基於磁珠法提取土壤微生物dna的試劑盒及方法

2023-04-25 11:50:01 1

基於磁珠法提取土壤微生物dna的試劑盒及方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學【技術領域】，具體涉及一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法，本發明的基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法，是利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質，再使用玻璃珠破碎土壤微生物細胞後，通過磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。本發明方法所用時間短，步驟少，能獲得純度高的土壤微生物DNA，無需再進一步純化即可直接進行下遊實驗。
【專利說明】基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學【技術領域】，具體涉及一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA 的試劑盒及方法。

【背景技術】
[0002] 土壤除了為陸生植物提供營養源和水分之外，還是植物生長，進行光合作用、能量 交換的主要場所；同時也具有微生物生長繁殖所需要的一切營養物質及各種條件，是微生 物良好的生活場所，有"微生物的天然培養基"之稱。
[0003] 土壤是微生物的主要棲息地，是自然環境中最複雜的異質體系，這決定了土壤微 環境的多樣化和土壤微生物的高度多樣性。每克土壤含有大約107個原核生物細胞，但僅 有0. 1%?10%的土壤微生物是可以培養的。在微生物學研究領域中，因為99%以上的微 生物都是目前未（難）被純培養的，過去人們對微生物世界的認識基本上都集中在不到1% 的微生物上。對這些未培養微生物多樣性及群落功能的研究將大大擴展我們對生命的了 解，包括了解生命如何耐受極端環境、新的生物能源、生命進化以及微生物與環境之間的相 互作用。
[0004] 微生物環境基因組學為最大限度地挖掘微生物資源帶來了前所未有的機遇，已經 成為國際生命科學技術研究和開發最重要的熱點和前沿。為了充分認識不可培養微生物的 豐富資源，結合現代分子生物學技術的發展，已建立起了許多不需要對微生物進行獨立培 養的新方法和新技術。如變性梯度凝膠電泳（DGGE)法是將目標基因進行PCR擴增，通過對 PCR產物進行分離和鑑定分析土壤微生物群落結構的組成信息；隨機擴增多態性DNA技術 (RAPD)是應用不同的隨機引物在非嚴格的條件下進行PCR擴增，通過分析PCR產物在凝膠 電泳上的條帶多態性來反映樣品中微生物的多樣性。
[0005] 關於土壤宏基因組學技術的構建已有許多研究報導，主要的突破在於需要足夠高 質量的DNA，因此直接從土壤環境中提取和純化DNA是其中最關鍵的步驟。土壤宏基因組學 技術在我國土壤及環境微生物生態學方面的研究才剛起步，對這一新技術的跟蹤和應用， 將會有力地促進我國土壤微生物生態學研究的發展。因此，研究一種高效提取土壤宏基因 組DNA的試劑盒，對於大規模開展土壤宏基因組學研究顯得十分必要。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是：提供一種能高效、快速的基於磁珠法提取土壤微 生物DNA的試劑盒及方法。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：提供一種基於磁珠法提取土 壤微生物DNA的方法，包括如下步驟：
[0008] 土壤樣品的前處理：取0. 25-lg的土壤於2ml的離心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g離心 2-5min，去上清得沉澱A;
[0009] 所述BufferA為pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩衝液；
[0010] 所述BufferB為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液；
[0011] 所述BufferC為為包含2-6M的OF離子的溶液；
[0012]所述BufferD為pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩衝液；
[0013] 土壤微生物DNA的提取：所述沉澱A加入300-400illBufferD，0? 2-lg的0? 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C溫度條件下 11000-12000g離心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml離心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的BufferG，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打勻後室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0014] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0015] 所述BufferF由以下方法配製而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解並調節pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0016] 所述BufferG為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠；
[0017] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0018] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-10mMTris溶液。
[0019] 本發明的另一技術方案為提供一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所 述試劑盒包括如下試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、BufferG、BufferH和BufferI;
[0020] 所述BufferA為pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩衝液；
