驟一中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIHl)基因的真核表達載體的構建
(I)引物的設計；
(2) PCR 反應；
⑶TA克隆；
(4)質粒提取；
(5)酶切連接轉化；
(6)陽性克隆的鑑定；
(7)重組質粒的鑑定；
步驟二 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I(Ers-MIHl)基因的真核表達。
(I)貯存液的配製；
(2)培養基的配製；
(3)菌種的復甦;
(4)質粒的提取；
(5)重組質粒pPIC9-MIHl和pPIC9的線性化；
(6)酵母感受態細胞的製備；
(7)MIHl基因的電轉化；
(8)酵母轉化菌的鑑定；
(9)MIHl表達陽性克隆的篩選；
(10)最佳誘導時間的確定；
(11)篩選菌株的SDS-PAGE檢測；
(12)重組MIHl的大規模誘導表達。
3.有益效果
(I)本發明選擇較常用的PPIC9作為真核表達載體，畢赤酵母表達載體的多克隆位點位於醇氧化酶基因-I (alcohol oxidasel, A0X1)的啟動子(PAOXl)的下遊，外源基因MIHl克隆至多克隆位點後，Paoxi可啟動外源基因的表達。
(2)為了使表達的蛻皮抑制激素與天然蛋白質胺基酸序列一致，本研究設計了一對引物，直接將目的基因連接在信號肽編碼序列下面，除掉了信號肽切割位點與多克隆位點之間一段序列，使酵母表達的外源蛋白質MIHl經KEX2蛋白酶切割信號肽後得到成熟的中華絨螯蟹脫皮抑制激素蛋白；同時為了便於利用Ni-NATHis. Bind樹脂(Novagen)純化表達的MIHl重組蛋白，在下遊引物的終止密碼子前加了 I個6-His編碼區段。重組質粒 PPIC9-MIH1的成功構建為進一步的酵母真核表達MIH蛋白，確定MHI的生理活性和作用機制奠定了重要基礎。
(3)克服了過度糖基化、表達周期過長及一些中華絨螯蟹蛻皮抑制激素難以在該系統獲得有效表達。
(4)成功表達了 MIH蛋白，為進一步了解早熟蟹性腺提早發育的內在機理，了解蟹類蛻皮腺的功能機制並為進一步制定控制河蟹性早熟的技術措施提供理論基礎
圖I為PCR產物瓊脂糖凝膠電泳(M =DNA分子量標記DL2000 ;1_5 =PCR產物)；
圖2為重組克隆載體的酶切鑑定(M =DNA分子量標記DL2000 ；1 =NotI和XhoI雙酶切後載體PPIC9-MIH1)；
圖3為重組質粒pPIC9-MIHl接頭處順序；
圖4 酵母基因組 DNA (M T14 marker ;1_10 及 13-21 為 Gsll5-pPIC9_MIHl 的基因組)；
圖5-1能表達重組蛋白的MIHl重組子的篩選(以Pichia克隆的基因組為模板， 用引物5，AOXl primer和3，AOXl primer進行PCR的產物。M =DNA分子量標記；Ianel :以 GSl 15的基因組為模板進行PCR的產物；lane 2,3,4 :以GS115_pPIC9的基因組為模板進行 PCR的產物；lane 5-16 :以His+GS115-pPIC9_MIHl克隆的基因組為模板進行PCR的產物； Iane 9,10,12,16 表不這 4 個克隆為 His+Muts (slow methanol utilization)基因型的重組子，而lane 6，7，13，14這4個為假陽性His+克隆，lane 2，5，8，11，15沒有PCR成功)；
圖5-2能表達重組蛋白的MIHl重組子的篩選(以Pichia克隆的基因組為模板， 用引物5，AOXl primer和3，AOXl primer進行PCR的產物。M DNA分子量標記；lane I 以GSl 15的基因組為模板進行PCR的產物；lane 2，3，4 :以GS115_pPIC9的基因組為模板進行PCR的產物，為假陽性His+克隆；lane 5-24 :以His+GS115-pPIC9_MIHl克隆的基因組為模板進行PCR的產物；lane 5，6，10，13，14，17，19，24表示這8個克隆為His+Muts (slow methanol utilization)基因型的重組子，而 Iane 7,8,9,11，12，15，16，18,20-23 這 12 個為假陽性His+克隆。)；
