黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的製備方法及其專用工程菌及發酵培養基的製作方法

2023-04-25 21:28:36

專利名稱：黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的製備方法及其專用工程菌及發酵培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域中質粒DNA疫苗的製備方法及其專用工程菌及高產發酵培養基，特別是涉及一種黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的製備方法及其專用工程菌及高產發酵培養基。
背景技術：
質粒DNA疫苗是近年來經研究發現的一種極具發展潛力的新疫苗，從上世紀九十年代初期質粒DNA疫苗受到了科學家的關注，到現在發展近三十年，已經有了長足的發展。質粒DNA疫苗具有高安全性、無載體免疫原性和易於生產等特點，因此，同活病毒和病毒基礎的疫苗相比，其具有獨特的優勢。數百項疫苗進入臨床試驗階段，目前已有4種動物用質粒 DNA 疫苗及產品上市(Michele AK, David BW.DNA vaccines:ready for primetime Nature Reviews Genetics, 2008，9:776-788.)，人用質粒 DNA 疫苗及產品呼之欲出。因此，隨著質粒DNA疫苗及產品的快速發展，建立符合藥用標準的質粒DNA的大規模生產平臺成為一個重大的研究課題。本發明針對質粒DNA疫苗的發酵工藝進行探索，是質粒DNA疫苗大規模生產發展中的基石，其重要性不言而喻。在質粒DNA疫苗大規模生產中，建立穩定的質粒DNA (或簡稱質粒)的種子庫非常關鍵，由於質粒DNA (pSVK-CAVA)的分子量比較大，達到15kb左右，對於宿主菌是一種沉重的負擔，在宿主菌的生長過程中，極易造成質粒DNA的不穩定性。質粒DNA的不穩定性，是指工程菌在生長過程中質粒DNA發生變化，結果不呈現原有的表型特徵。質粒DNA的不穩定可分為兩類:分離不穩定性和結構不穩定性(Filomena AQ, Fernanda OIPlasmid DNAfermentation stratagies:1nfluence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology, 2012，93:2571-2580.)。分離不穩定是指在細胞分裂中由於缺陷分配引起部分或全部質粒DNA的丟失；結構不穩定則是由於質粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，質粒DNA的分配不穩定性和結構不穩定性的結果都將使我們得不到預期的質粒DNA產量和質量。如果發生質粒DNA的分離不穩定，由於部分質粒DNA的丟失，工程菌的發酵過程實際上是工程菌和不含有質粒DNA的宿主菌的混合培養(ClarenceMO，Raelene P，Diane Wj et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-basedMeasles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation andpH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011， 10:16.do1: 10.1186/1475-2859-10-16.)，在非選擇性條件下，含有質粒DNA的工程菌的比生長速率(μ+)往往小於宿主細胞的比生長速率(μ _)，經過25代後，培養液中幾乎都是無質粒DNA的細胞。由此可見，設計和篩選一種合適的工程菌來提高質粒DNA的生產率是非常重要的。培養基對質粒的穩定性和質粒質量也起著非常重要的作用，Silva (Silva, Filomena, Passarinha Lj et al.1nfluence of growth conditions onplasmid DNA production.Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，19(11) :1408-1414.)研究表明質粒在以葡萄糖作為碳源時的丟失頻率大於以澱粉為碳源的培養基。FDA認為開環和線性化質粒DNA的治療效果不如超螺旋質粒DNA(Food andDrug Administration(FDA), Guidance for industry: considerations for plasmiddeoxyribonucleic acid vaccines for infectious disease indications, 2007, http://www. fda. gov/cber/gdlns/plasdnavac. htm.),然而質粒DNA的幾種形態在純化的過程中很難分開，所以在發酵過程中應該在如何得到高比例的超螺旋質粒DNA方面進行優化(Ying C，Rodriguez S，Hebel H. DNA vaccine manufacture: scale and quality. ExpertReviews Vaccines, 2009, 8 (9) : 1277-1291.)。由此可見,設計和篩選一種合適的工程菌發酵培養基來提高質粒DNA的生產率是至關重要的。

發明內容
