一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法
2023-04-25 21:35:31 3
一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法
【專利摘要】本發明公開一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法。本發明是利用負載膜將所篩選菌株接種到印跡膜上進行誘導培養，所分泌的脂肪酶結合到印跡膜，再利用脂肪酶催化酯類水解的產物可與顯色劑顯色的原理對分泌型脂肪酶基因工程菌進行高通量篩選。本發明可篩選到具有特殊性能的分泌型脂肪酶基因工程菌，尤其是耐高溫、耐甲醇等脂肪酶基因工程菌株。本發明可對大量脂肪酶工程菌突變庫進行高通量篩選，在獲得篩選高效性的同時，保證了亞克隆庫的完整性，以便於實現對亞克隆庫多種條件下的篩選，適用範圍廣，操作簡單便捷，結果準確。
【專利說明】一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬於生物工程【技術領域】，具體涉及一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡 高通量篩選方法。
【背景技術】：
[0002] 脂肪酶是重要的工業酶製劑之一，可以催化脂解、酯交換、酯合成等反應，廣泛應 用於食品行業，造紙行業，皮革行業，飼料行業，醫藥催化合成，油脂奶酪加工及生物柴油生 產等行業。然而，脂肪酶本身是一種蛋白質，必須在一定的條件下才能發揮其催化作用，一 旦外界條件諸如溫度、pH及有機溶劑濃度等改變的情況下就容易失活。為了獲得酶活力更 高、性能更加穩定的脂肪酶，目前研宄人員通常採用分子進化、定點突變等方法對脂肪酶進 行改造，而這些方法都涉及脂肪酶突變文庫的構建及高通量篩選等步驟。一種高效的高通 量篩選方法是保證突變文庫順利進行篩選的關鍵因素。
[0003] 目前通常的脂肪酶高通量篩選方法是指示劑顯色法及水解圈法。這些方法涉及粗 酶大量發酵及酶活力測定等步驟，工作量大，耗費時間長。已有改進方法是對硝基苯酚顯色 法，通過將對硝基苯酚酯直接鋪在突變庫菌株的表面，再根據顏色反應篩選脂肪酶活力高 的菌株。該方法雖在篩選效率上有所提高，但是這些方法在保證亞克隆庫的完整性及特殊 條件下的篩選（如高甲醇濃度、高pH等）存在著一定的局限性。因此，迫切需要獲得一種 新型脂肪酶基因工程菌株的高通量篩選方法，既要保證篩選的高效性，又要保證亞克隆庫 的完整性，以便於實現對亞克隆庫多種條件下的篩選。
【發明內容】
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[0004] 本發明的目的是提供一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法。該 方法能夠篩選具有特殊性能的如耐高溫、耐甲醇及產酶活力高的分泌型脂肪酶基因工程 菌。
[0005] 本發明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵在於，包括 以下步驟：
[0006] (1)、將分泌型脂肪酶基因工程菌接種到基礎培養基上進行培養，所述的分泌型脂 肪酶基因工程菌含有能夠表達脂肪酶的表達載體，該表達載體上含有正常的或者經過突變 的脂肪酶基因表達盒；
[0007] (2)、將負載膜平置於步驟（1)中的接種有分泌型脂肪酶基因工程菌的基礎培養 基上，使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落轉移到負載膜上；
[0008] (3)、將印跡膜放置在誘導培養基上，再將步驟⑵中轉移了菌落的負載膜的含菌 落面正面朝向上置於印跡膜上，並根據被篩選工程菌菌株的最佳生長溫度進行誘導培養， 直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的脂肪酶基因充分表達；
[0009] (4)、將步驟（3)中的印跡膜取出，用緩衝液充分清洗，洗膜結束後將印跡膜取出， 將其浸在顯色溶液中，靜置一段時間直至顏色顯現，將印跡膜取出，再用緩衝液充分清洗；
[0010] (5)、觀測印跡膜的顯色情況，所顯顏色越深說明其菌株所產脂肪酶活力越高，根 據印跡膜上顏色較深點的相應位置確定在已保存的基礎培養基上表達該脂肪酶的相應位 置。
[0011] 所述的分泌型脂肪酶基因工程菌，優選為酵母或細菌。
[0012] 所述的酵母，優選為畢赤酵母。
[0013] 所述的畢赤酵母，優選為畢赤酵母GS115或畢赤酵母X33。
[0014] 所述的能夠表達脂肪酶的表達載體，優選為酵母表達載體，所述的酵母表達載體 為能將蛋白分泌到胞外的表達載體。
[0015] 所述的酵母表達載體，優選為酵母表達載體pPIC9K或酵母表達載體pPICZaA。
[0016] 所述的基礎培養基為相應菌株的最適生長培養基，優選為MD固定培養基或YH)固 體培養基。
[0017] 所述的負載膜為能在菌落轉移中起負載作用並能夠支撐菌株生長的薄膜，優選為 醋酸纖維素膜或濾紙膜，負載膜的大小與培養皿相適應。
[0018] 所述的印跡膜為具有一定通透性、菌株能夠透過其吸取下層營養物質且能夠高效 吸附分泌蛋白的薄膜，優選為硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜，所述的印跡膜，其孔徑大小 優選為〇. 22?0. 45 ym，印跡膜的大小與培養皿相適應。
[0019] 所述的誘導培養基為分泌型脂肪酶基因工程菌表達脂肪酶的培養基，優選為添加 了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培養基。
