一種含amiRNA-HIF-1α序列的重組質粒的製備方法及用途

2023-04-25 22:01:31

一種含amiRNA-HIF-1α序列的重組質粒的製備方法及用途
【專利摘要】本發明公開了一種含amiRNA-HIF-1α序列的重組質粒的製備方法及用途，該重組質粒的製備方法包含amiRNA-HIF-1α序列的合成、目的片段和載體質粒的連接、連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞以及重組質粒電泳鑑定並測序等步驟。該重組質粒包含amiRNA-HIF-1α的編碼序列以及載體質粒DNA序列，載體質粒DNA序列中包含與amiRNA-HIF-1α連接的調節序列。本發明還公開了該重組質粒用於製備抗腫瘤藥物的用途。本發明可用於amiRNA-HIF-1α在腫瘤血管新生、增殖凋亡、侵襲轉移中的作用機理的研究，以及抗腫瘤藥物的開發和生產，從而提供預防和治療惡性腫瘤的新途徑。
【專利說明】-種含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法及用 途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組質粒的製備方法及用途，具體地，涉及一種含 amiRNA-HIF-1 α的重組質粒的製備方法及用途。

【背景技術】
[0002] 腫瘤血管新生（Tumor Angiogenesis)或血管生成（Vasc μ Iarization)是實體瘤 生長非常關鍵的因素，惡性腫瘤的生長、浸潤和轉移有賴於腫瘤血管的生成，如果沒有血管 生成，原發腫瘤生長不會超過1?2mm3,其繼續生長必須依賴新血管的形成，以提供足夠的 營養和氧，帶走代謝產物，同時新生血管管壁不完整，呈高通透狀態，有利於腫瘤細胞的轉 移。腫瘤血管新生是一個非常複雜的過程，包括腫瘤細胞、內皮細胞、吞噬細胞和它們的分 泌因子的相互作用，這些分泌因子可能是腫瘤血管形成的促進因子(如VEGF、Ang-2、bFGF、 IL-8等）或抑制因子（TSP-1 Angioststin等)。腫瘤血管生成受促進因子和抑制因子兩者 有機調控，如果促血管生成因子上調或抑血管生成因子功能障礙，二者平衡被打破使血管 內皮細胞加速分化，產生微血管包繞到腫瘤組織周圍，促進腫瘤血管新生，加快腫瘤侵襲和 轉移。因此，有效調控血管生成促進因子和抑制因子的動態平衡，是抗腫瘤血管生成治療 的關鍵和作用祀點。實體瘤可通過細胞保護機制在缺氧條件（Hypoxia Condition,又稱低 氧條件，指限制細胞獲得氧氣的腫瘤高細胞密度）下生存，這些保護機制包括能誘導VEGF、 Bcl-2、MDR、MMPs等表達的轉錄因子HIF-I α的激活和有利於細胞增殖、血管新生和多藥耐 藥的葡萄糖重新編碼機制。其中缺氧微環境激活腫瘤細胞HIF-lα，誘導VEGF、bFGF、Ang-2 等促血管生成因子的表達，是其促進實體瘤生長和腫瘤血管新生的重要環節。Pugh等研究 證實，腫瘤細胞缺氧是血管生成因子釋放和血管新生過程的關鍵刺激因素。缺氧誘導因子 I (Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是缺氧條件下VEGF的基礎調節因子，HIF-1定位 於14q21_q24,為含有α及β亞基的異源二聚體。在正常氧濃度條件下，細胞內HIF-Ia 不穩定，半衰期不到5 min，很快通過ODD介導的泛素蛋白酶體途徑降解。而在低氧或缺氧 情況下，HIF-1 α穩定性增加，轉移到細胞核，與HIF-I β亞單位結合成二聚體HIF-1，HIF-1 再與目的基因 HRG結合從而激活其轉錄過程。腫瘤細胞內HIF-I表達與氧依賴的信號傳 導密切相關，調節機制包括氧依賴的HIF-1 α降解、蛋白的磷酸化、轉錄水平的上調和蛋白 穩定和配體結合能力及胞內定位。缺氧條件下，腫瘤細胞內許多基因的轉錄和表達發生變 化，對缺氧作出應激反應，被稱為缺氧反應基因（HRG)。HRG中受HIF-1 α調控的基因稱為 HIF-1 α的靶基因，這些靶基因的啟動子或增強子內含有一個或多個缺氧反應元件（HRE)， 活化的HIF-I與之結合，形成HIF-1、p300/CBP環腺苷酸反應元件結合蛋白（CREB)，以及其 他轉錄因子的起始複合物，從而啟動靶基因的轉錄。HIF-I靶基因數目多達60餘種，涉及 腫瘤細胞增殖、能量轉換、血管生成、侵襲轉移等，通過諸多相互影響的遺傳和環境信號轉 導通路，編碼包括VEGF、bFGF、IGF-1、iNOS、IL-8、C0X-2、MMPs等促血管生成因子。腫瘤細 胞分泌的VEGF、bFGF、IGF-I等重要的血管生成因子能刺激腫瘤微血管發生，增加血管通透 性，而分泌的IL-8、C0X-2和iNOS等血管源性炎症分子能影響腫瘤脈管系統的生成、發展和 轉移。HIF-I可直接激活一系列促血管生成因子，包括VEGF、VEGF受體FLT-I和FLK-I、其 酪氨酸激酶TIE-2受體、基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9。在HIF-I誘導促血管生成因子 中，VEGF由於其有力的血管生成特性及在人類腫瘤中大量表達而尤為顯著。HIF信號系統 負責調節VEGF和腫瘤血管生成，然而HIF家族成員在這個過程中的獨立作用還存爭議。
