B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製作方法
2023-04-25 22:42:21
B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製作方法
【專利摘要】本發明為B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒。其檢測快速、靈敏、準確、可定量、操作簡單、且對樣品純度要求不高，特異性強，特別適用於大批量樣品的檢測，為此本發明還提供了專用測試盒的製備及檢測方法。其特徵在於：其包括濃縮洗滌液、濃縮復溶液、顯色液A、顯色液B和終止液，其還包括包被有B類單端孢黴烯族毒素固相抗原的包被板、B類單端孢黴烯族毒素標準品、B類單端孢黴烯族毒素抗體凍幹品。檢測後在450nm處測吸光度值，從標準曲線計算樣品中的B類單端孢黴烯族毒素含量。
【專利說明】B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及生物及食品安全檢測【技術領域】，具體為B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒及製備及檢測方法。
【背景技術】
[0003]B類單端孢黴烯族毒素是一類由鐮刀菌屬類真菌產生的代謝物，在自然界分布極為廣泛，多分布於小麥、大麥、玉米等穀物籽實中，是自然發生的最危險的食品汙染物，對人畜危害十分嚴重。它不但引起人畜急慢性中毒，還具有致癌、致畸、致突變的潛在危險。B類單端孢黴烯族毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON) >3-乙醯脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-D0N, 3_Ac_D0N)、15-乙醯脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl-D0N,15-Ac-DON)、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol, NIV)和鐮刀菌酮(fusarenon X, FUS-X)等。其化學結構如下圖所示(I)及表1所示。
【權利要求】
1.B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒，其特徵在於:其包括濃縮洗漆液、濃縮復溶液、顯色液A、顯色液B和終止液,其還包括包被有B類單端孢黴烯族毒素固相抗原的包被板、B類單端孢黴烯族毒素標準品、B類單端孢黴烯族毒素抗體凍幹品以及酶標記的羊抗鼠抗體凍幹品。
2.B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:其包括以下步驟:包被板的製備、B類單端孢黴烯族毒素標準品的製備、B類單端孢黴烯族毒素一卵清蛋白(OVA)偶聯物的製備，抗B類單端孢黴烯族毒素抗體及其溶液的製備，完全福氏佐劑的製備，不完全福氏佐劑的製備、酶標記的羊抗鼠抗體凍幹品的製備；顯色液A的製備；顯色液B的製備； 終止液的製備。
3.根據權利要求2所述B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:所述包被板包被B類單端孢黴烯族毒素固相抗原，其採用96或48或24孔微孔板，用10 mmol/L^100 mmol/L pH9~10 Na2CO3-NaHCO3的緩衝液作為包被液，將B類單端孢黴烯族毒素一卵清蛋白(OVA)稀釋至0.1 μ g/mL^l.0 μ g/mL, 96或48或24孔微孔板各加100 yL，2~8°C放置過夜或放37°C烘箱中孵育2 h，棄去包被液，洗滌2~3次，加入含1%~5%牛血清蛋白(溶於pH 7^8的磷酸鹽緩衝液)，2~8°C封閉過夜或37°C烘箱中放置1.5h，棄去封閉液，吹乾，板條密封后置-4°C~4°C保存。
4.根據權利要求2所述B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:所述B類單端孢黴烯族毒素標準品用嘔吐毒素(DON)標準品表示，嘔吐毒素(DON)標準品用嘔吐毒素(DON)純品中稀釋得到,稀釋液為去離子水，DON濃度為:0.001ng/mL~1000 n g/mL
5.根據權利要求2所述B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:B類單端孢黴烯族毒素一牛血清白蛋白(BSA)偶聯物的製備:將B類單端孢黴烯族毒素溶解在吡啶中，在反應瓶中加入I一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，並通入氮氣；密封反應瓶，混合物在沸水浴中攪拌90 mirTl20 min ；將吡啶在室溫吹乾後，加入少量的水，然後將殘餘物溶解於5 mL乙酸乙酯中，超聲波處理10min~30 min後,6000 rpm一15000 rpm下離心5 min一30 min,取上清液；將沉澱物用乙酸乙酯溶解，重複上述操作，合併上清液，將上清液減壓濃縮後備用；取濃縮物與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二環己基碳化二亞胺(DCC)溶於N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，室溫震蕩10mirT60 min，離心；將上清液緩慢滴加到牛血清白蛋白(溶於0.01 M-0.2 MNaHCO3溶液中)，在2~8°C震蕩2 h~3 h，然後，在0.01 M-0.2 M磷酸鹽緩衝液(PBS溶液)(pH7~8)中透析，換透析液3~8次；冷凍乾燥，偶聯物於_4°C一4°C保存。
6.根據權利要求2所述B類單端孢黴烯族毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:B類單端孢黴烯族毒素一卵清蛋白(OVA)偶聯物的製備:將B類單端孢黴烯族毒素溶解在吡啶中，在反應瓶中加入I一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，並通入氮氣；密封反應瓶，混合物在沸水浴中攪拌90 mirTl20 min;將吡啶在室溫吹乾後，加入少量的水，然後將殘餘物溶解於5 mL乙酸乙酯中，超聲波處理10min~30 min後,6000 rpm一15000 rpm下離心5 min一30 min,取上清液；將沉澱物用乙酸乙酯溶解，重複上述操作，合併上清液，將上清液減壓濃縮後備用；取濃縮物與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二環己基碳化二亞胺(DCC)溶於N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，室溫震蕩10mirT60 min，離心；將上清液緩慢滴加到卵清蛋白(溶於0.01 M-0.2 MNaHCO3溶液中)，在2~8°C震蕩2 h^3 h，然後，在0.01 M-0.2 M磷酸鹽緩衝液(PBS溶液)(pH7~8)中透析，換透析液31次；冷凍乾燥，偶聯物於-4 0C-4 °C保存。