本發明的一個目的是提供一個穩定性高、能多次傳代的用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌。本發明所提供的用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是轉化有黑色素瘤治療性質粒DNA pSVK-CAVA (或稱PSCK_2PFcGB)的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為 E.coli XLIO-Gold/CAVA。將黑色素瘤治療性pSVK-CAVA質粒DNA轉化大腸桿菌XLlO-Gold得到轉化菌XLlO-Gold,轉化方法包括但不限於Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和電擊轉化法。將轉化菌XLlO-Gold塗布於LB固體平板培養基，在37°C、200rpm下培養15小時後挑取單克隆菌落；將單克隆菌落接種於5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後按照1:100進行連續傳代培養，12小時轉接傳代I次，可連續傳代30代；單克隆菌株以及傳代30代以內歷次傳代菌株均為轉化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌。用氯化鈣法轉化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌，轉化方法為將-70 V保存的100 μ I感受態細胞XLlO-Gold於`冰浴中解凍10分鐘，然後加入pSVK-CAVA質粒DNA25-50ng,輕柔混勻後,置冰浴中30分鐘；冰浴結束後，於42°C水浴中熱擊90秒，後迅速置於冰浴中冷卻3-5分鐘，加入800 μ I無抗性的LB液體培養基，混勻後於37 °C，200rpm振蕩培養I小時，得到pSVK-CAVA質粒DNA的轉化菌XLIO-Gold。本發明另一目的是提供一種用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的
高產發酵培養基。該製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發酵培養基ITB，每IL培養基含酪蛋白腖 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17moI/LKH2PO4和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 O. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。較佳的，每IL培養基含酪蛋白腖12g，酵母提取物16.61g，甘油3. 05mL，NH4ClIg, 0. 17mol/L KH2PO4 和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 IOOmLjMgSO4 0. 185g，微量元素 ImL0所述發酵培養基ITB中，微量元素包括=FeCl3 · 6H20 27g/L、ZnCl2 2g/L、CoCl2 · 6H202g/L、Na2MoO4 · 2H20 2g/L、CaCl2 · 2H20 lg/L,或無水 CaCl2 0. 76g/L、CuCl2 · 2H201. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶於 I. 2mol/L HCl。所述發酵培養基ITB中，K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配製方法為用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶解後，用去離子水定容至100mL。
本發明還一目的是提供一種行之有效的用上述工程菌和發酵培養基來進行黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA生產的方法。本發明提供的黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產方法，是復甦一支所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按體積比1:100比例接種於5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時，按照1:100再轉接於IOOmL的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養12小時左右，得到種子液；將種子液按體積比1:100的量接種於含3L所述發酵培養基ITB的5L發酵罐內，pH值控制在7.0±0.1，培養溫度為37 °C，溶解氧控制在30%左右，發酵培養6h ;之後按照lmL/min的流速補加發酵培養基ITB，總共補加500mL，發酵15小時後，結束髮酵，收菌，提取質粒，得到黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA。本發明還一目的是提供生產黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫的構建方法及種子庫產品。該種子庫的構建包括:·
