具有r－異構體立體選擇性的酯水解酶及其基因和重組酶的製作方法
2023-04-26 04:47:06 2
專利名稱：具有r－異構體立體選擇性的酯水解酶及其基因和重組酶的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，涉及一種具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶及其基因和重組酶，包括該酯水解酶基因的表達載體及製備其重組酶的方法及其基因工程菌株，以及該酯水解酶在立體選擇性催化手性化合物(R型)合成中的應用。
背景技術：
酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一類在手性合成中有著重要用途的生物催化劑。這些酶能識別很寬的底物，目前＞40％的生物不對物合成反應可由酯水解酶催化完成，這些反應具有條件溫和、反應的區域選擇性和立體選擇高等特點。在酶動力學拆分外消旋酯、胺和轉化前手性醇等方面得到廣泛的應用。另外，它們還可用於選擇性酯化、轉酯化和聚合反應中。
由於對手性藥物和中間體需求的增長，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人們的重視和工業化應用。生物法合成手性化合物的關鍵問題在於尋找具有高度立體選擇性催化功能的生物催化劑。由於酯水解酶具有廣泛的用途，篩選新的酯水解酶正成為酶工程的研究熱點。雖然酯水酶在微生物界分布很廣，但它們的立體選擇性催化能力不一樣。在同一生物體內往往存在多種酯水解酶，由於它們之間立體選擇性存在差異性，利用微生物細胞或它們的粗酶製品進行酶法合成手性化合物時往往會降低產物的光學純度(Geun-Joong Kim，Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic 17，200229-38)。解決這一問題可以通過工程的調控手段來減少副反應的發生(PerBerglund，Biomolecular Engineering，18，200113-22)，也可以通過分離純化得到單一的酶製劑來進行催化反應，但這些過程往往較複雜並具有高的成本，在生產中不易被採用。如果通過基因工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，就能夠很方便達到以上的目的。
發明內容
本發明人即為了解決上述課題，通過篩選大量的微生物，發現芽孢桿菌屬微生物能產生一種有高度R-異構體立體選擇性的酯水解酶，可用於催化手性化合物的合成；為了提高這種酯水解酶的產量和消除野生型菌株中同工酶對酶催化反應的負面影響，本發明克隆了該基因並對此基因在大腸桿菌內進行表達。因此，本發明的目的之一是提供一種具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶及其基因和由此推斷的胺基酸序列；目的之二是提供包括該酯水解酶基因的表達載體和利用該載體轉化的重組微生物，如基因工程菌株；目的之三是提供從所述微生物製備重組酶的方法及由此製得的重組酶；目的之四是提供該重組酯水解酶在立體選擇性催化手性化合物(R型)合成中的應用。
本發明具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶基因可得自芽孢桿菌屬微生物，如Bacillus sp.ATCC 31195。本發明採用的技術方案是通過PCR擴增得到芽孢桿菌的一種具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶基因BSEST，測定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示，其中，其編碼序列(CDS)從DNA第1個鹼基起至第753終止，ATG為轉錄起始密碼子，TAA為轉錄終止密碼；並得到相應的胺基酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所示。當然，如本領域技術人員所知，本發明酯水解酶基因還可以是編碼由序列表中SEQID No.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的其它核苷酸序列；而本發明的酯水解酶不僅限是具有序列表中SEQ ID No.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質，還可以是將序列2中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白質，比如在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸，如與載體編碼的胺基酸融合、不影響序列的修飾形式上的差異等情況。
本發明的另一目的是提供包括上述酯水解酶基因核苷酸序列的表達載體。其是用常規方法將本發明的酯水解酶基因的核苷酸序列連接於各種載體上構建而成，該載體可以是市售的質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是僅限於這些載體。