[0003] 近年來越來越多的研究證明，缺氧微環境一直是腫瘤血管新生的常見誘導因素， 缺氧在消化系腫瘤中，特別是結直腸癌發展過程中發揮至關重要的作用。缺氧條件下應激 產生的HIF-I所調節的靶基因與腫瘤血管新生密切相關，HIF-I過表達在促進結直腸癌的 發生中扮演重要的角色。因此，阻斷HIF-I的表達可顯著減少腫瘤微血管的生成，減輕缺氧 微環境對腫瘤的促進作用，HIF-I成為抗腫瘤的重要作用靶點。MicroRNA (miRNA)是一種 大小約22 nt的非編碼小分子單鏈RNA，可以通過對靶基因 mRNA的剪切或抑制靶基因 mRNA 的翻譯調控靶基因的表達。miRNA作用方式很大程度上和siRNA介導的RNAi途徑重疊，但 與SiRNA相比，miRNA僅僅需要和靶基因部分的結合即可以發揮作用，因而可以在最大程度 上阻斷祀基因的功能活性。外源性人工合成的microRNA (artificial microRNA，amiRNA) 技術是指利用內源性miRNA前體分子產生小RNA去介導動物或植物中的靶基因沉默。最 近，幾個基於miRNAs表達框架的pol II啟動子驅動的RNAi載體被構建，這種RNAi載體能 表達外源性miRNA通過RNA幹擾途徑指導RNA的清除或轉錄抑制。利用microRNA表達框 架產生外源性miRNA特異性降解靶基因的體內外實驗已經展示了極好的應用前景。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種用於研究amiRNA-HIF-la序列在腫瘤血管新生、增殖 凋亡、侵襲轉移等惡性腫瘤的生物學行為中作用機理的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質 粒的製備方法及用途，在其基礎上能夠進一步開發和生產可預防和治療惡性腫瘤的藥物。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提供了一種含amiRNA-HIF-1 a的重組質粒的製備方 法，其中，所述的方法包含：步驟1，根據HIF-I a CDS序列設計併合成SiRNA序列，並進行 5'端2-甲氧基修飾，再通過細胞轉染實驗驗證其有效性；步驟2,設計併合成包含HIF-I a siRNA序列的DNA序列amiRNA-HIF-la ;步驟3,對所得amiRNA-HIF-la序列和載體質粒 用連接酶進行連接，得到的連接產物即為所述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒；所述 的連接酶為T4 DNA連接酶；步驟4,用步驟3所得連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞並進行 培養；步驟5,從步驟4培養所得的菌落中任意挑取一個進行質粒提取，然後通過電泳鑑定； 步驟6,通過細胞實驗驗證所得重組質粒的抗腫瘤作用。
[0006] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，該重組質粒包含 amiRNA-HIF-1 a的編碼序列以及載體質粒DNA序列，所述的載體質粒DNA序列中包含與 amiRNA-HIF-la連接的調節序列；所述的載體質粒是能夠在宿主中複製和生存的真核表 達質粒。
[0007] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，步驟1所述的設計 併合成siRNA序列，其設計的目的siRNA序列為：5' -UGUGAGUUCGCAUCUUGAU-3' ；其對照 siRNA 序列為：5' -UACACCGUUAGCAGACACC-3'。
[0008] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，步驟1所述的細胞 轉染實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、對照siRNA序列組、目 的SiRNA序列組，分別加入空白質粒、包含所述對照SiRNA序列的質粒、以及包含所述目的 siRNA序列的質粒進行轉染，在37°C 5% CO2培養箱中培養48h後分別進行觀察。