I)製備原始種子庫:將所述工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液0.5mL擴大至IOOmL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時，加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到原始種子庫；2)製備主種子庫:復甦一支原始種子接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，並分裝50管得到主種子庫，凍存於-70°C冰箱，得到主種子庫；3)製備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到工作種子庫；每支工作種子庫中的菌種限傳5代用於權利要求9黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產。以上構建得到的包括原始種子、主種子以及工作種子在內的種子庫及各種子均為本發明內容。質粒DNA的穩定性和工程菌發酵培養基是影響質粒產量的重要因素，本發明為了能提供一個穩定性高、能多次傳代的用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌以滿足中試工藝的需求，首先通過實驗對宿主菌進行了優化篩選，最終發現大腸桿菌XLlO-Gold是一個更利於該質粒DNA擴增的宿主菌，將攜帶質粒pSVK-CAVA的工程菌命名為E.coli XLIO-Gold/CAVA，質粒pSVK-CAVA以大腸桿菌XLlO-Gold為宿主菌時，表現出了同常規質粒DNA類似的穩定性，能轉接傳代30次也未發生重組或片段丟失，這可能與大腸桿菌XLlO-Gold的特性有關係，因為該菌具有一個大分子量質粒高效轉化基因；除了保持質粒DNA在宿主菌中的穩定傳代以外，質粒DNA生產工藝中極為重要的一個方面是質粒DNA的高產量問題，想要得到較高的產品量，必須使攜帶質粒的工程菌具有較高的菌體量，一般要經過優化培養基的成分和特殊的發酵(補料分批發酵)策略來實現，而理想的發酵培養基是獲得高產量的首要條件，因此，分別用單次單因子法和響應面法對其最適培養基進行了篩選和優化，單次單因子法優化結果顯示，TB培養基是其最適基礎培養基，質粒的容積產率為9.9mg/L,明顯高於LB和M9培養基；最適碳源和氮源分別是甘油和酪蛋白腖；PB實驗結果表明，影響質粒產量的3個主要影響因子為酵母提取物、甘油、MgSO4，最後經過最陡爬坡和CXD優化後，確定了工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA發酵培養基ITB的成份和水平，在500mL搖瓶的發酵規模下，質粒的容積產率達到12.38mg/L,是基礎培養基LB發酵產量的2倍以上。綜上所述，本發明的工程菌及培養基將在黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發酵生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA連續傳代30代，每隔5代抽提質粒，用PVU I進行單酶切，用PVU I和Spe I進行雙酶切的酶切鑑定結果圖2為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA連續傳代30代，每隔5代抽提質粒，質粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖3為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA的平板點種結果圖4為工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA的革蘭氏染色鏡檢結果圖5為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在生化檢測培養基中的生長情況圖6A為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4種培養基中隨培養時間菌密度的變化情況圖6B為工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在4種培養基生長的工程菌中質粒的結構I %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖7為不同碳源對工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA質粒產量(容積產率)影響的柱狀8為不同氮源對工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA質粒產量(容積產率)影響的柱狀9為三個顯著影響因子交互作用對質粒產量(容積產率)影響的曲面圖和等值線圖
具體實施例方式本發明的發明人前期經研究獲得了具有突出原創性的基於甲病毒複製子載體的新型黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA (參見文獻:張亮，閻瑾琦，王越，等.可複製型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構建及體內外表達[J].南方醫科大學學報，2011,3(6):937-942.該文獻中命名「PSCK_2PFcGB」的可複製型抗腫瘤DNA疫苗即為本發明黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA，發明人為商業推廣在本發明中對該疫苗進行了重新命名)，初步藥效學研究顯示，該疫苗可以有效地誘導小鼠體內特異的細胞免疫及體液免疫應答，能夠有效地抑制移植瘤的生長。目前正在進行該疫苗的中試工藝及質量控制體系的建立，以促進該新型黑色素瘤治療性疫苗的進一步發展。