[0021] 所述BufferB為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液；
[0022] 所述BufferC為為包含2-6M的OF離子的溶液；
[0023] 所述BufferD為pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩衝液；
[0024] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0025] 所述BufferF由以下方法配製而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解並調節pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0026] 所述BufferG為4_50ml異丙醇與l_3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠；
[0027] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0028] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0029] 本發明的有益效果在於：本發明的基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒及方 法，是利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質，再使用玻璃珠破碎土壤微生物細胞後，通過 磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。本發明方法所用時間短，步驟少， 能獲得純度高的土壤微生物DNA，無需再進一步純化即可直接進行下遊實驗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為利用本發明【具體實施方式】的方法對4種不同土壤樣品的微生物基因組DNA 提取結果圖；
[0031] 圖2為本發明【具體實施方式】中4種不同土壤樣品的微生物基因組16srDNA擴增 結果圖。

【具體實施方式】
[0032] 為詳細說明本發明的技術內容、所實現目的及效果，以下結合實施方式並配合附 圖予以說明。
[0033] 本發明最關鍵的構思在於：利用氫氧化鋁來去除土壤中的各種雜質，再使用玻璃 珠破碎土壤微生物細胞後，通過磁珠吸附土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA。
[0034] 實施例1
[0035] -種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具體步驟如下：
[0036] (1)原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生 根際土壤。
[0037] (2) 土壤樣品的前處理：用天平稱取0? 25-lg的土壤於2ml的離心管中，加入 50-150illBufferA，300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s;加入 50-150illBufferC，200-400illBufferD，渦旋震蕩 30-60s;8000-10000g離心 2-5min， 去上清。前處理主要是去除腐殖質等土壤雜質，防治雜質對下遊實驗的影響。
[0038] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脫：加入 300-400illBufferD，0? 2-lgO. 5mm 玻璃珠，300-400illBufferE，300-400illBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C11000_12000g 離心l_3min。吸取500-1000ii1上清至1. 5ml離心管，加入500-1000ii1酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1)，渦旋震蕩30-60s，4°C13000-16000g離心l-3min。將上清轉移至1. 5ml離心管， 加入與上清液等體積的BufferG。震蕩10-30s。室溫放置5-10min，將離心管放在磁力架 上,進行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入0. 5-2mlBufferH，打 勻後室溫靜止5-10min，將離心管放在磁力架上，進行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含 有磁珠的離心管中加入30-60ylBufferI，此溶液即為土壤微生物DNA。於1-2%瓊脂糖 凝膠中電泳檢測。
[0039] 磁珠為矽基生物磁珠，粒徑為0. 5-2um矽基生物磁珠就是指磁珠微珠表面包裹一 層矽材料來吸附核酸，選用磁珠法來純化核酸的最大優點就是自動化。磁珠在磁場條件下 可以發生聚集或分散，從而可擺脫離心等所需的手工操作流程。不同粒徑大小的磁珠，其表 面積大小不一，吸附效果不一。
[0040] BufferA溶液的配置：0? 5-2MTris-Cl(pH= 4-6);
[0041] 所述BufferB為0? 1-2M為包含0? 1-2M的A13+離子的溶液；
[0042] 所述BufferC為包含2-6M的OF離子的溶液；所述BufferB可為Al2 (S04) 3與所 述BufferC可為NaOH,他們反應生成氫氧化錯吸附雜質；直接加入氫氧化錯的話，因為氫氧 化鋁是固狀膠體，其與土壤反映不充分。先加入Al2 (S04) 3溶液，並將其與土壤溶液混勻，再 加入氫氧化鈉溶液後與其反映，能更加充分地吸附土壤中的雜質；
[0043] BufferD溶液的配置：0? 1-1MTris-Cl(pH= 7-9)偏鹼性緩衝液使核酸更容易從 細胞中游離出來；
[0044] BufferE溶液的配置：5_15%SDS，其作用為破碎細胞壁；
[0045] BufferF溶液的配置：稱取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入適當體積的雙 蒸水溶解並調節pH= 7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0046]BufferG溶液的配置：4-50ml異丙醇，l-3ml磁珠混懸液。（其中磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置），結合液：其作用為使核酸與磁珠結合；