[0009] 上述的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其中，步驟2所述的設計 併合成包含HIF-Ia siRNA序列的DNA序列，其正義序列為：5'-TGCTGTGTGAGTTCGCATCTT GATGTTTTGGCCACTGACTGACATCAAGATGCGAACTCACA-3';其反義序列為：5' -CCTGTGTGAGTTCGCA TCTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATCAAGATGCGAACTCACAC-3 '。
[0010] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，所述的步驟2還 包含使所述的正義序列和反義序列退火形成雙鏈的DNA序列；所述的退火條件為95°C， 30sec - 37°C, Imin - 16°C, 5min - 4。。，IOmin0
[0011] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，所述的步驟3還包 含：在對所得amiRNA-HIF-1 a序列和載體質粒用連接酶進行連接的同時做自連對照，以水 代替amiRNA-HIF-1 a序列與載體質粒連接；所得的產物作為陰性對照組，與目的片段和載 體連接的產物同時進行步驟4的轉化大腸桿菌感受態細胞。
[0012] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，步驟5所述的質粒 提取，通過高純質粒小量提取試劑盒進行；所述的電泳鑑定是以含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝 膠進行電泳分離。
[0013] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒的製備方法，其中，步驟6所述的細胞 實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、載體質粒組、重組質粒組，分 別加入空白質粒、載體質粒、以及所述的含amiRNA-HIF-1 a的重組質粒進行轉染，在37°C 5% CO2培養箱中培養48h後分別進行觀察。
[0014] 本發明還提供了一種通過上述方法製備的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒用 於製備抗腫瘤藥物的用途。
[0015] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒用於製備抗腫瘤藥物的用途，其中，所 述的抗腫瘤藥物，其製劑形式包含注射液、凍幹劑等。
[0016] 上述的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒用於製備抗腫瘤藥物的用途，其中，所 述的基於HIPK2基因的抗腫瘤藥物，其給藥途徑包含靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、介入 給藥和直接瘤內注射等。
[0017] 本發明提供的含amiRNA-HIF-1 a的重組質粒的製備方法及用途具有以下優點： 本發明提供的方法製備的含amiRNA-HIF-1 a序列的重組質粒，可用於 amiRNA-HIF-1 a序列對腫瘤其它生物學活性影響的研究，繼而用於抗腫瘤藥物的製造中， 在amiRNA-HIF-1 a基因在腫瘤血管新生、增殖凋亡、侵襲轉移等惡性腫瘤的生物學行為中 作用機理的基礎上，進一步開發和生產可預防和治療惡性腫瘤的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖 1 為 HIF-I a siRNA 的序列圖。
[0019] 圖2為HIF-I a siRNA抗腫瘤功能驗證圖。
[0020] 圖3為HIF-I a siRNA抗腫瘤功能驗證的結果示意圖。
[0021] 圖4為p -amiRNA-HIF-la重組質粒構建概要圖。
[0022] 圖5為ρ-amiRNA-HIF-l α重組質粒電泳結果。
[0023] 圖6為ρ-amiRNA-HIF-l α重組質粒轉染人結直腸癌細胞對細胞增殖的影響。
[0024] 圖7為p-amiRNA-HIF-la重組質粒轉染人結直腸癌細胞對細胞增殖的影響的結 果示意圖。
[0025]

【具體實施方式】 以下結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步地說明。