基於甲病毒複製子載體的質粒DNA疫苗一般分子量都較大，能達到14kb以上，而黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA分子量接近15kb，分子量如此大的質粒DNA (命名為「pSVK-CAVA質粒DNA」或「質粒DNA pSVK-CAVA」)無論是在上遊的設計和構建，還是到下遊的提取和工藝研究，都具有較大的挑戰性。前期的實驗發現:在以大腸桿菌DH5ci為宿主菌時，隨著傳代次數的增加，該質粒DNA疫苗會發生分子量變小的情況，代數越多變小的情況越嚴重，到最後提取的質粒已經不是所需要的目的質粒，這對於後續的中試工藝研究以及產品的發展極為不利。發明人進一步分析研究，由於質粒在宿主菌裡發生了重組或丟失，造成這種現象的原因可能是由於宿主菌本身負荷過大的問題，也可能是質粒分子量過大或由於其源於甲病毒，易發生重組或片段丟失等自身原因造成的。造成宿主菌裡質粒發生重組或片段丟失與質粒本身的特性以及宿主菌等都有一定的關聯，首先黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA是一種基於病毒的載體，比常規的質粒DNA更易發生重組或片段丟失；另外，由於該質粒pSVK-CAVA自身相對分子質量將近15kb，在宿主菌裡複製時會給菌體造成嚴重的負荷，從而引發質粒的不穩定性增加，產生上述截短質粒的情況。想要解決上述問題，發明人提出篩選質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的最適宜宿主菌，並進行培養基成分的優化。因此，第一方面，本發明提供一種用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，其是轉化有黑色素瘤治療性質粒DNA pSVK-CAVA的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為 E. coli XLIO-Gold/CAVA。可用本領域技術人員熟知的常規技術，將黑色素瘤治療性質粒DNA pSVK-CAVA轉化大腸桿菌XLlO-Gold,轉化方法包括但不限於Hananhan法(分子克隆實驗指南(第三版)87-92頁)、Inoue法(分子克隆實驗指南(第三版)93-96頁)、氯化鈣法(分子克隆實驗指南(第三版)96-99頁)、電擊轉化法(分子克隆實驗指南(第三版)99-102頁)。另一方面，本發明還提供一種用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高產發酵培養基(ITB)。每IL該培養基中含酪蛋白腖12g，酵母提取物16.61g，甘油3. 05mL, NH4Cl Ig, O. 17mol/L KH2PO4 和 O. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 lOOmL，Mg2SO4O. 185g，微量元素 lmL，微量元素包括 FeCl3 · 6H20 27g/L, ZnCl2 2g/L、CoCl2 · 6H202g/L、Na2MoO4 · 2H202g/L、CaCl2 · 2H20 lg/L 或無水 CaCl2 0. 76g/L、CuCl2 · 2H20 I. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶於I. 2mol/L HCl ;所述K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配製方法是用90mL去離子水溶解2. 31gKH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶`解後，用去離子水定容至lOOmL。還一方面，本發明還提供一種用上述工程菌和高產發酵培養基生產黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法。該方法是I)種子液的製備從_70°C復甦一支E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按1:100接種於5mL的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養12小時。按照1:100再轉接於IOOmL的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養12小時左右，此時得到種子液；2)發酵培養將種子液按照1:100的量種於5L發酵罐(中試生產)內進行發酵培養，發酵罐內含有高產發酵培養基ITB的量為3L，pH值控制在7. 0±0. I (通過發酵罐自動補入H2SO4和NH3. H2O來調節培養基的pH值)，培養溫度為37°C，溶解氧控制在30%左右(當溶解氧降低到該值時，通過補充純氧和提高攪拌速度來調節)。發酵培養6h後，按照ImL/min的流速補加高產發酵培養基ITB，總共補加500mL。發酵15小時後，結束髮酵，收菌，提取質粒，得到黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA。本發明還構建多級種子庫，所述E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子來源於該種子庫。種子庫的構建過程包括I)製備原始種子庫JfE. coli XLIO-Gold/CAVA工程菌菌液0. 