[0047]BufferH溶液的配置：10-30mmol/LTris，5-10mmol/LEDTA，100-200mmol/L Nacl的溶液10-40ml與50-100ml的無水乙醇混合配置而成。其作用為洗漆雜質；
[0048] BufferI溶液的配置：6-10mmol/LTris，PH= 7. 0-8. 0,其作用為把核酸從磁珠 中洗脫下來；
[0049] 本實施例還公開了一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒 包括上述方法中的試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0050] 實施例2
[0051] 一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具體步驟如下：
[0052] 原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生根際 土壤。
[0053] 土壤樣品的前處理：取0. 25-lg的土壤於2ml的離心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill無菌水，300-900illBufferB，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g離心 2-5min，去上清得沉澱A;
[0054] 所述BufferA 為 pH為 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl緩衝液；
[0055] 所述BufferB為 0? 1-1M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0056] 所述BufferC 為 2_5M的NaOH溶液；
[0057] 所述BufferD 為 pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl緩衝液；
[0058] 土壤微生物DNA的提取：所述沉澱A加入300-400illBufferD，0. 2-lg的0. 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，渦旋震蕩l-3min，4°C溫度條件下 11000-12000g離心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml離心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的BufferG，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打勻後室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0059] 所述BufferE為 5_15% 的SDS溶液；
[0060] 所述BufferF由以下方法配製而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 雙蒸水溶解並調節pH為7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0061] 所述BufferG為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液 由磁珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠；
[0062] 所述BufferH為 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液與50-100ml的無水乙醇混合而成；
[0063] 所述BufferI為pH為 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0064] 本實施例還公開了一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒 包括上述方法中的試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0065] 實施例3
[0066] 本發明提供一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，該方法能通過磁珠吸附 土壤微生物DNA，從而快速獲得土壤微生物DNA，利用該方法能夠有效地從土壤中提取出微 生物DNA。具體步驟如下：
[0067] (1)原料：新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際土壤，新鮮花生 根際土壤。
[0068] (2) 土壤樣品的前處理：用天平稱取0. 5g的土壤於2ml的離心管中，加入100ill BufferA，600ii1 無菌水，300ii1BufferB，渦旋震蕩 30s;加入 100ii1BufferC，300ii1 BufferD，潤旋震蕩30s;8000g離心2min，去上清。
[0069] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脫：加入325illBufferD，0. 5g0? 5謹玻璃珠， 325illBufferE，325illBufferF，渦旋震蕩lmin，，4°CllOOOg離心 2min。吸取 750ill 上清至1.51111離心管，加入750111酚：氯仿：異戊醇（25 :24:1)，渦旋震蕩308,41：1600(^ 離心lmin。將上清轉移至1. 5ml離心管，加入等體積的BufferG。震蕩10s。室溫放置 5min，將離心管放在磁力架上，進行磁珠分離。吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中 加入lmlBufferH，打勻後室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進行磁珠分離。吸去液 體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入50illBufferI，此溶液即為土壤微生物DNA。 於1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。