7.根據權利要求2所述的B類單端孢黴烯族毒素酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:B類單端孢黴烯族毒素抗體及其溶液的製備:取B類單端孢黴烯族毒素一牛血清白蛋白偶聯物用生理鹽水配成0.1 μ g/μ L^lO μ g/μ L抗原溶液與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強免疫時用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫採用小鼠腹腔內直接注射，免疫劑量為10 yg/只~100 yg/只小鼠，以後每隔2周到4周加強免疫一次，加強免疫採用尾靜脈注射，免疫劑量為10 μ g/只~100μ g/只，最後一次免疫採用脾內注射，4天後取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細胞與處於對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10:1比列混合，離心，去除上清，在50 s^90 s內將0.1mL~10 mL50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中，充分混勻，使其溶解，f 3 min後加入10 mL飛O mLDMEM培養液，終止融合，水浴靜置10 mirT30 min後離心，去除上清；將融合細胞用含5%~30%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮後，以最後濃度為I X IO4^l X IO6飼養細胞/0.1 mL接種於以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，於59Tl0%C02，35°C —45°C條件下培養，5天一 10天後，每培養孔更換2/3 HT培養液，10天~20天後，開始對對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆，雜交瘤篩選採用固相抗原間接競爭ELISA法進行，以B類單端孢黴烯族毒素一卵清蛋白為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照；以SP-2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照；陽性細胞孔的判斷標準為(Aa^-Ase)/ (Aw-Ase) >2.1 ;對分泌陽性抗體的細胞進行克隆；採用有限稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養瓶內，倒置顯微鏡下準確計數細胞個數，稀釋為70個/mL，再取I mL稀釋至20倍，接種於96孔培養板中進行亞克隆，直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止；對10周齡~13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只5 mL/只；8天~10天後，腹腔注射培養至對數期的雜交瘤細胞，5X IO5細胞/只，5天後注意觀察，收集腹水，離心去除沉澱，加甘油於_4°C °C保存；上述反應成分的比列為:B類單端孢黴烯族毒素一卵清蛋白:生理鹽水=(10—1000)μ g: (0.1~10) mL。
8.根據權利要求2所述的B類單端孢黴烯族毒素酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:所述完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=(6^24) g:(10^40) mL:(0.05^0.5) g ;所述不完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂=(6~24)g:(10~40) mL。
9.根據權利要求2所述的B類單端孢黴烯族毒素酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的製備，其特徵在於:所述的酶標記的羊抗鼠抗體凍幹品為辣根或氧化物酶-羊抗鼠抗體凍幹品；所述濃縮洗滌液為含有吐溫和NaN3磷酸鹽緩衝液；所述濃縮復溶液為0.8 mol/LpH7.2-7.5的磷酸鹽緩衝液；所述顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液；所述顯色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
10.B類單端孢黴烯族毒素酶聯免疫吸附檢測專用測試盒的檢測方法，其特徵在於: O將待測樣本進行前處理，得到待測樣本溶液:a)所述待測樣品為穀物或飼料；取待測樣品溶於10%(體積百分含量)甲醇水溶液中，超聲波振蕩，過濾並收集濾液，即為待測樣本溶液；b)所述待測樣品為啤酒；將待測樣本攪拌，除去過量氣體，靜置得到上清液，即為待測樣本溶液；c)所述待測樣品為麥芽汁；直接作為待測樣本溶液； 2)用所述試劑盒對所述樣本進行檢測:取包被有B類單端孢黴烯族毒素-卵清蛋白的微孔包被板，加入50 μ L^lOO μ L的DON標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，加入50μ L^lOO μ L抗B類單端孢黴烯族毒素抗體，25°C左右孵育0.5 h~l h，洗滌液洗3~5次，加.50 μ L^lOO μ L辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，25°C左右孵育0.5~1 h，用洗滌液洗3~5次，加50 μ L~100 μ L顯色液A和50 μ L~100 μ L顯色液B，避光靜置10~20 min後加終止液，在450 nm處測其吸光度值，從標準曲線計算樣品中B類單端孢黴烯族毒素含量。
11.B類單端孢黴烯族毒素各主要毒素交叉反應率的檢測方法，其特徵在於用生物化學技術和B類單端孢黴烯族毒素適應方法，將D0N、3-Ac-D0N、15-Ac-D0N、NIV, FUS-X設為被測物，通過生物化學反應測定D0N、3-Ac-D0N、15-Ac_D0N、NIV、FUS-X的交叉反應係數，經測定，部分穀物D0N、3-Ac-D0N、15-Ac-DON、NIV、FUS-X的交叉反應係數是:
【文檔編號】G01N33/543GK103792347SQ201210435376
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月5日 優先權日:2012年11月5日
【發明者】杜道林, 吳灣灣 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司