5mL擴大至IOOmLLB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時，加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到原始種子庫；2)製備主種子庫:復甦一支原始種子接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，並分裝50管得到主種子庫，凍存於-70°C冰箱，得到主種子庫；3)製備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到工作種子庫，每支工作種子庫中的菌種限傳5代，用於黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.,Russell,David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(mg/100ml)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。實施例中描述到的的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。 實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助於理解本發明，但是本發明的保護範圍不限於下述的實施例。 實施例1、黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高穩定性宿主菌的篩選及穩定性檢測將黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA質粒DNA分別轉化不同基因型的大腸桿菌感受態細胞DH5 a ,DHlO β ,ToplO和XL10_Gold，轉化方法為Hananhan法(分子克隆實驗指南(第三版)87-92頁)、Inoue法(分子克隆實驗指南(第三版)93-96頁)、氯化鈣法(分子克隆實驗指南(第三版)96-99頁)、電擊轉化法(分子克隆實驗指南(第三版)99-102頁)。以氯化鈣法轉化XLlO-Gold為例進行示例性說明:pSVK-CAVA質粒DNA的獲得參見文獻(張亮，閻瑾琦，王越，等.可複製型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構建及體內外表達[J],南方醫科大學學報，2011，3 (6):937-942.)。該文獻中命名「PSCK-2PFcGB」的可複製型抗腫瘤DNA疫苗即為本發明黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗「pSVK-CAVA」，發明人為商業推廣在本發明中對其進行了重新命名。本發明中pSVK-CAVA質粒DNA即為文獻中介紹的PSCK_2PFcGB質粒。從_70°C冰箱中取100 μ I感受態細胞XLlO-Gold,立即於冰浴中解凍10分鐘，然後加入pSVK-CAVA質粒DNA25-50ng，輕柔混勻後，置冰浴中30分鐘。冰浴結束後，於42°C水浴中熱擊90秒，後迅速置於冰浴中冷卻3-5分鐘，向管中加入800 μ I無抗性的LB液體培養基，混勻後於37°C，200rpm振蕩培養I小時，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的抗生素抗性基因，此時得到pSVK-CAVA質粒DNA的轉化菌XL10_Gold。將轉化菌XLlO-Gold塗布於LB(Luria_bertani Medium)固體平板培養基(LB液體培養基配方:胰蛋白腖IOg,酵母提取物5g, NaCl 10g,加入蒸懼水溶解，5mol/LNa0H調節pH至7.0，定容至lOOOmL，高壓滅菌後4°C保存備用。LB固體平板培養基則是在LB液體培養基中加入瓊脂(15g/L)，高壓滅菌，當溫度降至50°C時加入硫酸卡那黴素至終濃度為20 μ g/mL,以下培養基均為此抗性水平)，在37°C、200rpm下培養15小時後挑取單克隆菌落，接種於5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後按照1:100進行連續傳代培養(12小時轉接傳代I次)，傳代之前取ImL菌液抽提質粒，通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的形態以及超螺旋比例，紫外分光光度計測量質粒濃度，聯合連續傳代法(每12小時轉接I代)對工程菌的穩定性進行檢測。轉化有pSVK-CAVA質粒DNA的大腸桿菌XLlO-Gold工程菌連續傳代30代，每隔5代抽提質粒，用PVU I進行單酶切，用PVU I和Spe I進行雙酶切，酶切鑑定結果如圖1所示(M:DL15000Marker ；1:質粒 pSVK-CAVA ；2:PVU I 單酶切片段；3:PVU I 和 Spe I 雙酶切片段)，用PVU I單切得到14748bp線性化質粒片段，用PVU I和Spe I雙酶切得到12751bp和1997bp兩個DNA片段，與預期結果一致，表明質粒的結構穩定性良好。轉化有pSVK-CAVA質粒DNA的大腸桿菌XLlO-Gold工程菌連續傳代30代，每隔5代抽提質粒，質粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示(1:原代；2:5代；3:10代；4:15代；5:20代；6:25代；7:30代；M:DL15000Marker)，工程 菌表現出良好地遺傳穩定性，質粒拷貝數基本保持穩定，同時保持了較高的超螺旋比例。