[0070] ⑷擴增土壤微生物16srDNA基因：通過PCR的方式進行土壤微生物16srDNA基 因的擴增，PCR擴增體系如下：rTaq酶0?3ia，PCRbuffer2?5ia，DNTPlia，引物Rlia， 弓丨物Fliil，土壤微生物基因組DNAliil，滅菌水18. 21110PCR擴增程序如下：95°C5min; 95°C30s，58°C30s，72°C30s，35個循環；72°C5min。將擴增得到的產物用1%瓊脂糖凝 膠中電泳檢測。
[0071] 磁珠為矽基生物磁珠，粒徑為lum
[0072]BufferA溶液的配置：1MTris-Cl(pH= 5. 5)
[0073]BufferB溶液的配置：0? 2MA12 (S04) 3
[0074]BufferC溶液的配置：4MNaOH
[0075] BufferD溶液的配置：0? 1MTris-Cl(pH=8)
[0076] BufferE溶液的配置：325ii1 10%SDS
[0077] BufferF溶液的配置：稱取2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA，加入適當體 積的雙蒸水溶解並調節pH= 8. 0,定容至100ml
[0078] BufferG溶液的配置：48ml異丙醇，2ml磁珠混懸液。（其中磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置）
[0079]BufferH溶液的配置：20mmol/LTris, 8mmol/LEDTA，140mmol/LNacl的溶液 30ml與70ml的無水乙醇混合配置而成
[0080]BufferI溶液的配置：8mmol/LTris,PH=8. 0
[0081] 本實施例還公開了一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特徵在於， 所述試劑盒包括如下試劑：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI;
[0082] 所述 BufferA為pH為5. 5的 1M的Tris-Cl緩衝液；
[0083] 所述 BufferB為 0? 2M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0084] 所述BufferC為 4M的NaOH溶液；
[0085] 所述 BufferD為pH=8的0?1M的Tris-Cl緩衝液；
[0086] 所述 BufferE為 10 % 的SDS溶液；
[0087]所述BufferF由以下方法配製而成：取 2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA， 加入雙蒸水溶解並調節pH為8. 0,定容至100ml;
[0088] 所述BufferG為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠；
[0089]所述BufferH為 30ml的包含 20mMTris，8mMEDTA，140mMNacl的溶液與 70ml 的無水乙醇混合而成；
[0090] 所述BufferI為pH為8的8mMTris溶液。
[0091] 利用實施例3所述方法對新鮮水稻根際土壤，新鮮玉米根際土壤，新鮮甘蔗根際 土壤，新鮮花生根際土壤進行提取土壤微生物的DNA，4種不同土壤樣品的微生物基因組 DNA提取結果見圖1，泳道1，2, 3,4分別表示新鮮水稻根際土壤微生物基因組DNA，新鮮玉米 根際土壤微生物基因組DNA，新鮮甘蔗根際土壤微生物基因組DNA，新鮮花生根際土壤微生 物基因組DNA。從圖中可看出本方法能提取到土壤微生物基因組DNA。4種不同的土壤樣品 的微生物基因組的0D(260 :280)值結果見表1，4種土壤微生物基因組的0D(260 :280)值在 1. 78-1. 80範圍內，從表1中可看出本方法可以提取到純度高的土壤微生物基因組DNA。
[0092] 表 1
[0093]

【權利要求】
1. 一種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特徵在於，包括如下步驟： 土壤樣品的前處理：取〇.25-lg的土壤於2ml的離心管中，加入50-150 ill Buffer A， 300-900 ii 1 無菌水，300-900 ii 1 Buffer B，渦旋震蕩 30-60s，加入 50-150 ii 1 Buffer C， 200-400 ii 1 Buffer D，渦旋震蕩 30-60s，8000-10000g 離心 2-5min，去上清得沉澱 A ; 所述Buffer A為pH為4-6的0? 5-2M的Tris-Cl緩衝液； 所述Buffer B為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液； 所述Buffer C為包含2-6M的OIT離子的溶液； 所述 Buffer D 為 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 緩衝液； 土壤微生物DNA的提取：所述沉澱A加入300-400 ill Buffer D，0. 2-lg的0. 5mm玻 璃珠，300-400iil Buffer E，300-400iil Buffer F，渦旋震蕩 l-3min，4°C 溫度條件下 11000-12000g 離心 l-3min，取 500-1000ul 上清液至 1. 5ml 離心管，加入 500-1000 ii 1 的 酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和異戊醇的體積份數比為25:24:1，渦 旋震蕩30-60s，4°C溫度條件下13000-16000g離心l-3min，將上清液轉移至1. 5ml離心管， 加入上清液等體積的Buffer G，震蕩10-30s，放置5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上， 進行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入0. 5-2mlBuffer H， 打勻後室溫靜止5-10min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進行磁珠分離，吸去液體，保留磁 珠。往含有磁珠的1.5ml離心管中加入30-60 yl Buffer I，即得土壤微生物DNA溶液； 所述Buf f er E為5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配製而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入雙蒸 水溶解並調節pH為7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液與50-100ml的無水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 為 pH 為 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