[0020] 配製好液體的基礎培養基及誘導培養基後分別倒入培養皿中形成固體培養基，所 述的培養皿為方形或圓形，優選為圓形，直徑大小為5?15_，優選為9_。
[0021] 步驟（3)中所述的誘導培養，誘導時間優選為12?48h。
[0022] 所述的緩衝液為具有合適pH值、乳化劑等能夠使目的脂肪酶穩定的緩衝液，優選 為添加了 〇? 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100 的 pH8. 0 磷酸緩衝液。
[0023] 所述的顯色溶液為一種能夠被脂肪酶水解的酯類和一種能夠與該酯類顯色的顯 色劑組合，優選為：fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕櫚酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕櫚酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
[0024] 優選，在步驟（3)和（4)之間還包括步驟：將印跡膜置於高溫下及高濃度的有機溶 液中進行處理，從而在之後的步驟中獲得該溫度下及該濃度的有機溶液下酶活穩定的脂肪 酶及其菌株。
[0025] 所述的將印跡膜置於高溫下，優選溫度為不低於55°C，所述的高濃度的有機溶液， 優選為55 %的甲醇水溶液。
[0026] 本發明中涉及到印跡膜的顯色，顯色原理為：脂肪酶與能被其水解的酯類發生作 用，生成能與顯色劑進行顯色的物質，通過顏色作為初步篩選的依據。
[0027] 本發明的優點在於：
[0028] (1)、可高通量地篩選分泌型脂肪酶的基因工程菌，更優選的，能夠高通量篩選到 具備特殊性能脂肪酶基因工程菌；
[0029](2)、方便快捷，節約成本，結果靈敏準確；
[0030](3)、本發明的方法不涉及對菌株進行直接添加化學物質，不會影響菌株的生長及 活性，保證亞克隆庫的完整性，以便於實現對亞克隆庫多種條件下的篩選；
[0031] (4)、本發明操作步驟簡單，材料價格低廉容易獲得；
[0032] (5)、本發明適用範圍廣泛，適用於細菌、酵母、真菌等。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0033] 圖1是本發明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法的示意圖，其 中（1)為在基礎培養基上放置負載膜（左側，淺藍色表示），在誘導培養基上放置印跡膜 (右側，黃色表示）；（2)將負載膜180°翻轉使菌落面正面朝上並轉移到印跡膜上，並進行 誘導培養，菌株產生的脂肪酶印跡到印跡膜上；（3)培養結束後將帶有脂肪酶的印跡膜轉 移到另一個器皿中；（4)在膜上分別添加緩衝液、甲醇及顯色溶液處理；(4)染色結果，顏 色深的為陽性克隆；
[0034] 圖2是對不同產酶能力大小的分泌型脂肪酶基因工程菌的篩選結果，其中，1?6 為不同產脂肪酶活力的米黑根毛黴脂肪酶基因酵母工程菌，9K為將pPIC9K質粒轉化到畢 赤酵母GS115的基因工程菌，作為陰性對照；
[0035] 圖3是對脂肪酶突變文庫進行高通量篩選的結果，箭頭所示A1?A5菌株為所挑 選的產脂肪酶能力較大的基因工程菌菌株；
[0036] 圖4是在脂肪酶基因工程菌突變文庫中對耐高溫脂肪酶基因工程菌菌株進行高 通量篩選的結果，箭頭所示B1及B2菌株為所挑選的耐高溫脂肪酶基因工程菌菌株；
[0037] 圖5是在脂肪酶基因工程菌突變文庫中對耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株進行高 通量篩選的結果，箭頭所示C1?C6菌株為所挑選的耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株。
【具體實施方式】：
[0038] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0039] MD固體培養基、YPD固體培養基、BMMY固體培養基、磷酸緩衝液的配製方法為現有 技術。
[0040] 質粒pPIC9K、畢赤酵母GS115、畢赤酵母X33均購自LifeTechnologies公司。
[0041] 濾紙膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、醋酸纖維素膜及PVDF膜均購自上海生物工程股 份有限公司。
[0042] 其他沒有詳細說明的技術步驟均為本領域人員所熟知的方法。
[0043] 實施例1 :不同產酶活力的脂肪酶基因工程菌的篩選
[0044] 將米黑根毛黴脂肪酶基因rml與pPIC9K質粒同時用EcoR I及Not I雙酶切，用 T4連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，將轉化後細胞塗布於含有l〇〇ug/mL 氨苄青黴素的LB平板中，37°C倒置培養12?16h後從平板上挑取2?5個單菌落，接種 於LB液體培養基中，37°C、250r/min振搖過夜。用質粒試劑盒進行質粒DNA的小量提取， 用EcoRI及Not I雙酶切鑑定，獲得連接成功的pPIC9K-rml質粒。將pPIC9K-rml質粒用 Sal I進行線性化並電轉化至宿主菌畢赤酵母GS115上，塗布於MD平板上，28°C培養2-3d 後獲得產酶能力大小不同的米黑根毛黴脂肪酶基因酵母工程菌菌株。