較佳的是將用PCR擴增到的BSEST基因產物和克隆載體pMD18-T連接，形成克隆載體pBSEST-T。pBSEST-T和表達載體pET22b(+)分別用限制性內切酶消化，形成互補的粘性末端，經T4DNA連接酶連接，形成BSEST基因的表達載體(質粒)pBSEST-PET。
本發明的再一目的是提供一種轉化體，其是將包含本發明酯水解酶基因核苷酸序列的表達載體轉化到宿主微生物，例如感受態大腸桿菌——大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到的基因工程菌株，如將上述質粒pBSEST-PET轉化其中得到含有pBSEST-PET的大腸埃希氏菌E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET，該菌株已於2006年3月10日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.1648。
本發明的又一目的是提供一種製備重組酯水解酶的方法，其包括用上述本發明表達載體轉化宿主細胞，培養轉化體，獲得重組的酯水解酶。
其中，該宿主細胞可以為原核、真核微生物或昆蟲等。較佳的是大腸桿菌，得到相應的轉化體為上述的基因工程菌株大腸埃希氏菌E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648。
此菌株可在常規的IPTG誘導下(在OD600＝0.5-0.6左右時加入，至其濃度為0.1-1mmol/L均可)高效表達酯水解酶蛋白，即為本發明的重組酯水解酶。
本發明的重組酯水解酶可以包含SEQ ID No.2所述的胺基酸序列；或具有與SEQ ID No.2所述的胺基酸序列至少有80％同源性的胺基酸序列。本發明的重組酯水解酶可以用於製備光學純的手性化合物(R型)，特別是R-氟比洛芬和R-酮基布洛芬等R型2-芳基丙酸類藥物的合成。
本發明的基因工程菌株大腸埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pBSEST-PET已於2006年3月10日在地址為中國北京市海澱區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No.1648。
圖1為本發明BSEST的PCR擴增電泳圖譜，其中，1、DNA Marker(λ-HindIII digest，TakaRa公司)；2、BSEST的PCR擴增產物。
圖2為本發明質粒pBSEST-T的HindIII和NdeI雙酶切分析圖譜，其中，1、DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；2、pBSEST-T/HindIII+NdeI。
圖3為本發明表達質粒pBSEST-PET的HindIII和NdeI雙酶切分析圖譜，其中，1、pBSEST-PET/HindIII+NdeI；2、DNA Marker(λ-HindIII digest，Takala公司)；圖4為本發明重組酯水解酶水解氟比洛芬酯的反應產物的C18HPLC分析圖譜，其中，1、氟比洛芬；2、氟比洛芬酯。
圖5為本發明重組酯水解酶水解氟比洛芬酯的反應產物的手性HPLC分析圖譜，其中，1、(R)-氟比洛芬。
圖6為表達質粒pBSEST-PET的構建示意圖。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明。
下列實施例中的材料與方法為
所採用的分子克隆技術參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。
所使用的工具酶均購自Takala公司，具體的反應條件和使用的方法均參考商品說明書。
所使用的膠回收試劑盒購自上海生工公司，使用方法參考商品說明書。
下面的商品化質粒和大腸桿菌株用於DNA文庫構建和基因克隆。
pMD18-T(Takala，大連寶生物公司)pET22b(+)(Novagen，美國)大腸桿菌DH5a(Takala，大連寶生物公司)大腸埃希氏菌BL21(DE3)(Takala，大連寶生物公司)λ-DNA HindIII Marker(Takala，大連寶生物公司)HisTrapTMFF親和層柱(Amersham Biosciences)實施例1從芽孢桿菌克隆BSEST基因根據Bacillus sp H-257脂肪酶的DNA序列(J Biochem，2001，129397)和Bacillus cereus C71脂肪酶的DNA序列(GenbankAY896293)，設計簡併引物1和引物2。在引物1加上NdeI位點，引物2加上HindIII位點。
引物1序列GGAATTCCATATGAGCGAMCABTACHGGTGCTCGKGCNdeI引物2序列CCCAAGCTTTCCNGCNTGCTTBKCGNAAAATKCGAGAHindIII以芽孢桿菌(Bacillus sp.)ATCC 31195基因組DNA為模板進行PCR擴增(利用Takara試劑盒)，PCR反應混合物由2.5mmol/L dNTP，20pmol引物1和引物2，5單位Taq聚合酶(Takara)和提供的緩衝液組成。反應條件如下所示。步驟1之後向反應混合物加入Taq聚合酶。步驟2到4重複29次。