2. 根據權利要求1所述的基於磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特徵在於，包括如 下步驟： 土壤樣品的前處理：取〇. 5g的土壤於2ml的離心管中，加入lOOiil Buffer A，600iil 無菌水，300 ill Buffer B，渦旋震蕩 30s，加入 100 ill Buffer C，300 ill Buffer D，渦旋震 蕩30s，8000g離心2min，去上清得沉澱A ; 所述Buffer A為pH為5. 5的1M的Tris-Cl緩衝液； 所述 Buffer B 為 0? 1-1M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C為2-5M的NaOH溶液； 所述Buffer D為pH = 8的0? 1M的Tris-Cl緩衝液； 土壤微生物DNA的提取：所述沉澱A加入325 ill Buffer D，0. 5g的0. 5mm玻璃珠， 325iil Buffer E，325iil Buffer F，潤旋震蕩 lmin，4°C溫度條件下 11000g 離心 2min，取 750ul上清液至1. 5ml離心管，加入750 yl的酚、氯仿和異戊醇酚的混合液，所述混合液 中酚、氯仿和異戊醇的體積份數比為25:24:1，渦旋震蕩30s，4°C溫度條件下16000g離心 lmin，將上清液轉移至1. 5ml離心管，加入上清液等體積的Buffer G，震蕩10s，放置5min， 將1. 5ml離心管放在磁力架上，進行磁珠分離，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml離 心管中加入lmlBuffer H，打勻後室溫靜止8min，將1. 5ml離心管放在磁力架上，進行磁珠 分離，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的1. 5ml離心管中加入50 ill Buffer I，即得土壤 微生物DNA溶液； 所述Buf f er E為10 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配製而成：取2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506gEDTA，加入 雙蒸水溶解並調節pH為8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液與 70ml 的無 水乙醇混合而成； 所述Buffer I為pH為8的8mM Tris溶液。
3. -種基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括如下 試劑：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A為pH為4-6的0? 5-2M的Tris-Cl緩衝液； 所述Buffer B為0. 1-2M為包含0. 1-2M的Al3+離子的溶液； 所述Buffer C為包含2-6M的OIT離子的溶液； 所述 Buffer D 為 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 緩衝液； 所述Buf f er E為5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配製而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入雙蒸 水溶解並調節pH為7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為4-50ml異丙醇與l-3ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁 珠和水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液與50-100ml的無水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 為 pH 為 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
4. 根據權利要求3所述的基於磁珠法提取土壤微生物DNA的試劑盒，其特徵在於，所 述試劑盒包括如下試劑：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、 Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A為pH為5. 5的1M的Tris-Cl緩衝液； 所述 Buffer B 為 0? 2M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C為4M的NaOH溶液； 所述Buffer D為pH = 8的0? 1M的Tris-Cl緩衝液； 所述Buf f er E為10 %的SDS溶液； 所述 Buffer F 由以下方法配製而成：取 2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506g EDTA，力口 入雙蒸水溶解並調節pH為8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G為48ml異丙醇與2ml磁珠混懸液的混合液，所述磁珠混懸液由磁珠和 水按照1:2體積比配置而成，所述磁珠為粒徑為0. 5-2um的矽基生物磁珠； 所述 Buffer H 為 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液與 70ml 的無 水乙醇混合而成； 所述Buffer I為pH為8的8mM Tris溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK104328110SQ201410581883
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】王清水, 餘彥 申請人:福建師範大學