[0045] 將產酶能力大小不同的6個米黑根毛黴脂肪酶基因酵母工程菌菌株（見表1)及 已轉化了PPIC9K質粒的畢赤酵母GS115工程菌菌株（作為陰性對照），分別接種於含有MD 固體培養基的直徑為9mm的培養皿上，30°C培養至長出相應單菌落；將直徑為9mm的濾紙 膜平置於MD固體培養基上，用塗布棒輕壓使濾紙膜完全溼潤並趕盡氣泡，使所有菌落轉移 到濾紙膜上，將該MD固體培養基平板置於4°C保存；在另一個直徑為9mm的培養皿的添加 了 0. 5%甲醇的BMMY固體培養基平板上平置一張同樣大小的孔徑為0. 2ym的硝酸纖維素 膜，趕出氣泡；將轉移了菌落的濾紙膜的菌落面正面朝上置於硝酸纖維素膜上，趕出氣泡， 在30°C下誘導培養36h;培養結束後將下層的硝酸纖維素膜取出，用含0. 75mg/mLNaCl、 1%TrritonX-100的pH8. 0磷酸緩衝液洗膜5min，重複3次，洗膜結束後將硝酸纖維素膜 取出，將其浸在fastblueRR萘酯水溶液（含萘酯0.4mg/ml，fastblueRR0.2mg/m)中進 行顯色，靜置一段時間直至顯色，再將硝酸纖維素膜取出，同樣用含〇.75mg/mLNaCl、l% TrritonX-100的pH8. 0磷酸緩衝洗膜5min;觀測硝酸纖維素膜的顯色情況，如圖2所示， 顯紫色的為陽性克隆的產酶能力大小不同的6個米黑根毛黴脂肪酶基因酵母工程菌菌株 的蛋白印跡，而陰性對照並沒有顯色，紫色圈大小與菌落的產酶能力相符。
[0046] 表1.產酶能力大小不同的6個米黑根毛黴脂肪酶基因酵母工程菌菌株
[0047]
【權利要求】
1. 一種分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵在於，包括以下步 驟： (1) 將分泌型脂肪酶基因工程菌接種到基礎培養基上進行培養，所述的分泌型脂肪酶 基因工程菌含有能夠表達脂肪酶的表達載體，該表達載體上含有正常的或者經過突變的脂 肪酶基因表達盒； (2) 、將負載膜平置於步驟（1)中的接種有分泌型脂肪酶基因工程菌的基礎培養基上， 使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落轉移到負載膜上； (3) 、將印跡膜放置在誘導培養基上，再將步驟（2)中轉移了菌落的負載膜的含菌落面 正面朝向上置於印跡膜上，並在一定溫度下誘導培養，直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的 脂肪酶基因充分表達； (4) 、將步驟（3)中的印跡膜取出，用緩衝液充分清洗，洗膜結束後將印跡膜取出，將其 浸在顯色溶液中，靜置一段時間直至顏色顯現，將印跡膜取出，再用緩衝液充分清洗； (5) 、觀測印跡膜的顯色情況，所顯顏色越深說明其菌株所產脂肪酶活力越高，根據印 跡膜上顏色較深點的相應位置確定在已保存的基礎培養基上表達該脂肪酶的的相應位置。
2. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌為酵母或細菌。
3. 根據權利要求2所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的酵母為畢赤酵母，進一步為畢赤酵母GS115或畢赤酵母X33。
4. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的能夠表達脂肪酶的表達載體為酵母表達載體，進一步為酵母表達載體PPIC9K 或酵母表達載體pPICZaA。
5. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的基礎培養基為MD固定培養基或YH)固體培養基；所述的誘導培養基為添加了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培養基。
6. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的負載膜為醋酸纖維素膜或濾紙膜，負載膜的大小與培養皿相適應；所述的印跡 膜為硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜，其孔徑大小為0. 22?0. 45 ym，印跡膜的大小與培養 皿相適應。
7. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，步驟（3)中所述的誘導培養，誘導時間為12?48h。
8. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特徵 在於，所述的緩衝液為添加了 〇. 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100的pH8. 0磷酸緩衝液； 所述的顯色溶液為fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕櫚酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕櫚酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
9. 根據權利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特 徵在於，完成步驟（3)的誘導培養之後，將印跡膜置於高溫下及高濃度的有機溶液中進行 處理，從而在之後的步驟中獲得該溫度下及該濃度的有機溶液下酶活穩定的脂肪酶及其菌 株。
10.根據權利要求9所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印跡高通量篩選方法，其特 徵在於，所述的高溫為不低於55°C，所述的高濃度的有機溶液為55%的甲醇水溶液。
【文檔編號】C12Q1/44GK104450866SQ201410576815
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】呂鵬梅, 何東, 王治元, 袁振宏, 羅文 , 劉姝娜, 李志兵, 楊改秀, 楊玲梅 申請人:中國科學院廣州能源研究所