本實施例用示例的方法對4種備選宿主菌進行篩選，結果都能成功生長單克隆；挑取單克隆進行傳代培養，其中大腸桿菌DH5a、DHlO β , Τ0Ρ10在傳代2次以後均出現不同程度的質粒重組和丟失，而且往下繼續傳代，這種重組和丟失情況變得更加嚴重，傳代5次之後就幾乎沒有原質粒了。但是大腸桿菌XL10-G0LD能夠很好的保持質粒進行穩定的拷貝，傳代30代後依然很穩定，非常適合作為高達15kb之大的黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，解決了大質粒容易發生重組和丟失這一難題。本發明將該轉化有pSVK-CAVA質粒DNA的大腸桿菌XL10_Gold，命名為「黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA」。經鑑定(參見實施例2)，該工程菌表現出良好地遺傳穩定性，質粒拷貝數基本保持穩定，同時保持了較高的超螺旋比例。利用該工程菌建立三級種子庫，可將E.coli XLIO-Gold/CAVA菌液擴大至IOOmLLB液體培養基(配方:胰蛋白腖IOg,酵母提取物5g, NaCl 10g,加入蒸懼水溶解,5mol/LNaOH調節pH至7.0，定容至IOOOmL,高壓滅菌後4°C保存備用。)培養，在37°C、200rpm下培養12小時，加入30%甘油，分裝50管並凍存於_70°C冰箱，得到原始種子庫。復甦一支原始種子接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，並分裝50管作為主種子庫，凍存於-70°C冰箱。從主種子庫中取I管菌種，按上述方法操作，凍存50管作為工作種子庫，用於常規生產。每支工作種子庫中的菌種限傳5代。實施例2、黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA工程菌E.coliXL10-Gold/CAVA的鑑定—、工作種子庫遺傳穩定性和結構穩定性檢測37°C水浴加熱復甦I支工作種子，按接種於5mL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後1:100傳代，以此方法連續傳代30代，選原代、5代、10代、15代、20代、25代、30代菌液抽提質粒，經I %瓊脂糖凝膠電泳及酶切檢測工作種子庫的結構穩定性。結果工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA連續傳代30代，每隔5代抽提質粒，質粒的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜(見圖2)表明工程菌表現出良好地遺傳穩定性，質粒拷貝數基本保持穩定，同時保持了較高的超螺旋比例；此外，用PVUl單切得到14748bp線性化質粒片段，用PVU I和Spe I雙酶切得到12751bp和1997bp兩個DNA片段，與預期結果一致，表明質粒的結構穩定性良好。二、工作種子庫的質粒丟失率檢測對第30代菌液檢測質粒丟失率，取第30代菌液稀釋後鋪於不含卡那黴素的LB平板上培養過夜，選取100個單克隆點種於含20iig/mL卡那黴素的LB平板上，在37°C、200rpm下培養15個小時,計數生長的單克隆菌落數,計算質粒丟失率質粒丟失率=(100-在平板上長出的菌落數)/100 X 100 %。結果如圖3所示,生長了 100個點,質粒丟失率為0,表明該質粒在宿主菌中具有良好的分離穩定性，傳代30代後依然保持穩定。二、細菌形態和革蘭氏染色特徵及其生化特徵工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA的革蘭氏染色鏡檢圖如圖4 (放大倍數1000倍)所示，根據鏡檢顯示，工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA為桿菌，革蘭氏染色為紅色(圖中顯示為深色)，說明是革蘭氏陰性菌。還考察了工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在含葡萄糖、乳糖、甘露醇三種不同糖類培養基中的生長情況，方法為將工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA以穿刺的方法接種在生化檢測培養基[配方用鄧亨氏(Dunham)蛋白腖水溶液(蛋白腖lg，氯化鈉0. 5g，水lOOmL，pH7. 6)，每IOOmL加入I. 2mL的0. 2 %溴麝香草酚藍作指示劑。在培養基中加入瓊脂達0. 5-0. 7%，分裝於試管，高壓滅菌10分鐘。0. 2%溴麝香草酚藍溶液配法溴磨香草酹藍0. 2g, 0. lmol/L Na0H5mL,蒸懼水95mL。
`
在37°C、200rpm下培養24小時，觀測其發酵和產氣情況，分析生化特徵。結果如圖5所示，工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在葡萄糖和甘露醇培養基中出現黃色(圖中淺色部分)，在乳糖培養基中未出現黃色，試管溶液顯示為藍色(圖中深色部分)，說明工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA能夠發酵葡萄糖、甘露醇，不能發酵乳糖，兩種變黃的培養基中都沒有氣泡的產生，說明工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA發酵過程中不產氣。