異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用的製作方法

2023-04-26 01:01:06

異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用。該菌株為門多薩假單胞菌（Pseudomonasmendocina）WZUF22，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC?No.7523。本發明的菌株WZUF22進行異養硝化和好氧反硝化的適宜pH和溫度範圍廣，對NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除率高，可為同步硝化和反硝化提供種源。
【專利說明】異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於環境微生物領域，具體涉及一株異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用。
【背景技術】
[0002]氮素給環境造成的汙染問題近年來日益突出，其危害性也日益被人們認識和重視。如氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮有可能轉化為致癌、致突變和致畸的亞硝胺；又如氮素流入水體造成水體富營養化，引起水質惡化以至湖泊退化。生物脫氮具有處理效果好、處理過程穩定可靠、操作管理方便等的優點而得到廣泛應用。
[0003]傳統的生物脫氮由自養硝化菌的硝化作用和厭氧反硝化菌的反硝化作用完成。20世紀80年代以後,人們發現許多細菌如突光假單胞菌(PsGudomorms flur- escens )、糞產喊菌(Alaligenes face alls )、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos)等可以進行異養5肖化，月兌氣苜1J球菌(Paracoccus denitrificans) > Pseudmonas spp.和
faecal is等能進行好氧反硝化，Paracoccus pantotrophus等可以異養硝化_好氧反硝化(微生物學通報，2009，36 (2):255~260)。與自養型硝化菌比較，異養硝化菌的生長速率快，細胞產率高，需要的溶解氧濃度低，能耐受酸性環境且活性高，並且能夠代謝各種形態的氮化合物，同時提高COD的去除率。好氧反硝化和異養硝化的發現打破了傳統的生物脫氮理論，使得同步硝化和反硝化成為可能，不僅可以降低運行成本，減少工藝上繁瑣的操作，還可以擴大自養硝化菌所不能處理的水質範圍。
[0004]到目前為止，已有許多異養硝化或好氧反硝化或異養硝化-好氧反硝化的菌株被分離獲得。分離自不同環境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它們可為實際應用或進一步的菌株改造提供豐富的種源。如李小龍等從魚塘水樣中分離到I株不動桿菌(Acinetobacter sp.),以 KNO3、( NH4)2 SO4、NaNO2 為唯一氮源的培養液中，可在 24h內將培養液中NO3--N從161.61 mg.1降至55.69 mg.?Λ去除速率為4.41 mg.1IT1 NOf-N ；15 h 內將 NH: -N 由 220.24 mg.1 降至 14.78 mg.?Λ 去除速率為 13.70mg.L 1Ii 1 NH4+ - N ； 12 h 內 NO2 -N 濃度由 101.27 mg.L 1 降至 21.85 mg.L 1,去除速率為6.62mgNO2--N ;但其脫氮的適宜pH為偏鹼性的；20°C時不生長，40°C時在NH4+_N測定液中生長緩慢，在Ν02_-Ν測定液中不生長，最佳生長溫度為30 V (微生物學報，2011，51
(8): 1062-1070)，其對pH值和溫度的要求較高，適用範圍小。又如Jibin Zhang等從豬糞汙水中分離獲得I株施氏假單胞菌iPsoudomorms stutzeri YZN-001),在10°C、20°C、30°C和 37。。下，NH:-N 的硝化速率分別約為 1.48、4.20、5.53 和 5.59 mg.Li1 NH: - N ;在 30°C下硝酸硝化率和亞硝酸硝化率分別為11.46 mg.L-V1 NO2--N和10.99 mg.L-1 h-1 Ν03_-Ν(Bioresource Technology, 2011，102: 9866 - 9869)，其去除銨態氮能力較弱。

【發明內容】

[0005]為了解決上述技術問題，本發明提供了一株異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌及其培養和應用。
[0006]本發明提供的一株異養硝化_好氧反硝化的門多薩假單胞菌，該菌株為門多薩假 單胞菌iPseudomonas mendocina) WZUF22,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0. 7523。
