鹽芥花時相關基因、編碼蛋白及其克隆方法和應用的製作方法
2023-04-26 04:52:41 2
專利名稱：鹽芥花時相關基因、編碼蛋白及其克隆方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鹽芥的花時相關基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應用。
背景技術：
生長在華東地區海灘鹽土上的本土植物鹽芥，可以在超過500mM NaCl的土壤中完成生活史，還能忍受-15℃的低溫，是科學家們研究植物抗逆性的寶貴資源。鹽芥屬十字花科，Thellungiella屬，具有作為模式材料的優良特徵1.個體小，與模式植物擬南芥相當；2.自花傳粉，需要時亦可方便地進行雜交；3.基因組簡單(基因組大小約為擬南芥的兩倍)；其基因序列與擬南芥基因序列具有很高的同源性。但美中不足的是，鹽芥的生命周期太長，實驗室培養條件下，從播種到開花需要10-12個月左右，經過1個月左右的4℃低溫處理，即春化處理後，其生活史才能縮短到3-4個月。鹽芥過長的生命周期以及對春化作用的強烈依賴，不僅帶來操作上的不便，而且大大減慢了遺傳分析的進程。這是鹽芥作為模式研究材料的一大缺陷。
發明內容
本發明的目的之一在於提供鹽芥的花時相關基因ThFLC。
本發明的目的之二在於提供鹽芥的花時相關基因ThFLC的編碼蛋白。
本發明的目的之三在於提供鹽芥的花時相關基因ThFLC的克隆方法。
本發明的目的之四在於提供一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法。
本發明的目的之五在於提供一種抑止鹽芥中花時相關基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法。
一定時期的低溫處理促進植物開花的現象稱為春化作用。自然界中存在一類植物，只有在營養生長階段經歷一段時間低溫，才能夠在適宜的條件來臨時轉入生殖發育，啟動開花。如果沒有經歷低溫，植物開花時間將大為推遲。春化處理的生理學研究表明植物感受低溫春化信號的部位是莖尖。春化處理與植物最終開花之間有一段時間間隔，表明春化作用實際上是使植物處於待命開花的狀態而非迅速誘導開花。春化處理後的植物能夠「記憶」此前的春化經歷；換句話說，春化處理給予了植株開花的指令但植株只有在適宜的條件下才執行指令。一旦低溫春化完成，轉至適宜的溫度條件下(沒有誘導信號)，細胞仍可以通過有絲分裂在當代忠實地保持和傳遞這種「記憶」，但春化效應不能經過減數分裂傳遞「遺傳」到下一代，子代的植物又恢復了對春化作用的要求。從這一層面上，春化作用具有表觀遺傳的特點(Michaels et al.，2000)。
模式植物擬南芥的FLOWERING LOCUS C(FLC)基因編碼一個含MADS域的轉錄因子，是主要的開花抑制因子，其表達量高低與擬南芥開花早晚呈負相關。春化作用主要通過降低FLCmRNA的水平而提前開花。作為主要的開花抑制基因，FLC的表達還受到多個其它基因的調控。FLC受到自主開花途經的負調控，自主開花途經基因突變體中FLC的表達量升高，突變體表現花期延遲(Michales and Amasino，2001)。春化作用對FLC mRNA表達水平的抑制具有表觀遺傳的特點低溫處理一定時期後，FLC mRNA表達量隨處理時間延長逐漸降低，春化處理完成後在溫暖的生長條件下，植株內FLC的表達仍保持受抑制狀態。對擬南芥而言，春化處理實質上是通過抑制FLC的表達而促進植物花芽分化，到子代，FLC重新恢復高水平的表達。
自然界中的擬南芥大部分為晚花生態型[late-flowering accession；又稱冬季型(winter annual)]，少數為早花生態型[early-flowering accession；或稱夏季型(summerannual)]。晚花生態型具有長的生命周期，春化處理促進開花。早花生態型無需春化處理即能抽穗開花。晚花表型主要由兩個顯性位點FRI和FLC協同控制(Lee etal，1994)。FRI和FLC對花時的調控，是協同增效作用，兩者缺一不可。FRI通過促進FLC mRNA的高水平表達抑制開花，另一方面，FLC的表達也只有在FRI存在的條件下才能積累到較高水平。春化作用可以解除晚花生態型的晚花表型春化作用對FLC負調控效果強於FRI對FLC的正調控效果，最終降低FLC的表達水平，從而促進冬季生態型開花。FRI或FLC任一位點發生突變都能削弱或克服晚花表型，表現提早開花。自然界中擬南芥的早花生態型即是由於FRI或FLC基因之一(或二者)發生突變(無效等位基因)進化而來。實驗室常用的擬南芥生態型，Landsberg erecta(Ler)、Wassilewskija(Ws)和Columnbia(Col)，均屬於早花生態型，其fri或flc基因功能缺失或被削弱。生命周期短是研究者們選擇這幾類生態型開展研究工作的重要原因。
鹽芥與擬南芥同屬十字花科，對鹽芥cDNA文庫克隆隨機測序結果顯示，鹽芥中參與光合作用等基礎新程代謝的基因與擬南芥對應基因cDNA序列間的同源性達90％以上(Inan et al，2004)。表明鹽芥與擬南芥有很近的親緣關係，推測鹽芥存在與擬南芥相似的春化機制。