[0026] 本發明提供的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，該方法包含： 步驟1，根據HIF-I α⑶S序列設計併合成SiRNA序列，並進行5'端2-甲氧 基（2-M0)修飾，再通過細胞轉染實驗驗證其有效性；其設計的目的siRNA序列為： 5' -UGUGAGUUCGCAUCUUGAU-3' ；其對照 siRNA 序列為：5' -UACACCGUUAGCAGACACC-3'。
[0027] 該細胞轉染實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、對照 siRNA序列組、目的siRNA序列組，分別加入空白質粒、包含對照siRNA序列的質粒、以及包 含目的siRNA序列的質粒進行轉染，在37°C 5% CO2培養箱中培養48h後分別進行觀察。
[0028] 步驟2,設計併合成包含HIF-1 a siRNA序列的DNA序列amiRNA-HIF-1 a ;其正義 序列為：5, -TGCTGTGTGAGTTCGCATCTTGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCAAGATGCGAACTCACA-3,； 其反義序列為：5' -CCTGTGTGAGTTCGCATCTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATCAAGATGCGAACTCACA C-3，。
[0029] 步驟2還包含使正義序列和反義序列退火形成雙鏈的DNA序列；退火條件為 95°C, 30sec - 37°C, Imin - 16°C, 5min - 4。。，lOmin。
[0030] 步驟3,對所得amiRNA-HIF-1 α序列和載體質粒用T4 DNA連接酶進行連接，得到 的連接產物即為含amiRNA-HIF-1 α的重組質粒。步驟3還包含：在對所得amiRNA-HIF-1 a 序列和載體質粒用連接酶進行連接的同時做自連對照，以水代替amiRNA-HIF-1 α序列與 載體質粒連接。該連接酶為T4 DNA連接酶。
[0031] 步驟4,用步驟3所得的含amiRNA-HIF-1 α的重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞 並進行培養；並將自連所得的產物作為陰性對照組，與目的片段和載體連接的產物同時進 行步驟4的轉化大腸桿菌感受態細胞，並進行觀察。
[0032] 步驟5,從步驟4培養所得的菌落中任意挑取一個進行質粒提取，然後通過電泳鑑 定；質粒提取，通過高純質粒小量提取試劑盒進行；電泳鑑定是以含溴化乙錠的1%瓊脂糖 凝膠進行電泳分離。
[0033] 步驟6,通過細胞實驗驗證所得重組質粒的抗腫瘤作用。
[0034] 該細胞實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、載體質粒 組、重組質粒組,分別加入空白質粒、載體質粒、以及含amiRNA-HIF-1 α的重組質粒進行轉 染，在37°C 5% CO2培養箱中培養48h後分別進行觀察。
[0035] 該重組質粒包含amiRNA-HIF-1 α的編碼序列以及載體質粒DNA序列，載體質粒 DNA序列中包含與amiRNA-HIF-1 α連接的調節序列，該載體質粒是能夠在宿主中複製和生 存的真核表達質粒。
[0036] 本發明還提供了通過上述方法製備的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒用於制 備抗腫瘤藥物的用途。該抗腫瘤藥物，其製劑形式包含注射液、凍幹劑等，其給藥途徑包含 靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、介入給藥和直接瘤內注射等。
[0037] 實施例 I :pcDNA?6· 2-GW/EmGFP-amiRNA-HIF-l α (簡寫為 p -amiRNA-HIF-1 α )重 組質粒的構建。
[0038] l.HIF-Ια siRNA的設計、合成和功能驗證過程如圖1所示，包括以下步驟。
[0039] I. 1以HIF-I a⑶S為模板，設計其siRNA序列，需遵循與模板完全互補配對和不 能干預其他基因的表達的原則，並設計其對照序列，由takala公司合成。並進行5'端2-M0 修飾。
[0040] 目的 siRNA 序列：5, -U⑶GA⑶UCGCAUCUUGAU-3， 對照 siRNA 序列：5' -UACACCGUUAGCAGACACC-3' 1. 2將培養於含有10%新生牛血清、100U/ml青黴素、100 μ g/ml鏈黴素 McCoy's 5A完 全培養基（37°C 5% CO2、飽和溼度）的人結直癌HTC-116細胞株，按IX IO6個細胞/孔的量 在24孔板中接種指數生長期的細胞，在37°C 5% CO2培養箱中過夜培養，直到細胞密度達 到 60%-80%。