用0.7％瓊脂糖凝膠分離PCR產物，從凝膠中回收750bp的DNA片段(如圖1所示)，簡稱為BSEST基因，與pMD18-T載體連接，所得質粒稱pBSEST-T，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5a。質粒pBSEST-T經過HindIII和NdeI雙酶切分析，證明含有正確的插入片段(如圖2所示)。對BSESTDNA進行DNA測序，序列如SEQ ID No.1所示，編碼成熟肽的DNA的大小為753bp，其對應的胺基酸序列如SEQ ID No.2所示。
實施例2表達載體和轉化體的構建pBSEST-T質粒和pET22b(+)分別經NdeI和HindIII雙酶切後，用0.7％瓊脂糖凝膠分離酶切產物，從凝膠中分別回收750kbp和4.8kbp的DNA片段，用T4DNA連接酶連接，所得質粒稱pBSEST-PET質粒，連接產物轉化感受態大腸埃希氏菌E.coli BL21(DE3)，經抗性培養基篩選得陽性克隆並進行HindIII和NdeI雙酶切分析鑑定，證明含有正確的插入片段(如圖3所示)，從而得到轉化體-表達本發明酯水解酶的基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648。
實施例1～2過程如圖6所示。
實施例3酯水解酶的表達將基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648，接於5ml、含50ug/ml氨苄青黴素的LB培養基中，37℃震蕩培養過夜。取50ul培養液接至5ml、含50ug/ml氨苄青黴素的新鮮LB培養基，培養至OD600＝0.6左右，加入IPTG至其濃度為1mmol/L誘導，繼續培養4h。離心收集菌體，以1mmol/L氟比洛芬乙酯為底物檢測酶活力，酶活力為20U/g幹菌體。
實施例4重組酯水解酶的應用取實施例3中的重組大腸桿菌，經超聲破壁，離心去除菌體，上清液經HisTrapTMFF親和層柱後得到部分純化的重組酯水解酶。取得到的該重組酯水解酶，水解10-500mmol/L(pH5-12.0，5-500mmol/L磷酸鉀緩衝液)的外消旋氟比洛芬酯和酮基布洛芬酯，反應溫度10-60℃。反應產物經C18HPLC(流動相為甲醇∶水＝85∶15(V/V)，檢測波長254nm，流速0.8ml/min，檢測溫度30℃)和手性CHI-TBB HPLC柱(流動相為正己烷∶叔丁基甲醚∶冰醋酸＝70∶30∶0.1(V/V)，檢測波長254nm，流速1.0ml/min，檢測溫度30℃)分析轉化率(圖4)和產物的光學純度(圖5，其中(R)-氟比洛芬的保留時間應為11.357min)，結果如下表所示。從結果可知，不同的底物經過重組酯水解酶催化水解後，分別得到光學純度＞99％的氟比洛芬和酮基布洛芬。以野生型的Bacillus sp ATCC 31195分離到的粗酯水解酶催化同樣的反應，得到光學純89％的氟比洛芬和酮基布洛芬。說明利用重組酯水解酶進行反應可以消除野生菌產生的其它同工酶的副反應，提高手性化合物的光學純度。
序列表110上海醫藥工業研究院；浙江海正藥業股份有限公司120具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶及其基因和重組酶130061267C1602170PatentIn version 3.12101211753212DNA213芽孢桿菌(Bacillus sp.)220
221CDS222(1)..(753)223
4001atg agc gaa caa tat ccg gtg ctc tcg ggc gcc gag ccg ttt tac gcc48Met Ser Glu Gln Tyr Pro Val Leu Ser Gly Ala Glu Pro Phe Tyr Ala1 5 10 15gaa aac ggg ccg gtc ggg gtg ctg ctc gtg cac gga ttc acc ggc acg 96Glu Asn Gly Pro Val Gly Val Leu Leu Val His Gly Phe Thr Gly Thr
20 25 30ccc cac agc atg cgc ccg ctc gct gaa gcg tat gcg aaa gcc ggc tat144Pro His Ser Met Arg Pro Leu Ala Glu Ala Tyr Ala Lys Ala Gly Tyr35 40 45acc gtt tgc ctg ccg cgc tta aaa ggg cac gga acg cat tac gaa gac192Thr Val Cys Leu Pro Arg Leu Lys Gly His Gly Thr His Tyr Glu Asp50 55 60atg gaa cgg acg acg ttc cac gat tgg gtc gcc tcg gtc gaa gaa gga240Met Glu Arg Thr Thr Phe His Asp Trp Val Ala Ser Val Glu Glu Gly65 70 75 80tat gga tgg ctg aaa caa cga tgc caa acc att ttt gtc acc ggg ctg288Tyr Gly Trp Leu Lys Gln Arg Cys Gln Thr