圖6能表達重組蛋白MIHl重組子的PCR鑑定(以Pichia克隆的基因組為模板，利用目的蛋白的特異性引物MIHl-primer和引物5, AOXl primer和3, AOXl primer進行PCR 的產物。M =DNA分子量標記；lane 1，2 :以His+GS 115-pPIC9_MIHl克隆的基因組為模板， 引物 5，A0X1 primer 和 3，A0X1 primer 進行PCR 的產物；lane 3 :以 pPIC9_MIHl 的線性化基因組為模板，用引物5，AOXl primer和3，AOXl primer進行PCR的產物作為陽性對照；lane 4 :為上述反應的陰性對照；lane 5 :以GS115的基因組為模板，特異性引物MIHl-primer進行PCR的產物，以下擴增反應均用此引物；lane 6 以GS115_pPIC9的基因組為模板進行 PCR的產物；lane 7-23 :以His+GS115-pPIC9_MIHl克隆的基因組為模板進行PCR的產物； lane7,8,12,16,17,19, 21 表不這 7 個克隆為 His+Muts (slow methanol utilization)基因型的重組子，都含有目的基因MIHl片段，而Iane 9，10，11，13，14，15，18，20，22，23這10個為假陽性His+克隆)；
圖7高效分泌表達MIHl酵母菌株的Tricine-SDS-PAGE分析(M :蛋白質分子量標準；lane I GS115/pPIC9的表達產物；lane 2 :剛加入甲醇誘導時(Oh)所得的分泌蛋白； lane 3 :24h所得的分泌重組蛋白；lane 4 :48h所得的分泌重組蛋白；lane 5 :72h所得的分泌重組蛋白；lane 6 :96h所得的分泌重組蛋白；lane 7 :不加甲醇誘導培養96h時所得的分泌蛋白)；
圖8 Pichia重組子表達產物的Tricine-SDS-PAGE分析(M :蛋白質分子量標準； lane I GS115 的表達產物；lane 2 GS115/pPIC9 的表達產物；lane 3-6 陽性 HIS+Muts 克隆的表達產物能表達重組MIHl蛋白；lane 7,8 :不加甲醇誘導的陽性HIS+Muts克隆的表達產物)。
具體實施方式
實施例一
步驟一中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIHl)基因的真核表達載體的構建
I. I準備實驗材料
I. I. I菌株、質粒和試劑
大腸桿菌(Escherichia coli) DH5- α菌株為本實驗室保存。畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115 菌株及質粒 pPIC9。
1.1.2酶與實驗試劑
Plasmid Mini Kit (50)和DNA回收試劑盒(上海華舜)，Taq DNA聚合酶和T4DNA 連接酶(Promega), Not I、Xho I 限制性內切酶，DNA marker DL2000 (Takara)。其它分子生物學試劑購自Sigma公司和華美生物工程公司等。
1.1.3 設備
15417R型高速離心機(Eppendorf) ;TH2_95H恆溫振蕩器(江蘇太倉市醫療器械廠)；Multi TempIII 水浴鍋(Pharmacia) ;H_3560 自動高壓滅菌鍋(Tsao Hisn)； DS7500UVP凝膠成像系統(Upland) ;SW_CJ-10超淨工作檯(蘇州淨化設備廠)；SW_CJ-1F 淨化工作檯(蘇淨集團蘇州泰安空氣技術有限公司)；PYX-DHS-35X40-BS型隔水式電熱恆溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；DG30/7-IAHG202-lA型電熱乾燥箱(南京實驗儀器廠)； 純水儀(Pharmacia Biotech)。
2. 2中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因(Ers-MIHl)的表達載體構建步驟
2. 2. I中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因(Ers-MIHl)的表達載體構建
本試驗選擇PPIC9作為真核表達載體，該質粒中帶有組氨酸脫氫酶的基因HIS4,而宿主菌GS115為HIS4缺陷型。因此只有質粒轉化菌才能在缺少組氨酸的MD平板上生長。