[0007]本發明還提供上述門多薩假單胞菌的培養方法，包括如下步驟：
1)保藏菌株WZUF22接種於LB培養基中，培養12h以上，離心，得菌體，菌體用無菌水 洗滌後製成0D-為0. 900?1. 000的菌懸液；
2)步驟1)得到的菌懸液接種於硝化培養基或反硝化培養基中，進行培養；
其中，所述硝化培養基的構成為：氮源，碳源，Mg S04, K2HP04, NaCl，MnS04，FeS04, H20,所 述碳源為檸檬酸鈉、丁二酸鈉或乙酸鈉的其中一種或其組合，所述氮源為含銨離子的化合 物提供；所述反硝化培養基的配方為：碳源，氮源，1(2即04，？必04，1%304，1120，所述碳源為檸檬 酸鈉、丁二酸鈉或乙酸鈉的其中一種或其組合，所述氮源為含硝酸根或亞硝酸根的化合物。
[0008]優選地，：氮源的NH:的質量 0. 34 g，碳源，Mg S04 ? 7H20 0. lg，K2HP04 0. 5g， NaCl 0. 2g, MnS04 ? 4H20 0. 02g, FeS04 0 . 02g, H20 1000 ml, pH 值為 5. 0?10，所述碳源與氮 源的NH:的質量比為5:0. 34?15:0. 34 ;反硝化培養基：碳源，氮源，K2HP04 lg, FeS04 ? 7H2 0 0. 20g, MgS04 ? 7H20 0. 10 g, H20 1000 ml, pH值為5. (TlO，所述氮源為含硝酸根的化合 物時，氮源中硝酸根的質量為o. 61g,所述碳源與N<V的質量比為5:0. 61"15:0. 61,所述氮 源為含亞硝酸根的化合物時，氮源中亞硝酸根的質量為0. 67g，所述碳源與N02_的質量比為 5:0. 0. 67?15:0. 67。
[0009]優選地，步驟1)保藏菌株WZUF22接種於LB培養基中，於20?40°C，溶氧3. 5? 6.1 mg* r1的條件下培養；步驟2)的菌懸液接種於硝化培養基或反硝化培養基中，於 20?40°C，溶氧3. 5?6. 1 mg ? I71下培養。
[0010]優選地，所述硝化培養基或反硝化培養基的pH值為5. (TlO，pH以HC1或NaOH水 溶液進行調節。
[0011]優選地，步驟2)中所述菌懸液以5%的體積比接種於硝化培養基或反硝化培養基 中。
[0012]本發明還提供上述的門多薩假單胞菌的應用，將所述門多薩假單胞菌WZUF22接 種於含氮水溶液中，進行異養硝化脫氮和/或好氧反硝化脫氮。
[0013]作為優選技術方案，所述含氮水溶液為含有NH4+、N03_和N02_的一種或其組合的水 溶液。
[0014]優選地，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH4+-N與好氧反硝化脫N03__N和 no2_-n的碳源含有檸檬酸鈉、乙酸鈉或丁二酸鈉的其中一種或其組合。含氮水溶液中的氮 源只為NH4+-時，碳源與含氮水溶液中NH4+的質量比為5:0. 34^15:0. 34 ;含氮水溶液中的氮 源只為N03_-時，碳源與含氮水溶液中N03_-的質量比為5:0. 6ri5:0. 61 ;含氮水溶液中的 氮源只為N02_-時，碳源與含氮水溶液中N02_-的質量比為5:0. 67^15:0. 67。
[0015]作為優選技術方案，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH/-N與好氧反硝化 脫 NCV-N 和 NCV-N 的 pH 為 4 ?10. 5。
[0016]作為優選技術方案，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH/-N與好氧反硝化 脫N03--N和N02--N的溫度為10°C?40°C。[0017]作為優選技術方案，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH4+_N與好氧反硝化脫 NOf-N 和 NOf-N 的溶氧為 1.3 ~7.3mg.L' 更優選 3.5~6.1 mg.I71。
[0018]本發明能夠達到以下技術效果:
1、本發明的菌株WZUF22進行異養硝化和好氧反硝化的適宜pH和溫度範圍廣，對nh4+-n、no3_-n和Ν02_-Ν的去除率高，可為同步硝化和反硝化提供種源。
[0019]2、本發明經研究提供了適合菌株WZUF22培養的硝化、反硝化培養基和培養方法，可培養獲得大量菌體。
[0020]3、在菌株WZUF22的最佳脫氮條件下，含氮水溶液中的NH4+_N的去除率能夠達到70%以上，並且無NO3--N和NO2--N積累；N03--N和NOf-N的去除率能夠達到100%。
[0021]4、利用本發明的菌株能夠有效地對廢水進行處理，降低廢水C0D，並且脫氮效果良好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是採用MEGA4.1軟體，鄰位連接法顯示菌株WZUF22與相關種的16S rDNA序列系統發育樹，進行1000次的相似度重複計算，圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大於50%數值,上標的「T」表示模式菌株(P., Pseudomonas')。
