一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體及其應用的製作方法

2023-04-25 16:10:01 2

一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體及其應用，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala和/或第20位由Arg突變為Lys，將突變後的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶與大腸桿菌原有的MEP途徑結合，構建了高效合成異戊二烯的工程菌株，利用該菌株進行發酵生產異戊二烯。重組菌異戊二烯合成能力較原始菌株提高1.5倍以上。
【專利說明】一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體及其應

用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，以及利用該突變體構建重組菌發酵生產異戊二烯的方法。
【背景技術】
[0002]異戊二烯又名2-甲基-1,3-丁二烯，是一種共軛二烯烴，易自身聚合，也易與其它不飽和化合物共聚合，因此，異戊二烯是一種重要的合成橡膠單體。在工業上，可被齊格勒-納塔催化劑催化聚合合成聚異戊橡膠，即天然橡膠；異戊二烯還可以用作合成丁基橡膠的一種共聚單體，以改進丁基橡膠的硫化性能。此外，異戊二烯在農藥、醫藥、香料及粘結劑等領域也有廣泛的應用。
[0003]目前，異戊二烯的主要來源是石油裂解精餾，是碳五餾分的重要組分。碳五餾分組成複雜，直接精餾難以得到純度較高的異戊二烯產品，通常採取萃取精餾及共沸精餾法由裂解碳五餾分中分離高純度異戊二烯，增加了異戊二烯的生產成本。除碳五餾分分離得到異戊二烯外，工業上還採用合成法生產；例如採用碳五以下的有機原料，如丙烯、異丁烯、甲醛、丙酮和乙炔來合成。隨著石化資源的枯竭，研究者們開始尋找新的異戊二烯生產方法，利用微生物轉化可再生的生物質資源生成異戊二烯，因其可再生型和對環境友好型，是一條具有潛在應用前景的途徑。
[0004]生物體內有兩條途徑合成異戊二烯，MVA途徑和MEP途徑。MVA途徑存在於真核生物及古細菌中，而MEP途徑主要存在於植物質體、真菌和各種細菌中。到目前為止，採用生物法合成異戊二烯的最有產量是通過MVA途徑實現的，美國的Genercor公司在工程大腸桿菌中利用MVA途徑進行異戊二烯合成，最高產量可以達到60g/L以上(美國發明專利:2009/0203102);通過MEP途徑合成異戊二烯的報導產量目前都還比較低(Zhao etal.，Applied Microbiology and Biotechnology, 2011，90 (6): 1915-22)。然而，與 MVA 途徑相比，MEP途徑具有更高的理論產量，其產量較低推測是由於該途徑中的關鍵酶活性不高的原因造成的。
[0005]2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶催化MEP生成2_甲基_4_ 二磷酸胞苷赤蘚糖醇(CDP-ME)(圖1 )，是MEP途徑中的關鍵反應。在大腸桿菌中，該酶是一個同源二聚體，由ispD 基因編碼,其結構已經得到了解析(Kemp et al., Acta Crystallographica SectionD, 2003, 59:607)。本發明通過採用易錯PCR技術對該酶進行定點突變，獲得了改性的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶，並整合到完整的MEP途徑中，在發酵水平提高了異戊二烯的產量。

【發明內容】

[0006]本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala。[0007]本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第20位由Arg突變為Lys。
[0008]本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Ρι.ο突變為Ala，第20位由Arg突變為Lys0
[0009]本發明採用易錯PCR的手段對大腸桿菌的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶進行突變，並結合下遊合成β_胡蘿蔔素的途徑進行篩選，獲取了較之大腸桿菌(Escherichia coli K_12 MG1655)原始2_甲基赤蘚糖醇4_磷酸胞苷醯轉移酶催化活性明顯提聞的酶。
[0010]所述2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本發明專利還提供了採用2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體增強大腸桿菌合成異戊二烯能力的方法。
[0012]利用突變後的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶提高異戊二烯合成能力的方法還包括:(a)將突變後的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體連接原核表達載體；(b)將該表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合；(c)利用導入該2-甲基赤蘚糖醇4 -磷酸胞苷醯轉移酶的重組大腸桿菌發酵合成異戊二烯。
[0013]本發明所提供的利用突變後的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶提高異戊二烯合成能力的宿主細胞，優選大腸桿菌(Escherichia coli BL21(DE3))。
[0014]有益效果:
[0015]I)本發明所製備的提供的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，導入大腸桿菌中後，所獲得的工程菌株其異戊二烯合成能力較原始菌株提高1.5倍以上，該結果有望推動生物法製備異戊二烯工業化的進程。
[0016]2)本發明是針對異戊二烯合成途徑單一關鍵酶進行的改造，可以與合成途徑中其它酶進行整合，並對其它酶的改造提供指導作用，從而有望進一步提高異戊二烯的合成能力。
[0017]3)本發明所提供的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，其作用不僅僅限於提高異戊二烯的合成能力。該突變體對於異戊二烯合成途徑下遊的各種萜類化合物的合成理論上同樣具有促進作用，有可能應用於其它高附加值產品的合成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖12-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶催化的反應
[0019]圖2pEASY_ispD 載體圖譜
[0020]圖3ispD基因突變子與原始基因序列的比對[0021 ] 圖4異戊二烯氣相色譜檢測
【具體實施方式】
[0022]實施例1:
[0023]大腸桿菌2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶基因(ispD)的克隆，具體過程如下:[0024]以寡核苷酸5』- CAT GCC ATG GCA ACC ACT CAT TTG GAT G -『3 和 5』- CCG GAATTCTTA TGT ATT CTC CTG ATG GAT GG -『3為引物，以大腸桿菌的總DNA為模版，採用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增出2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶基因，PCR體系和條件如下所示:
【權利要求】
1.一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala和/或第20位由Arg突變為Lys。
2.如權利要求1所述突變體，其特徵在於，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala。
3.如權利要求2述突變體，其特徵在於，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala和第20位由Arg突變為Lys。
4.如權利要求1所述突變體，其特徵在於，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列第20位由Arg突變為Lys。
5.權利要求1-4所述任一2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶胺基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
6.一種發酵生產異戊二烯的方法，其特徵在於，步驟如下: 1)將權利要求1-4所述任一2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體連接原核表達載體； 2)將步驟1)得到的表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合； 3)利用導入該2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體的重組大腸桿菌發酵合成異戊二烯。
7.如權利要求6所述方法，其特徵在於，大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.如權利要求6所述方法，其特徵在於，步驟如下: 1)將2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體連接原核表達載體，所述突變體為SEQ ID N0.1所示胺基酸序列第13位由Pro突變為Ala或第13位由Pro突變為Ala同時第20位由Arg突變為Lys ； 2)將步驟I)得到的表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合； 3)利用導入該2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體的重組大腸桿菌發酵合成異戊二烯。
9.如權利要求6所述方法，其特徵在於，步驟如下: 1)將2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體連接原核表達載體，所述突變體為SEQ ID N0.1所示胺基酸序列第20位由Arg突變為Lys ； 2)將步驟I)得到的表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合； 3)利用導入該2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷醯轉移酶突變體的重組大腸桿菌發酵合成異戊二烯。
10.如權利要求6-9所述任一方法,其特徵在於，含有突變體的表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合具體方法為:採用鹼裂解法含有突變體的重組質粒，轉化攜帶有PYJM8質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，得到重組工程菌BL21/pET-1spD&pYJM8。
【文檔編號】C12N15/70GK103642767SQ201310473741
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】鹹漠, 曹玉錦, 劉煒, 王紀明 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所