實施例3、不同基礎培養基對工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA生長和質粒產量(容積廣率)的影響為了找出適合工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA生長和質粒生產的培養基，將工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA在四種不同的細菌培養基中進行培養LB——配方胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入蒸餾水溶解，5N NaOH調節pH至7. 0，定容至IOOOmL,高壓滅菌後4°C保存備用。TB——配方酪蛋白腖12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加入蒸餾水溶解，定容至900mL，高壓滅菌後4°C保存備用。當溶液冷卻至50°C時加入IOOmL無菌的0. 17mol/LKH2PO4,0. 72mol/L K2HPO4溶液。該溶液的配製方法是用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4,完全溶解後,用去離子水定容至IOOmL並高壓滅菌20min。M9 (葡萄糖)-配方5XM9 鹽溶液 200mL, lmol/LMgS04 2mL, 20 %葡萄糖溶液
20mL, lmol/LCaCl2 0. ImL,滅菌的蒸懼水定容至1000mL。5XM9鹽溶液的配製方法用蒸懼水溶解下列鹽類，終體積為 IL =Na2HPO4.7H20 64g，KHPO4 15g，NaCl 2.5g, NH4Cl 5.0g，高壓滅菌後4°C保存備用。M9 (甘油)--配方:5XM9 鹽溶液 200mL，ImoI/LMgSO4 2mL，20%甘油溶液 20mL，
ImoVLCaCl2 0.lmL，滅菌的蒸餾水定容至lOOOmL。5XM9鹽溶液的配置方法:用蒸餾水溶解下列鹽類，終體積為 IL =Na2HPO4.7H20 64g，KHPO4 15g，NaCl 2.5g, NH4Cl 5.0g，高壓滅菌
後4 C保存備用。培養方法為:復甦一支E.coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按1:100接種於5mLLB培養基中，37°C、200rpm培養12小時，1:100傳代一次後接種於IOOmL上述四種基礎培養基中，每隔3h取ImL菌夜，一部分用於測定菌體密度(採用分光光度計測定600nm波長的A值一0D600)監測菌體生長情況，一部分用於小量提取質粒並測定質粒濃度，發酵結束後取IOmL菌液離心洗滌後，烘乾並測菌體乾重。菌體的乾重通過分析天秤進行測定，具體操作:乾燥的EP管，準確稱重(Gl)，取大腸桿菌發酵液5mL，8000rmp離心lOmin，棄上清，沉澱用PBS洗滌兩次，將沉澱連同離心管置於烘箱中，80°C乾燥至恆重(約24h)，在乾燥器中冷卻至室溫，準確稱重(G2)，菌體乾重為G2-G1。最終取每個發酵菌液3次平行樣品測量結果的平均值。選擇菌體生長情況最佳、質粒容積產率最高和質粒特異性產率最好的培養基作為基礎發酵培養基。在不同培養基中的菌體密度測定結果如圖6A所示，菌體生物量、質粒容積產率和特異性產率如表I所示，可以看到工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA在TB培養基體現出了明顯的生長優勢，特別是容積產率，比LB培養基有了較大的提升。在不同培養基生長的工程菌中質粒的I %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖6B (M:DL 15000Marker ；1:LB培養基；2:TB培養基；3:M9 (甘油)培養基；4:M9 (葡萄糖)培養基)所示，2號泳道(TB培養基)的質粒濃度和超螺旋的比例均優於其它泳道的質粒，在質粒抽提過程中，用同樣體積的洗脫液進行洗脫，即說明了用TB培養基發酵能夠得到更高的質粒產量以及更高的超螺旋比例。因此，選擇TB作為基礎培養基，進行進一步的研究。表I菌體生物量、質粒容積產率和特異性產率
權利要求
1.用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是轉化有黑色素瘤治療性質粒DNA pSVK-CAVA (或稱PSCK_2PFcGB)的大腸桿菌XLIO-Gold，命名為E. coliXLIO-Gold/CAVA。
2.根據權利要求I所述的工程菌，其特徵在於是將黑色素瘤治療性pSVK-CAVA質粒DNA轉化大腸桿菌XLlO-Gold得到，包括但不限於使用Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和電擊轉化法得到轉化菌XLlO-Gold ;再將轉化菌XLlO-Gold塗布於LB固體平板培養基，在37°C、200rpm下培養15小時後挑取單克隆菌落；將單克隆菌落接種於5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後按照1:100進行連續傳代培養，12小時轉接傳代I次，可連續傳代30代；單克隆菌株以及傳代30代以內歷次傳代菌株均為轉化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌。
3.根據權利要求I所述的工程菌，其特徵在於為用氯化鈣法轉化大腸桿菌XLlO-Gold的工程菌，轉化方法包括將_70°C保存的100 ill感受態細胞XLlO-Gold於冰浴中解凍10分鐘，然後加入pSVK-CAVA質粒DNA25-50ng，輕柔混勻後，置冰浴中30分鐘；冰浴結束後，於42°C水浴中熱擊90秒，後迅速置於冰浴中冷卻3-5分鐘，加入800 U I無抗性的LB液體培養基，混勻後於37°C，200rpm振蕩培養I小時，得到pSVK-CAVA質粒DNA的轉化菌XLlO-Gold0