[0023]圖2是菌株去除人工配製的NH4+-N汙水進程。
[0024]圖3是菌株去除人工配製的Ν03_-Ν汙水進程。
[0025]圖4是菌株去除人工配製的Ν02_-Ν汙水進程。
[0026]菌株保藏
本發明的門多薩假單胞菌iPsGudomorms mendocina ) WZUF22,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7523，保藏起始日期為2013年4月26日。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
[0028]實施例一:異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌菌株的分離
樣品為取自溫州西片汙水處理廠的活性汙泥，採用常規分離法，將一定量活性汙泥接種於富集培養基(NH4Cl lg，檸檬酸鈉 5g，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml, pH 7.0)於 30°C 160 ~180 rpm 下進行富集培養3~4天，待長出細菌後轉接新的富集培養基繼續富集培養，如此重複4~5次。然後將經適當稀釋的菌液塗布於分離培養基(瓊脂18g噸―1，其他成分同富集培養基)於30°C下培養48 h，挑取單菌落轉接新的分離培養基進行劃線純化，直至經鏡檢為純培養物，然後轉接保藏培養基(牛肉膏10g，蛋白腖10g，NaCl 5g,瓊脂18g，H2O 1000 ml，pH 7.0)於30°C下培養後保藏。
[0029]分別將保藏菌株接種於硝化培養基(檸檬酸鈉IOg.L—1，其他成分同富集培養基)於30°C 160~180 rpm下培養(250ml錐形瓶裝培養基100ml)，定時取樣分別用納氏試劑、格利斯試劑I和II以及二苯胺檢測nh4+-n、no2_-n和Ν03_-Ν，根據Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的生成和降解情況以及nh4+-n的降解情況，對保藏菌株的異養硝化-好氧反硝化性能進行初步篩選。對初步篩選獲得的異養硝化-好氧反硝化菌株進行反硝化性能測定，測定方法按文獻進行(東秀珠，常見細菌系統鑑定手冊，北京:科學出版社，2001)，以進一步確定異養硝化-好氧反硝化性能。
[0030]將初篩獲得的異養硝化-好氧反硝化菌株進行異養硝化性能的復篩，方法為將菌株接種於硝化培養基(檸檬酸鈉IOg.L—1，其他成分同富集培養基)於30°C 160~180 rpm下培養24 h (250ml錐形瓶裝培養基100ml),然後於8000rpm下離心IOmin後測定上清液的nh4+-n、no2_-n和Ν03_-Ν濃度，計算NH4+-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的積累情況，篩選nh4+-n去除能力強no2_-n和no3_-n積累低甚至沒有積累的優良菌株。
[0031]然後對異養硝化-好氧反硝化菌株進行好氧反硝化性能的復篩，方法為將菌株接種於反硝化培養基(丁二酸鈉 log, KNO3 1.0g, K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.10 g, H2O 1000 ml, pH 7.0)於 30°C 160 ~180 rpm 下培養 24 h (250ml 錐形瓶裝培養基100ml),然後於8000rpm下離心IOmin後測定上清液的NOf-N和NOf-N濃度,計算NOf-N的去除率和Ν02_-Ν的積累情況，篩選N03_-N去除能力強Ν02_-Ν積累低甚至沒有積累的優良菌株。
[0032]經上述方法獲得I株優良的異養硝化-好氧反硝化菌株，編號為WZUF22。
[0033]其中，Ν03_-Ν測定採用酚二磺酸法分光光度法，Ν02_-Ν測定採用N- (1-萘基)-乙二胺光度法，NH/-N測定採用納氏試劑比色法(國家環境保護局.水和廢水監測分析方法(第三版).北京:中國環境科學出版社，1989)。
[0034]NH4+-N去除率(%)=(培養前上清液NH/-N濃度-培養後上清液NH4+-N濃度)/培養前上清液NH4+-N濃度X 100%
NO3--N去除率(%)=(培養前上清液NO3--N濃度-培養後上清液NO3--N濃度)/培養前上清液NOf-N濃度X 100%
實施例二:異養硝化-好氧反硝化菌株的鑑定
菌株WZUF22在分離培養基培養48h後菌落呈圓形、半透明、表面不光滑、邊緣不整齊、菌落呈淡黃色，菌細胞短杆狀，大小0.7~0.8 X 1.5~3.2 μ m，無芽孢，革蘭氏陰性，單極鞭毛。
[0035]以細菌基因組DNA為模板擴增16SrDNA，擴增採用一對通用引物:上遊引物(Pl):5』 -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3』，下遊引物(P6):5』 -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3』，PCR產物的純化和測序由上海生物工程有限公司完成，測序結果通過GeenBankBlast進行比對分析。與GeenBank中的假單胞菌屬iPseudomorms sp.)的16SrDNA序列具有很高同源性，與P.mendocina的同源性為99.4%。採用MEGA4.1軟體，鄰位連接法顯示菌株WZUF22與相關種的16S rDNA序列系統發育樹見圖1。