[0041] 將上述常規培養的人結直腸癌HCT-116細胞隨機分為空白組、對照siRNA序列組、 目的siRNA序列組，分別按如下劑量加入不同的質粒進行瞬時轉染。
[0042] (1)空白組：正常 HCT-116 細胞，n=3。
[0043] (2)對照 siRNA 序列組：control siRNA，n=3。
[0044] (3)目的 siRNA 序列組：HIF_1 a siRNA，n=3。
[0045] 在I. 5ml的離心管中配製待轉染質粒（I. 0 μ g/孔)、轉染脂質體Hily-Max (4. 5 μ L/孔，購自日本同仁化學研究所)複合物，將待轉染質粒稀釋至不含血清和抗菌素的 McCoy' s 5Α培養基中，混合均勻，然後將轉染脂質體懸液，室溫溫育5 min。最後將兩者混 合在一起，充分混勻靜置20min，使質粒與脂質體充分結合。然後直接加入到細胞培養中，在 37°C 5% CO2培養箱中培養48h。
[0046] 結果見圖2和圖3,目的siRNA序列組細胞數量與對照siRNA序列組和空白組相比 明顯減少，說明目的siRNA序列可以抑制腸癌細胞在增殖，是有抗腫瘤功能的siRNA序列。
[0047] 2.如圖4所示，ρ-amiRNA-HIF-l α重組質粒構建過程，具體包括以下步驟：根 據所得HIF-Ia siRNA序列，設計併合成包含HIF-Ia siRNA序列的DNA序列，記為 amiRNA-HIF-1a 。
[0048] 正義序列：5, -TGCTGTGTGAGTTCGCATCTTGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCAAGATGCGAAC TCACAJ 反義序列：5' -CCTGTGTGAGTTCGCATCTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATCAAGATGCGAACTCACA 分別由上海生工合成20D (1個OD值的合成DNA的重量約為33 μ g)，用CldH2O (雙蒸 水）配製成ΙΟΟηΜ。
[0049] 然後，將正義序列溶液5μ 1 +反義序列溶液5μ 1 +退火液（10Χ)2 μ 1 + 8 μ I ddH20 (總體積 20μ 1)。
[0050] 退火條件：95°C，30sec - 37°C，Imin - 16°C，5min - 4°C, IOmin,獲得形成雙鏈的 DNA序列（ds oligo)，用於後續T4酶連接反應。
[0051] 3.目的片段與載體連接。
[0052] 5XLigase Buffer (緩衝液） 4μ? pcDNA?6. 2-GW/EmGFP-miR 載體質粒 2 μ L ds oligo (IOnM) 4 μ L T4 DNA連接酶 IyL ddH20 9 μ L 總量 20 μ L 註：T4 DNA Ligase (T4 DNA 連接酶）購於 TaKaRa 公司。
[0053] 16°C連接2 h，同時做自連對照，以水代替amiRNA-HIF-1 α序列與pCDNA?6. 2-GW/ EmGFP-amiR載體連接。所得產物作為陰性對照組，與目的片段和載體連接的產物同時進行 大腸桿菌感受態細胞轉化。
[0054] 4.連接產物的轉化。
[0055] (1)冰浴中將6 μ L連接產物分別加入至30 μ L DH5 α感受態細胞中，輕輕旋轉 混勻，冰浴30 min ; (2) 42 °C水浴熱休克90 s ; (3) 快速將管轉移至冰浴中，冰浴2 min ; (4) 分別加入200 yL LB培養基，混勻，37°C、200 rpm振蕩培養I h; (5) 將菌液塗布於含50 μ g/ml壯觀黴素的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收； (6) 倒置平板，轉移入37°C生化培養箱過夜培養。
[0056] 5.質粒電泳鑑定及測序鑑定。
[0057] 5.1質粒電泳鑑定。
[0058] 因為陰性對照平板沒長一個菌，而目的片段與載體連接產物的陽性平板長有很多 菌，所以認為所長全部為陽性菌落，挑1個提取質粒，取名為amiRNA-HIF-1 α -1。然後按如 下步驟操作。
[0059] (1)從平板上面各接1個菌落於3mlLB管中搖床過夜培養。
[0060] (2)提取其質粒。 高純質粒小量提取試劑盒(購自G-SHUN)，其組成如下：

【權利要求】