根據上述機理，本發明採用如下技術方案一種鹽芥的花時相關基因ThFLC，其特徵在於該基因具有SEQ NO 4所示的鹼基序列。
一種根據權利要求1所述的鹽芥的花時相關基因ThFLC編碼蛋白，其特徵在於具有SEQ NO 5所示的胺基酸序列。
一種根據權利要求1所述的鹽芥的花時相關基因ThFLC的克隆方法，其特徵在於該方法具有如下步驟a.以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設計引物LP15』-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3』，LP25』-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3』；b.以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段；c.設計3』-接頭引物，即5』-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3』，藉助3』-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物LP3，即5』-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3』獲得3』末端序列，藉助限制性內切酶StuI拼接得到鹽芥的花時相關基因ThFLC。
一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法，其特徵在於該方法是首先構建基因表達載體ThFLC-pPZP211質粒，再以傳統的Floral dip法轉化擬南芥，最後進行轉基因植株的篩選，即得到晚花型擬南芥。
一種抑制鹽芥中花時相關基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法，其特徵在於該方法具體為首先構建基因沉默載體ThFLC-pART27質粒，通過農桿菌介導法，用卡那黴素作為篩選標記篩選轉基因植株，即得到早花型鹽芥。
綜上所述，鹽芥有很多符合作為遺傳研究模式系統的標準，是一種很好的耐鹽模式植物，但是它最大的弱點是生命周期長，自然界中沒有天然的早花鹽芥，這嚴重阻礙了科學家耐鹽機制的科研進程。擬南芥有早花和晚花兩種生態型，這兩個生態型的差別在於FLC和FRI這兩個關鍵基因。由於鹽芥和擬南芥具有很近的親緣關係，本發明借鑑擬南芥春化作用途徑花時調控分子機制，克隆鹽芥中與擬南芥FLC同源基因ThFLC全長cDNA序列；分析春化處理促進鹽芥開花與ThFLC表達量的關係；同時用功能補償方法在模式植物擬南芥中驗證了ThFLC功能(抑制開花)；豐富了我們對植物春化作用的認識；更進一步地，通過轉錄後基因沉默的方法，培育出不依賴於春化處理即能啟動生殖發育程序的早花鹽芥，加速以鹽芥為耐鹽模式材料的科研進程。
對ThFLC的基因工程應用可以培育出改變開花時間的其它植物，包括重要的農作物和花卉等。本發明的方法對於培育新型耐鹽快速生長的鹽芥和農作物具有重要的實用價值和經濟效益。另外本發明首次摸索農桿菌floral dip法轉化鹽芥，並用卡那黴素篩選轉基因植株，為鹽芥成為植物分子生物學研究新的模式植物奠定了基礎。
圖1為鹽芥經過春化處理前後開花時的蓮座葉數目。
圖2為鹽芥的花時相關基因ThFLC在春化處理前後Northern表達分析。
圖3為將鹽芥的花時相關基因ThFLC導入擬南芥，轉基因株的晚花表型。
圖4為擬南芥的早花表型。
圖5為鹽芥的花時相關基因ThFLC基因沉默載體結構示意6為鹽芥的轉基因株的早花表型。
圖7為鹽芥的晚花表型。
具體實施例方式實施例一ThFLC全長編碼區的克隆與分析從genbank中調出不同物種中與開花有關的FLC基因組序列，cDNA序列，promoter序列，UTR序列，比較發現，它們在不同物種中有很高的同源性，以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設計引物LP1(5』-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3』)LP2(5』-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3』)以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段，測序結果表明該片段與AtFLC相應序列有90％的同源性，說明該cDNA片段是鹽芥中FLC同源基因片段；由於該片段中已經包含了啟始子ATG和部分5』-UTR序列，所以設計3』-接頭引物(5』-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3』)，藉助3』-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物LP3(5』-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3』)獲得3』末端序列。藉助限制性內切酶StuI拼接得到ThFLC全長編碼區，測序鑑定結果表明，cDNA全長是724bp，其中ORF是594bp，在71nt處有ATG，662nt是終止子TAG，Vector NTI8.0軟體的分析結果顯示，最長讀碼框編碼了一個含197個胺基酸的蛋白，蛋白分子量大小為21.98kDa，等電點為7.15的鹼性蛋白，命名為ThFLC。