[0036]門多薩假單胞菌mendocina ) WZUF22,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7523，保藏起始日期為2013年4月26日。
[0037]實施例三:菌株WZUF22去除NH4+_N和NOf-N的特性
採用單因子試驗法，研究菌株WZUF22分別進行異養硝化去除NH/-N和好氧反硝化去除NO3--N的特性。[0038]實驗過程為:保藏菌株WZUF22 (2.0ml冷凍管融化的菌液)接種於裝有200ml LB培養基(牛肉膏 IOg,蛋白腖 10g, NaCl 5g,瓊脂 18g，H2O 1000 ml, pH 7.0)的 500ml 錐形瓶中，於30°C, 150rpm下培養24 h,在8000rpm下離心IOmin後得菌體,用無菌水洗漆2次後製成OD680為0.900~1.000的菌懸液； 菌懸液按5%體積比的接種量轉接於裝有100ml硝化培養基(NH4Cl，碳源，Mg SO4.7H20，K2HPO4, NaCljMnSO4.4H20, FeSO4, H2O, pH 4~10.5)或反硝化培養基(碳源，KNO3, K2HPO4, FeSO4?7H2 0，MgSO4.7Η20，Η20，ρΗ 4~10.5)的 250ml 錐形瓶中，於一定溫度(1(T40°C )、一定轉速(O~250rpm)下培養24 h, 8000rpm下離心IOmin後測定上清液的NH4+_N濃度、NOf-N濃度和Ν03_-Ν濃度，異養硝化過程計算NH/-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的積累情況，好氧反硝化過程計算NCV-N的去除率和Ν02_-Ν的積累情況。
[0039]NH/-N、NO2--N和NO3--N的測定以及NH4+_N和Ν03__Ν去除率計算同實施例一。
[0040]主要探討碳源、碳源與氮源(NH4Cl或KNO3)的重量比、溫度、pH和溶氧對菌株WZUF22去除NH/-N和Ν03_-Ν的影響，結果如表1~表5所示。
[0041 ] 1、碳源對菌株WZUF22去除NH4+_N和NOf-N的影響
菌懸液按5%體積比的接種量轉接於裝有100ml硝化培養基(NH4Cl Ig (NH4+ 0.34g),碳源 10g, Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g, NaCl 0.2g, MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g,H2O 1000 ml,pH 7.0)或反硝化培養基(碳源 IOg，KNO3 1.0g(NOf 0.61 g),K2HPO4 IgjFeSO4?7H2 O 0.20g,MgSO4.7Η20 0.10 g，H20 1000 ml,pH 7.0)的 250ml 錐形瓶中，於溫度 30°C、轉速150rpm (溶氧4.9mg.171)下培養24 h, 8000rpm下離心IOmin後測定上清液的NH4+_N濃度、no2_-n濃度和Ν03_-Ν濃度，異養硝化過程計算NH4+-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的積累情況，好氧反硝化過程計算NO3--N的去除率和NO2--N的積累情況。
[0042]表1碳源對菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影響結果
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乙7135未Si?.06未檢出由表1可知，菌株WZUF22異養硝化和好氧反硝化的適宜碳源均為檸檬酸鈉、丁二酸鈉和乙酸鈉，它們為碳源時，NH/-N去除率超過70%，NO3--N去除率超過90%，且無Ν03_-Ν、Ν02--Ν的積累。
[0043]2、碳源與氮源(NH4Cl或KNO3)的重量比對菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影響
菌懸液按5%體積比的接種量轉接於裝有100ml硝化培養基(NH4Cl Ig (NH4+ 0.34g)，碳源(其與 NH4Cl 的質量比為 2:1~15:1)，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H20 0.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml, pH 7.0)或反硝化培養基(碳源(其與 KNO3的質量比為 2:1~15:1)，KNO3 1.0g(NOf 0.61g)，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4