4.一種用於製備黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的發酵培養基ITB，每IL培養基含酪蛋白腖 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17mol/LKH2PO4 和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 0. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。
5.根據權利要求4所述的發酵培養基ITB，其特徵在於，每IL培養基含酪蛋白腖12g，酵母提取物 16. 61g,甘油 3. 05mL, NH4Cl Ig, 0. 17mol/L KH2PO4 和 0. 72mol/LK2HP04 混合溶液 IOOmL, MgSO4 0. 185g，微量元素 ImL0
6.根據權利要求4`或5所述發酵培養基ITB，其特徵在於，微量元素包括=FeCl3 6H2027g/L、ZnCl2 2g/L、CoCl2 6H20 2g/L、Na2MoO4 2H20 2g/L、CaCl2 2H201g/L，或無水 CaCl20. 76g/L、CuCl2 2H20 I. 27g/L、H3BO3 0. 5g/L，溶於 I. 2mol/LHCl。
7.根據權利要求4或5或6所述的發酵培養基ITB，其特徵在於=K2HPO4和KH2PO4混合溶液的配製方法為用90mL去離子水溶解2. 31g KH2PO4和12. 54g K2HPO4，完全溶解後，用去離子水定容至lOOmL。
8.—種黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產方法，是復甦一支權利要求I或2或3所述工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA工作種子，按體積比1:100比例接種於5mLLB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時，按照1:100再轉接於IOOmL的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養12小時左右，得到種子液； 將種子液按體積比1:100的量接種於含3L權利要求4或5或6或7所述發酵培養基ITB的5L發酵罐內，pH值控制在7. 0±0. I，培養溫度為37°C，溶解氧控制在30%左右，發酵培養6h ;之後按照lmL/min的流速補加發酵培養基ITB,總共補加500mL,發酵15小時後，結束髮酵，收菌，提取質粒，得到黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA。
9.工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫的構建方法，包括 I)製備原始種子庫將權利要求I或2或3所述工程菌E. coli XLIO-Gold/CAVA菌液`0.5mL擴大至IOOmL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時，加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到原始種子庫； 2)製備主種子庫:復甦一支原始種子接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，並分裝50管得到主種子庫，凍存於-70°C冰箱，得到主種子庫； 3)製備工作種子庫:從主種子庫中取I管菌種，接種於12管LB液體培養基中，2次傳代後小提質粒，選取質粒含量最高的菌液擴大至IOOmL LB培養基中，在37°C、200rpm下培養12小時後加入30%甘油，分裝50管並凍存於-70°C冰箱，得到工作種子庫；每支工作種子庫中的菌種限傳5代用於權利要求9黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生產。
10.權利要求9所述方法構建得到的工程菌E.coli XLIO-Gold/CAVA種子庫，包括原始種子、主種子及工作種子。·
全文摘要
本發明公開了一種黑色素瘤治療性質粒DNA疫苗pSVK-CAVA的製備方法及其專用工程菌及高產發酵培養基。所述工程菌是轉化有黑色素瘤治療性質粒DNA pSVK-CAVA的大腸桿菌XL10-Gold，命名為E.coli XL10-Gold/CAVA。每1L高產發酵培養基含酪蛋白腖12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH4Cl 1g，0.17mol/L KH2PO4和0.72mol/L K2HPO4混合溶液100mL，MgSO4 0.185g，微量元素1mL。本發明的工程菌穩定性高、能連續傳代30次以上，能滿足質粒DNA疫苗pSVK-CAVA中試工藝的需要，利用高產培養基發酵後獲得的質粒容積產率高，可用在黑色素瘤治療性DNA疫苗pSVK-CAVA的發酵生產中。
文檔編號C12N15/63GK103215216SQ20131013156
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者於繼雲, 閻瑾琦, 王宇, 徐元基, 張巍, 吳昊, 張亮, 朱曉明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所