利用BLAST程序對ThFLC預測得到的胺基酸序列分析發現，它與擬南芥FLC有高度同源性，其中核苷酸序列的同源性達到90.6％，胺基酸序列的同源性達到89.4％，並且與藍型油菜FLC序列也有很高的同源性，並且都有高度保守的MADS盒，這些說明花時基因FLC在春化依賴型的植物中是高度保守的，它在這些物種中可能有著相似的功能。
實施例二春化處理抑制ThFLC的表達為了研究春化處理與鹽芥開花時間及ThFLC表達量的關係，本發明做了以下驗證。
在長日照條件下，未經春化處理的鹽芥等到長出大約400片蓮座葉才抽苔啟動開花，整個生命周期大約需要10個月時間，而經過6周(5℃±1℃)的春化處理，大大地縮短了開花時間，蓮座葉大大減少(圖1)，只需要大約3個月時間就可以完成整個生活史，說明春化處理大大促進了鹽芥開花。
為了進一步說明春化促進鹽芥開花與ThFLC表達水平的關係，把7周鹽芥幼苗放到4℃冷庫冷處理6周，然後收集材料提取RNA(同時提取對照組RNA)，用1.2％含甲醛的變性瓊脂糖凝膠電泳分離40μg總RNA，在鹼性條件下轉移到帶正電荷的尼龍膜上，實驗以ThFLC基因片段為探針，做Northern雜交發現，與野生型相比，春化處理後ThFLC表達量明顯下降(圖2)。這些結果表明，春化抑制鹽芥晚花表型與ThFLC表達下降是一致的，說明鹽芥中存在著與春化處理促進擬南芥開花相似的分子機制。
實施例三ThFLC在模式植物擬南芥中的功能補償(一)用於擬南芥功能補償的表達載體的構建藉助引物引入法，在靶基因ThFLC的5』及3』端加上限制性內切酶NcoI和XbaI酶切位點，引物如下(1)ThFLC(+)(加入NcoI酶切位點)5』-CATG GAAGGAAAAAACTAGAAATC-3』邊框內為NcoI識別位點；
(2)ThFLC(-)(加入XbaI酶切位點)5』-CTAG CTAATTAAGCAGTGGGAGA-3』邊框內為XbaI識別位點；用構建好的TA克隆作為模板，以ThFLC(+)/(-)為引物進行PCR擴增得到全長ThFLC，用NcoI/XbaI分別雙酶切PCR產物和克隆載體pAVA321，回收目的片段，用T4連接酶連接，對陽性克隆進行酶切和測序鑑定。
然後用BamHI/KpnI分別雙酶切上步構建的重組載體和雙元穿梭載體pPZP211，將含靶基因的片段插入到雙元載體的BamHI/KpnI兩個酶點之間，並進行PCR和酶切鑑定。檢測後-80℃保存質粒及菌種；(二)傳統的Floral dip法轉化擬南芥(1)將已經構建好的重組質粒電擊轉化入農桿菌(GV3101菌株)(2)在準備轉化前兩天，用牙籤挑取單克隆於3ml LB(含相應抗性)培養液中，250rpm，28℃過夜培養(3)將3ml菌液轉入50ml含相應抗性的LB培養液中，250rpm，28℃培養至OD值至少為1.0(4)6000rpm，離心10分鐘收集細胞，用適量infiltration media重懸沉澱，使轉化液終濃度的OD值為0.8(5)用槍頭將轉化液輕輕滴在植物剛開的花上，10分鐘後用清水衝洗(6)將轉化的材料放在避光處16小時以保持其溼度(7)隔天再加強轉化一次(8)收集幹種子，在選擇培養基上篩選轉化體。
(三)轉基因植株的篩選和表型觀察種子放於1.5ml EP管中，開口晾乾，除去果莢皮等雜質，只留種子。轉入目的基因和空載體的擬南芥種子滅菌後種於含50mg/L Kana的1/2MS培養基上，篩選抗性苗。轉基因植株長大後觀察其表型，與野生型相比，轉目的基因的植株出現明顯的晚花表型(圖3)，而轉空載體的抗性苗與野生型一樣，屬於典型的早花擬南芥(圖4)。這些說明ThFLC基因在進化過程中是非常保守的，它能夠補償近親模式植物擬南芥的早花表型，進一步證明了ThFLC抑制花時的功能。本發明推而廣之，ThFLC可以應用於其它十字花科如油菜等其他植物開花機制的探索和作物改良的研究。
實施例四通過基因工程改造，培育早花(短生命周期)鹽芥(一)基因沉默載體的構建應用NTI VECTOR軟體分析鹽芥ThFLC與擬南芥AtFLC的編碼區核苷酸序列，選擇不含保守區段、長度合適的一段(位於ThFLC全長cDNA的271bp-579bp之間序列，用Primer Premier軟體設計兩對引物。
(1)ThFLC-KpnI引物(加入KpnI多克隆位點)5′端5』-GG GGTTCACACCATGAGCTA-3』邊框內為KpnI識別位點；3′端5』-GG GAGAGTTACCGGAAGATT-3』邊框內為KpnI識別位點。
(2)ThFLC-BamHI引物(加入BamHI多克隆位點)5′端5』-CG GGTTCACACCATGAGCTA-3』邊框內為BamHI識別位點；3′端5』-CG GAGAGTTACCGGAAGATT-3』邊框內為BamHI識別位點。