1. 一種含amiRNA-HIF-la序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於，其特徵在於，所 述的方法包含： 步驟1，根據HIF-1 α⑶S序列設計併合成siRNA序列，並進行5'端2-甲氧基修飾，再 通過細胞轉染實驗驗證其有效性； 步驟2,設計併合成包含HIF-1 a siRNA序列的DNA序列amiRNA-HIF-1 α ; 步驟3,對所得amiRNA-HIF-la序列和載體質粒用連接酶進行連接，得到的連接產物 即為所述的含amiRNA-HIF-1 α的重組質粒； 步驟4,用步驟3所得連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞並進行培養； 步驟5,從步驟4培養所得的菌落中任意挑取一個進行質粒提取，然後通過電泳鑑定； 步驟6,通過細胞實驗驗證所得重組質粒的抗腫瘤作用。
2. 如權利要求1所述的含amiRNA-HIF-la序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於， 所述的重組質粒包含amiRNA-HIF-1 α的編碼序列以及載體質粒DNA序列，所述的載體質粒 DNA序列中包含與amiRNA-HIF-1 α連接的調節序列，所述的載體質粒是能夠在宿主中複製 和生存的真核表達質粒。
3. 如權利要求1含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於，步驟1 所述的設計併合成siRNA序列，其設計的目的siRNA序列為：5'-UGUGAGUUCGCAUCUUGAU-3' ； 其對照 siRNA 序列為：5' -UACACCGUUAGCAGACACC-3'。
4. 如權利要求3含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於，步驟1 所述的細胞轉染實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、對照siRNA 序列組、目的siRNA序列組，分別加入空白質粒、包含所述對照siRNA序列的質粒、以及包含 所述目的siRNA序列的質粒進行轉染，培養後分別進行觀察。
5. 如權利要求1所述的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於， 步驟2所述的設計併合成包含HIF-1 a siRNA序列的DNA序列，其正義序列為：5' -TGCTGT GTGAGTTCGCATCTTGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCAAGATGCGAACTCACA-3' ；其反義序列為：5' -C CTGTGTGAGTTCGCATCTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATCAAGATGCGAACTCACAC-3'。
6. 如權利要求5所述的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於， 所述的步驟2還包含使所述的正義序列和反義序列退火形成雙鏈的DNA序列；所述的退火 條件為95°C，30秒一37°C，1分鐘一16°C，5分鐘一4°C，10分鐘。
7. 如權利要求1所述的含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於， 所述的步驟3還包含：在對所得amiRNA-HIF-1 α序列和載體質粒用連接酶進行連接的同 時做自連對照，以水代替amiRNA-HIF-1 α序列與載體質粒連接；所得的產物作為陰性對照 組，與目的片段和載體連接的產物同時進行步驟4的轉化大腸桿菌感受態細胞。
8. 如權利要求1含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於，步驟5 所述的質粒提取，通過高純質粒小量提取試劑盒進行；所述的電泳鑑定是以含溴化乙錠的 1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
9. 如權利要求1含amiRNA-HIF-1 α序列的重組質粒的製備方法，其特徵在於，步驟6 所述的細胞實驗包含：培養人結直腸癌HCT-116細胞，並隨機分為空白組、載體質粒組、重 組質粒組，分別加入空白質粒、載體質粒、以及所述的含amiRNA-HIF-1 α的重組質粒進行 轉染，培養後分別進行觀察。
10. -種通過如權利要求1~9中任意一項所述的方法製備的含amiRNA-HIF-la序列的 重組質粒用於製備抗腫瘤藥物的用途。
【文檔編號】C12N15/66GK104293830SQ201410233294
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】殷佩浩, 彭文, 邱豔豔, 陳騰, 湯慶豐, 梁波, 胡送嬌, 包益潔, 於卉, 石曉靜, 鄒瑜 申請人:上海市普陀區中心醫院