根據已知的中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因(Ers-MIHl)序列合成引物(上遊引物含有Xho I位點，下遊引物含有Not I位點)，以重組質粒pGEX-4T-MIHl為模板，PCR擴增Ers-MIHl成熟肽片段(引物中加入Not I，Xho I及其他酶切識別位點)後，再切膠純化成熟肽得到目的基因MIHl。與pMD18-T載體進行連接，轉化大腸桿菌DH5 α菌株。將陽性克隆測序鑑定後，將陽性克隆含MIHl-pMD 18-T的菌株稀釋擴增，抽提質粒。並用Xho I和 Not I進行雙酶切，同時與畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9空載體也用Xho I和Not I進行雙酶切，酶切產物分別進行回收純化。再用T4DNA連接酶將兩者連接，得到PPIC9-MIH1重組質粒，用常規CaCl2法轉化大腸桿菌JM109菌株，將陽性克隆進行鑑定。包括菌落PCR鑑定，抽提質粒後進行雙酶切鑑定，出現陽性條帶的克隆再進行基因測序驗證。
2. 2. 2表達載體的構建
2. 2. 2. I引物的設計
根據中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因(Ers-MIHI)的成熟肽編碼區cDNA序列和質粒PPIC9的多克隆位點(MCS)設計一對特異性PCR引物
PIC-MIH-L :5』 -GCA CGA CTC GAG AAA AGA GGA ATC ATC AAC GCC-3』
PIC-MIH-R :5』TGT AAT GCG GCC GC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTG CCC GAG GAT GCT-Sj
其中上遊引物包含I個Xho 1、1個KEX2蛋白酶識別位點和MIH基因的前15個核苷酸序列，箭頭位置為酵母α因子信號肽的切割位點。下遊引物包含MIH基因編碼區的最後15個核苷酸序列、I個6-His編碼區段(便於後續的純化工作)、1個Not I識別位點及一個翻譯終止密碼子。
2. 2. 2. 2PCR 反應
PCR 反應體系 30 μ I :10XPCR Buffer 3 μ 1，濃度為 IOmM 的兩條引物各 I μ 1，2mM的 dNTPs 2 μ I，MgCl22 μ I，5U/ μ I 的 Taq 酶 O. 2 μ I，模板為 pGEX-4T_MIHl 質粒 O. 2 μ I (此重組質粒為本實驗室構建，郭豫傑等，2004)，加水補足到30 μ I。獲得的擴增產物切膠純化後進行TA克隆並測序鑑定。
PCR循環條件94°C先預變性4min，按以下循環參數進行30個循環95°C變性 40s，62 °C退火40s，72 °C延伸40s ;最後72°C保溫IOmin。取3μ I PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統上紫外掃描，拍照。產物用PCR產物凝膠純化試劑盒純化。
2. 2. 2. 3ΤΑ 克隆
PCR凝膠純化產物已經加A尾，將之插入pMD18_Teasy載體，克隆測序。按照摩爾比約為3-5 1的比例關係將純化後的PCR產物與pMD18-Teasy載體連接。反應體系pMD18_T vector O. 5 μ 1，純化產物4· 5 μ 1，solution〗5. 0 μ 1，總體系 10 μ 1，16°C過夜(長於 12h)。
將連接好的載體用CaCl2法轉化入克隆菌DH5- α中，平鋪於含Amp的LB固體培養板上，37°C培養過夜。挑取培養板上大而圓的單菌落，於含有Amp抗生素的液體LB培養基中，220-240rpm, 37°C培養過夜。
以菌液為模板，用通用引物Ml3和Rev進行PCR擴增，做初步鑑定。
反應條件菌液O. 2 μ 1，M13(10ymol/L) I. O μ 1，Rev (10 μ mol/L)) 10 μ 1， 10XBuerfr2. 0 μ I, Mg2+ (25mM) 2. 0 μ I, dNTP (2mM) 2. 0 μ I, Taq DNA polymeraseO. 2 μ I，加滅菌超純水至總體積為20 μ I。
反應參數95°C先預變性5min ;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；最後72°C延伸5min。陽性克隆送聯合基因公司測序鑑定。
2. 2. 2. 4 質粒提取
用質粒提取試劑盒Takara 的 Mini BEST Plasmid Purification Kit,分別抽提 DH5-a中保存的真核表達載體pPIC9的質粒和TA克隆裝入目的片段的pMD18-T_MIHl的質粒。
2. 2. 2. 5酶切連接轉化