?7H20 0.10 g, H2O 1000 ml, pH 7.0)的 250ml 錐形瓶中，於溫度 30°C、轉速 150rpm (溶氧
4.9mg.L—1)下培養24 h，8000rpm下離心IOmin後測定上清液的NH4+_N濃度、Ν02__Ν濃度和Ν03_-Ν濃度，異養硝化過程計算NH/-N的去除率和Ν02_-Ν和Ν03_-Ν的積累情況，好氧反硝化過程計算NCV-N的去除率和Ν02_-Ν的積累情況。
[0044]表2碳源與氮源重量比對菌株WZUF22去除NH4+_N和Ν03__Ν的影響的結果
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【權利要求】
1.一株異養硝化-好氧反硝化的門多薩假單胞菌，其特徵在於，該菌株為門多薩假單胞菌iPsGudomorms mendocina ) WZUF22,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7523。
2.權利要求1所述門多薩假單胞菌的培養方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)保藏菌株WZUF22接種於LB培養基中，培養12h以上，離心，得菌體，菌體用無菌水洗滌後製成 為0.900~1.000的菌懸液； 2)步驟I)得到的菌懸液接種於硝化培養基或反硝化培養基中，進行培養； 其中，所述硝化培養基的構成為:氮源，碳源，Mg SO4, K2HPO4, NaCl，MnSO4, FeSO4, H2O,所述碳源為檸檬酸鈉、丁二酸鈉或乙酸鈉的其中一種或其組合，所述氮源為含銨離子的化合物；所述反硝化培養基的配方為:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源為檸檬酸鈉、丁二酸鈉或乙酸鈉的其中一種或其組合，所述氮源為含硝酸根或亞硝酸根的化合物。
3.根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，步驟I)保藏菌株WZUF22接種於LB培養基中，於20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg* 1-1的條件下培養；步驟2)的菌懸液接種於 硝化培養基或反硝化培養基中，於2(T40°C,溶氧3.5~6.1 mg.L—1下培養。
4.根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述硝化培養基的配方為:氮源的 NH4+ 的質量 0.34 g，碳源，Mg SO4.7H20 0.lg, K2HPO4 0.5g，NaCl 0.2g，MnSO4.4H200.02g, FeSO4 0.02g, H2O 1000 ml，pH值為5.(TlO，所述碳源與氮源的NH4+的質量比為5:0.34~15:0.34 ;反硝化培養基:碳源，氮源，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.10 g，H20 1000 ml，pH值為5.(TlO，所述氮源為含硝酸根的化合物時，氮源中硝酸根的質量為0.61g,所述碳源與NOf的質量比為5:0.61"?5:0.61,所述氮源為含亞硝酸根的化合物時，氮源中亞硝酸根的質量為0.67g，所述碳源與N02_的質量比為5:0.0.67^15:0.67。
5.權利要求1所述的門多薩假單胞菌的應用，其特徵在於，將所述門多薩假單胞菌WZUF22接種於含氮水溶液中，進行異養硝化脫氮和/或好氧反硝化脫氮。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述含氮水溶液為含有NH4+、N03-和NO2-的一種或其組合的水溶液。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫nh4+-n與好氧反硝化脫no3_-n和no2_-n的碳源含有檸檬酸鈉、乙酸鈉或丁二酸鈉的其中一種或其組合。
8.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH/-N與好氧反硝化脫NO3--N和NO2--N的pH為4~10.5。
9.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH/-N與好氧反硝化脫NO3--N和NO2--N的溫度為10°C~40°C。
10.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述門多薩假單胞菌WZUF22異養硝化脫NH/-N與好氧反硝化脫Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的溶氧為L 3~7.3mg.L'
【文檔編號】C02F3/34GK103484398SQ201310380437
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】周茂洪, 趙肖為, 葉海仁, 蔣張亮 申請人:溫州大學