載體構建具體步驟如下(結構示意圖見圖5)A、PCR反應以第一對引物進行高保真PCR反應，用PCR產物快速膠回收試劑盒回收PCR產物；B、酶切反應KpnI酶切PCR回收產物，酶切完全後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物(K片斷)，同時用KpnI酶切pHANNIBAL載體，酶切完全後用SAP去磷酸反應，然後用快速膠回收試劑盒回收酶切產物；C、連接反應取適量的酶切產物，用T4DNA連接酶16℃連接過夜；D、檢測連接產物轉化大腸桿菌DH5α，塗LB固體培養基平板(含50mg/L Kan)，37℃培養約16小時，挑單克隆，擴大培養後提質粒，用鑑定引物進行PCR檢測，分別用限制性內切酶AlwNI、StyI酶切檢測ThFLC插入片段，驗證K片斷是否正確插入到pHANNIBAL載體上，選取陽性克隆測序；E、第二片斷(B片斷)的插入以第二對引物、限制性內切酶BamHI重複上述反應；F、將經檢測證明該基因的K片斷和B片斷以正確方向插入到pHANNIBAL載體上的重組子(ThFLC-pHANNIBAL)轉化大腸桿菌DH5α，提質粒檢測後-80℃保存質粒及菌種；G、基因沉默載體的構建NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL和pART27載體，回收酶切產物，進行連接反應。NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL產生兩個片斷，如果K和B片斷都已正確插入，大片斷長度分別為3579bp，回收該大片斷進行連接反應；H、連接產物轉化大腸桿菌DH5α，擴大培養(Kana、Spec抗性)，提質粒，進行PCR、酶切檢測，回收PCR及酶切產物，測序驗證K、B片斷是否已正確插入pART27載體中，檢測外源片斷插入正確無誤的質粒分別稱為ThFLC-pART27質粒，保存菌種。
(二)轉化用農桿菌的準備(1)農桿菌的轉化將構建好的ThFLC-pART27質粒導入農桿菌GV3101；(2)檢測從轉化後的農桿菌GV3101中提取質粒，PCR及酶切檢測，驗證ThFLC-pART27質粒是否已正確導入農桿菌GV3101，保存檢測效果好的菌種，並劃板備用；(3)轉化用濃桿菌菌液的製備挑取農桿菌GV3101單克隆，50ml液體LB培養基中擴大培養(加相應的抗生素)，28℃，250rpm震蕩培養至菌液OD600為0.8左右，倒入大離心管中，3,000rpm離心10分鐘，棄上清，沉澱用滲透培養基重懸，最終菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用於轉化。
(三)Floral dip法轉化鹽芥臨轉化前在農桿菌菌液中加入Silwet L-77(300μl/L)。用槍頭將菌液滴在鹽芥花序上，用保鮮膜封好保持溼度，25℃暗培養過夜後，再移至溫室正常培養，視情況可再浸染一次，鹽芥轉化效率相對較低、耐逆能力較強，可以多浸染一次。每周浸染一次，其間要注意農桿菌對植株的影響(是否引起大量的花敗育)，來調整菌液濃度及浸染次數。
(四)卡那黴素篩選轉基因植株種子放於1.5ml EP管中，開口晾乾，除去果莢、皮等雜質，只留種子。轉基因鹽芥種子滅菌後種於含50mg/L Kana的1/2MS培養基上，篩選抗性苗。鹽芥要放在23℃光照培養箱中，兩周發芽，一個月後移到23℃培養室。鹽芥對卡那黴素的抗性較大，需要在一個月後轉一次培養基，以保證營養的供應，再一個月後就可以得到抗性苗。
(五)轉基因植株的表型轉基因植株長大後觀察其表型，與野生型相比，轉目的基因轉基因鹽芥出現明顯的早花表型(圖6)，而轉空載體抗性轉基因鹽芥與野生型一樣，仍然屬於典型的晚花鹽芥(圖7)。野生型和對照組鹽芥均需要大約10個月左右才能完成整個生命周期，而轉靶基因鹽芥大大縮短了從營養生長到生殖生長的轉換，完成整個生活使只需要大約2-3個月時間，這樣便利了鹽芥遺傳學等其他生物學的研究。
序列表110上海大學
120鹽芥花時相關基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應用16011210121126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4001cgcttagtat ctccggcgac ttgaac26210221125212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4002gtagtgggag agtcaccgga agatt 25210321126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4003atgggaagga aaaaactaga aatcaa26
2104211724212DNA213鹽芥(Thellungiella halophila)220