(I)將獲得正確序列的陽性克隆pMD18T-MIHl提取質粒，並用Xho I和Not I進行雙酶切。同時PPIC9也用Xho I和Not I進行雙酶切。酶切體系如下
IOXHBuffer2μ12μ1Xho IΙμ Ιμ Noi IΙμ I μιBSA2μ12μ1TritonX-IOO2 μ!2μ1質粒ρΡΚ9 12μ pMD18-T-MlHl! 12μ1加水至總體積為20μ1
反應條件37°C8hr。
酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳後，用凝膠回收試劑盒分別回收純化目的片段和線性化的PPIC9。
(2)用T4DNA連接酶將兩者連接。連接體系如下
權利要求
1 .中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法，其步驟包括為 步驟ー中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達載體的構建 (1)引物的設計，根據中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的成熟肽編碼區CDNA序列和質粒pPIC9的多克隆位點設計ー對PCR引物， 其中上遊引物包含I個Xho 1、1個KEX2蛋白酶識別位點和MIH基因的前15個核苷酸序列，箭頭位置為酵母α因子信號肽的切割位點，下遊引物包含MIH基因編碼區的最後15個核苷酸序列、I個6-His編碼區段、I個Not I識別位點及一個翻譯終止密碼子；(2)PCR 反應；(3)TA克隆； (4)質粒提取； (5)酶切連接轉化； (6)陽性克隆的鑑定，用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R進行菌落PCR篩選陽性克隆； (7)重組質粒的鑑定，PCR產物電泳出現陽性條帶的克隆按照I:100的比例稀釋擴増，抽提質粒，按照引物設計的酶切位點做Xho I和Not I雙酶切鑑定；挑選雙酶切能出現陽性條帶的克隆，並送測序驗證，陽性菌落置於_20°C保種備用； 步驟ニ 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達 (1)貯存液的配製； (2)培養基的配製； (3)菌種的復甦，把已經鑑定為含陽性克隆重組質粒PPIC9-MIH1的保種克隆菌JM109及空載體PPIC9的保種菌株DH5 α按照I :100轉入新的含100 μ g/ml氨苄青黴素的LB液體培養液中37°C恆溫，22orpm搖床過夜； (4)質粒的提取，把過夜培養的菌液IOOOg離心5min收集細胞，用miniBESTPlasmidPurification kit試劑盒抽提重組質粒pPIC9_MIHl和pPIC9，_20°C保存備用，取2 μ I質粒用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測； (5)重組質粒pPIC9-MIHl和pPIC9的線性化，用限制性內切酶BglI分別對質粒PPIC9-MIH1和pPIC9進行單酶切反應，使其線性化，酶切反應體系為10XBuffer D10 μ 1，BglII I μ 1，質粒40 μ 1，補雙蒸水至100 μ 1，37°C水浴反應2小時，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用未酶切的質粒PPIC9-MIH1和pPIC9做對照，將已經線性化的pPIC9-MIHl和pPIC9用1%的瓊脂糖凝膠電泳後，分別用凝膠回收試劑盒回收純化； (6)酵母感受態細胞的製備； (7)MIHl基因的電轉化； (8)酵母轉化菌的鑑定； (9)MIHl表達陽性克隆的篩選； (10)最佳誘導時間的確定，取BMGY/BMMY培養基誘導的ー株重組酵母菌不同時段所取的誘導菌液I. 5ml, 40C，12000rpm離心lOmin，上清液用O. 75g硫酸銨沉澱，去上清液後，將沉澱與30 μ I SDS樣品緩衝液混合，100°C煮沸5min,各取20 μ I上樣，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測，考馬斯亮藍染色顯帶後，用凝膠成像系統分析，以確定最佳誘導時間； (11)篩選菌株的SDS-PAGE檢測； (12)重組MIHl的大規模誘導表達，步驟包括接種GS115/pPIC9-MIHl表達陽性克隆菌於IOml BMGY培養基中，30°C，250rpm搖床振蕩培養36hr後，至0D600>3. O ;按1%接種於1000ml BMGY培養基中，30°C，250rpm搖床振蕩培養36hr後，無菌條件下5000rpm離心IOmin,棄上清；在菌體沉澱中加入200ml BMMY培養基，振蕩混勻，繼續30°C，250rpm搖床振蕩培養培養；每隔24hr，取誘導菌液I. 