Ile Phe Val Thr Gly Leu85 90 95tcg atg ggc ggg acg ctc acg ctt tat ttg gcg gaa cat cac cca gac336Ser Met Gly Gly Thr Leu Thr Leu Tyr Leu Ala Glu His His Pro Asp100 105 110atc tgc ggc atc gtg ccg att aac gcc gct gtc gac atc ccg gcc atc384Ile Cys Gly Ile Val Pro Ile Asn Ala Ala Val Asp Ile Pro Ala Ile115 120 125gcc gcc ggg atg acg ggc ggg ggc gag ctg ccg agg tat ctg gat tcg432Ala Ala Gly Met Thr Gly Gly Gly Glu Leu Pro Arg Tyr Leu Asp Ser130 135 140atc ggt tcg gac ttg aaa aat ccg gat gtg aaa gag ctg gca tac gag480Ile Gly Ser Asp Leu Lys Asn Pro Asp Val Lys Glu Leu Ala Tyr Glu145 150 155 160aaa acg ccg acc gct tcg ctt ctt cag ctg gct agg ctg atg gca cag528Lys Thr Pro Thr Ala Ser Leu Leu Gln Leu Ala Arg Leu Met Ala Gln165 170 175aca aaa gcg aaa ctc gat cgc atc gtc tgt ccg gcg ttg att ttt gtc576
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權利要求
1.一種具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的鹼基序列；2)編碼由序列表中SEQ ID No.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質。
2.一種具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶，是a)具有序列表中SEQID No.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質，或b)將a)中的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與a)蛋白質相同酶活性的由a)衍生的蛋白質。
3.包括權利要求1所述的酯水解酶基因的核苷酸序列的表達載體。
4.一種用於表達具有R-異構體立體選擇性的酯水解酶的基因工程菌株，其是將權利要求3所述的表達載體轉化到宿主微生物中得到的基因工程菌株。
5.如權利要求4所述的基因工程菌株，其特徵在於該宿主微生物為大腸桿菌，得到的基因工程菌株為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pBSEST-PET CGMCC No.1648或其突變體或變異體。
6.一種製備具有R-異構體立體選擇性的重組酯水解酶的方法，其包括用權利要求3所述的表達載體轉化宿主細胞，培養轉化體，獲得重組的酯水解酶。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於該轉化體為如權利要求5所述的基因工程菌株。
8.一種具有R-異構體立體選擇性的重組酯水解酶，其是a)根據權利要求6或7所述的方法製得的重組酯水解酶；或b)包含SEQ ID No.2所述的胺基酸序列；或c)具有與SEQ ID No.2所述的胺基酸序列至少有80％同源性的胺基酸序列。
9.如權利要求8所述的重組酯水解酶在立體選擇性催化手性化合物R型藥物合成中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於該手性化合物R型藥物為2-芳基丙酸類R-氟比洛芬或R-酮基布洛芬。
全文摘要
本發明公開了一種來自於芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的編碼具有R－異構體立體選擇性的酯水解酶的基因BSEST，提供了含有BSEST序列及其相應的胺基酸序列；提供了含有BSEST的表達載體pBSEST－PET和含有這種載體的基因工程菌株大腸埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pBSEST－PET CGMCCNo.1648；本發明還提供了重組該酯水解酶的方法。本發明重組的酯水解酶是可用於立體選擇性催化手性化合物(R型)的合成。
文檔編號C12N9/16GK101058817SQ20061002582
公開日2007年10月24日 申請日期2006年4月19日 優先權日2006年4月19日
發明者陳少欣, 白驊, 史炳照, 林劍秋, 錢莉莉 申請人:上海醫藥工業研究院, 浙江海正藥業股份有限公司