221CDS222(71)...(664)4004gtatctccgg cgacttgaac cgtacctgag gatcaaatta gggcacggag gcctctcgga60gacagaagcc atg gga agg aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac 109Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn1 5 10aaa agt agc cga caa gtc acc ttc tcc aaa cga cgc aac ggt ctc atc 157Lys Ser Ser Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile15 20 25gag aaa gca cgt cag ctt tct gtt ctc tgc gat gca tcc gtc gct ctt 205Glu Lys Ala Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu30 35 40 45ctc gtt gtc tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat 253Leu Val Val Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp50 55 60aac ctg gtc aag atc ctt gat cga tat gga aaa caa cat gct gat gat 301Apn Leu Val Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp65 70 75ctt aag gcc ttg gat ctt cag tca aaa gct ctg agc tat ggt tca cac 349Leu Lys Ala Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His80 85 90cat gag cta cta gaa ctt gtg gaa agc cag ctt gtg gac tca agt gtc 397His Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val95 100 105gat aat gcc agt gtc gat tcc ctc gct cag ctg gag gat cac ctt gag 445Asp Apn Ala Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu110 115 120 125act gcc ctc tcc gta act aga gct agg aag aca gaa cta atg ttg aag 493
Thr Ala Leu Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys130 135 140ctt gtt gat agc ctc aaa gaa aag gag aaa ttg ctg aaa aga gag aac 541Leu Val Asp Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn145 150 155cag gtt ttg gct agc cag atg gag aag aat caa cat gtg gga gca gaa 589Gln Val Leu Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu160 165 170gct gat aat atg gag atg tcg cct gga caa atc tcc gac agc aat ctt 637Ala Asp Apn Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu175 180 185ccg gta act ctc cca ctg ctt aat tag ccacctttaa ccggcggtta684Pro Val Thr Leu Pro Leu Leu Apn190 195aaccatcgta aacatgtatt tcaaaaaaat gaaaaaaaaa 7242105211197212PRT213鹽芥(Thellungiella halophila)4005Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn Lys Ser Ser1 5 10 15Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35 40 45Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Apn Leu Val50 55 60Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65 70 75 80Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His His Glu Leu