5ml,4°C,12000rpm離心IOmin保存上清液於_20°C待用，然後添加甲醇至終濃度為O. 5%，共誘導4天；誘導結束時，分別取各菌株的誘導菌液I.5ml,4°C, 12000rpm離心IOmin保存上清液於_20°C以備聚丙烯醯胺凝膠電泳；分析和蛋白印跡分析，將菌液4°C，8500rpm,離心lOmin，收集上清液。
2.根據權利要求I所述中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法，其特徵在於步驟二中酵母感受態細胞的製備，其製備步驟為 (1)接種酵母菌種將菌種GS115劃線接種YPD平板，30°C培養3天； (2)挑取單個菌落接種於IOmlYPD液體培養基中，30°C，250rpm搖床振蕩培養過夜； (3)取ΙΟΟμI的菌液接種於IOOmlYro液體培養基中，30°C，250rpm搖床振蕩培養至0D600為I. 5時，大約需要20小時； (4)將菌液平均倒入2支50ml離心管，4°C，5000rpm離心8min，棄上清； (5)在沉澱中加入20ml(TC、滅菌的去離子水，混懸細胞，然後加水至40ml，4°C，5000rpm離心8min,棄上清,重複水洗一次，棄上清； (6)在洗好的沉澱中加入4ml預冷的lmol/L山梨醇溶液，振蕩混勻，然後將兩管中的細胞合併到一管，4°C, 5000rpm離心8min,棄上清； (7)在細胞沉澱中加入200μ I預冷的lmol/L山梨醇溶液，振蕩混勻，即製成了酵母感受態細胞，將其放在冰上當天使用。
3.根據權利要求I所述中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法，其特徵在於步驟一 PCR反中PCR反應體系30 μ I :10XPCR Buffer 3 μ 1，濃度為IOmM的兩條引物各I μ I，2mM 的 dNTPs 2 μ I，MgCl22 μ I，5U/ μ I 的 Taq 酶 O. 2 μ I，模板為 pGEX-4T_MIHl 質粒0.2 μ 1，加水補足到30 μ 1，獲得的擴增產物切膠純化後進行TA克隆並測序鑑定；PCR循環條件94°C先預變性4min，按以下循環參數進行30個循環95°C變性40s，62°C退火40s，72°C延伸40s ;最後72°C保溫lOmin，取3 μ IPCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統上紫外掃描，拍照，產物用PCR產物凝膠純化試劑盒純化。
4.根據權利要求I所述中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法，其特徵在於步驟一陽性克隆的鑑定中用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R進行菌落PCR篩選陽性克隆，隨機挑取單克隆於500 μ I的含100 μ g/ml的Amp+的LB培養液中，37°C 250rpm振蕩6_8hr，以挑取的單克隆菌液為模板做菌落PCR，篩選出陽性克隆，取0. 5 μ I細菌培養液作PCR反應的模板，以插入片段兩側載體上的序列作引物，PCR擴增。
全文摘要
本發明公開了了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達方法，其步驟為中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達載體的構建和中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達；本發明成功表達了MIH蛋白，為進一步了解早熟蟹性腺提早發育的內在機理，了解蟹類蛻皮腺的功能機制並為進一步制定控制河蟹性早熟的技術措施提供理論基礎，獲得實現生長發育和繁殖的人工調控的基礎。
文檔編號C07K14/575GK102978234SQ20121043843
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者殷文莉, 戴建華, 周開亞 申請人:殷文莉