85 90 95Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val Asp Apn Ala100 105 110Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu Thr Ala Leu115 120 125Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Asp130 135 140Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn Gln Val Leu145 150 155 160Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu Ala Asp Apn165 170 175Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu Pro Val Thr180 185 190Leu Pro Leu Leu Apn195210621130212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4006catgccatgg gaaggaaaaa actagaaatc 30210721129212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物
4007ctagtctaga ctaattaagc agtgggaga 29210821126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4008ggggtaccgg ttcacaccat gagcta 26210921126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物4009ggggtaccga gagttaccgg aagatt 262101021126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物40010cgggatccgg ttcacaccat gagcta 26
2101121126212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature223引物40011cgggatccga gagttaccgg aagatt 2權利要求
1.一種鹽芥的花時相關基因ThFLC，其特徵在於該基因具有SEQ NO 4所示的鹼基序列。
2.一種根據權利要求1所述的鹽芥的花時相關基因ThFLC編碼蛋白，其特徵在於具有SEQ NO 5所示的胺基酸序列。
3.一種根據權利要求1所述的鹽芥的花時相關基因ThFLC的克隆方法，其特徵在於該方法具有如下步驟a.以Arabidopsis FLC序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設計引物LP1 5』-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3』，LP2 5』-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3』；b.以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段；c.設計3』-接頭引物，即5』-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3』，藉助3』-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物LP3，即5』-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3』獲得3』末端序列，藉助限制性內切酶StuI拼接得到鹽芥的花時相關基因ThFLC。
4.一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法，其特徵在於該方法是首先構建基因表達載體ThFLC-pPZP211質粒，再以傳統的Floral dip法轉化擬南芥，用卡那黴素作為篩選標記篩選轉基因植株，最後進行轉基因植株的篩選，即得到晚花型擬南芥。
5.一種抑止鹽芥中花時相關基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法，其特徵在於該方法具體為首先借鑑轉錄後基因沉默技術，構建植物高效沉默載體ThFLC-pART27質粒，通過農桿菌介導法轉化鹽芥，用卡那黴素作為篩選標記篩選轉基因植株，即得到早花型鹽芥。
全文摘要
本發明涉及一種鹽芥花時相關基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應用。本發明借鑑擬南芥春化作用途徑花時調控分子機制，克隆鹽芥中與擬南芥FLC同源基因ThFLC全長cDNA序列；分析春化處理促進鹽芥開花與ThFLC表達量的關係；同時用功能補償方法在模式植物擬南芥中驗證了ThFLC功能(抑制開花)；豐富了我們對植物春化作用的認識；更進一步地，通過轉錄後基因沉默的方法，培育出不依賴於春化處理即能啟動生殖發育程序的早花鹽芥，加速以鹽芥為耐鹽模式材料的科研進程。
文檔編號C12N15/65GK1958795SQ200610026208
公開日2007年5月9日 申請日期2006年4月28日 優先權日2006年4月28日
發明者宋任濤, 許政暟, 李杉, 方巧雲 申請人:上海大學