增強哺乳動物精子功能的組合物和方法

2023-04-25 09:50:56 2

專利名稱：：增強哺乳動物精子功能的組合物和方法增強哺乳動物精子功能的組合物和方法相關申請的交叉參考特此要求2006年1月19日申請的臨時申請序號60/760,312的優先權，所述臨時申請通過引用結合到本文中。發明領域本發明涉及包含育性相關抗原(FAA)和2型金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-2)的組合的組合物。本發明還涉及使用該組合物的方法，該方法一般地講增強哺乳動物精子的功能性，更具體地說增強包含在冷凍保存的精液中的精子的功能性。參考書目本文所提及論文的完整參考書目引用包含在其後緊接權利要求書的參考書目章節。在參考書目中提及的論文通過引用結合到本文中。發明背景已有大量文件證實，精液是由雄性副生殖器官(即精嚢、前列腺和尿道球腺)的分泌物組成的複雜混合物。在迄今為止發現並表徵的精液組分中，已表明有一些在體外抑制精子獲能，另一些在體外刺激精子獲能。刺激獲能的精液組分包括結合精子射精並運送肝素誘導的獲能的肝素結合蛋白(HBP)家族(Miller,1990)。通過用純化的HBP免疫產生的鼠單克隆抗體(mAb)Ml識別牛精子提取物的免疫印跡中的3種不同蛋白(Bellin等，1996,1998)。3種HBP中的一種表現為單一的31kDa質量，被描述為育性相關抗原(FAA;Bellin等，1998)。稱為FAA的肝素結合蛋白的多核苷酸編碼序列和FAA的胺基酸序列與其它精液蛋白截然不同。業已描述了編碼非人FAA的分離多核苷酸。參見2005年5月10日頒發的美國專利第6,891,029號。2型金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-2)為公牛(Calvete等，1996,McCauley等，2001)、人(Baumgart等，2002;Shimokawa等，2003)、大鼠(Siu和Cheng,2004)以及公羊和公馬(Metayer等，2002)的精液的正常成分TIMP-2在包括睪丸和副性腺在內的多種細胞類型中產生。和FAA—樣，TIMP-2也由這些腺體分泌。在射精過程中，TIMP-2結合穿越尿道的精子。已描述了4種TIMP蛋白，它們抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的催化能力(Nagase等，1999)。MMP是多種生殖過程的介導物，包括排卵、著床、分娩、內巻(involution)以及前列腺和睪丸功能(Hulboy等，1997)。MMP已^C定位於正常和異常的人類精子的頂體和中段(Buchman-Shaked等，2002)。TIMP-2通過抑制失活的前-MMP-2酶原的切割和轉變為其活性形式而優先調節MMP-2(Brew等:2000)。在回顧性分析中，Dawson等(2002)報告，在精子變性提取物中具有TIMP-2的公牛的育性比TIMP-2陰性公牛高13%。TIMP-2是一種肝素結合蛋白(McCauley等，2001)。育性相關抗原(FAA)是一種在牛副性腺中產生的精液蛋白質。FAA在射精時結合精子(McCauley等，1999)。其是約31kDa的非糖基化鹼性蛋白質，與新出現的DNA酶I樣蛋白具有高度同源性。牛FAAcDNA序列與DNA酶-l-樣-3(DNaselL3)具有88%的同一性，DNaselL3是由人肝臟表達的序列標籤(EST)克隆的基因(Rodriguez等,1997)。文獻中的DNaselL3命名包括LS-DNA酶和DNA酶I同源蛋白2。DNaselL3主要在肝細胞和脾細胞中表達。FAA被鑑定(McCauley等，1999)為牛精液HBP中的次要組分。FAA的表達發生於精嚢、前列腺和尿道球腺。已在公牛、公豬、公羊、山羊、狗和人的精液中檢測到FAA，其主要定位於精子頭部的頂體帶(Dawson等，2003)。預測的DNaselL3蛋白與經典的DNA酶I45%相同，DNA酶I是已被充分表徵的胰腺酶(Kinshi等，1989)。就酶活性、表達的調節和位置而言，DNA酶I樣家族成員與DNA酶I不同，它們的生物學作用還沒有被確定。FAA是公牛較高育性的蛋白標記；與沒有可檢測的FAA的精子提取物相比，含有通過蛋白質印跡可檢測的FAA的精子提取物指示較高的公牛育性。此觀察結果包括用於自然交配的公牛和在多公畜牧場中以1頭公牛/25頭母牛的比率接觸母牛的公牛(Bellin等，1994;1996;1998)，或者利用單次人工授精與小母牛和母牛交配的公牛(Sprott等，2000)。假定FAA由於其肝素結合特徵而參與精子獲能的調節和/或頂體反應的誘導。精子在體外對補加肝素的介質的反應以接觸適宜的誘導物(Ca^離子載體、透明帶或諸如溶血性磷脂醯膽鹼的融合劑)時頂體反應的劑量-反應性增加為特徵，在這些條件下精子進行頂體反應的能力與公牛育性正相關(Ax和Lenz，1987)。肝素結合蛋白在分離自精清時加強肝素誘導的獲能(Miller等，1990)。有可能用稱為Ml的單克隆抗體(Bellin等，1998)或近來描述的多克隆抗重組FAA抗血清(McCauley等，2004)檢測精液樣品中的FAA。在篩選914頭/>牛的精液樣品的FAA時，26%的樣品未檢測到產生FAA(McCauey等，20(M)。最近報告了FAA陰性/>牛的類似發生率(Sprott等，2006)。較低育性的公牛產生的精子在體外響應肝素進行獲能的能力較差(Ax等，1985;Ax和Lenz,1987;Lenz等，1988)。對人工授精產業(對於人類和其它哺乳動物這二者而言)必須要考慮的是成功率。當然，衡量成功的關鍵標準是每個人工授精事件產生的活體子代數。因此，有助於提升獲能率的條件(該條件又在能夠使卯細胞受精的射精中產生更高的精子比例)在高度竟爭性的人類和動物繁殖、人工授精方案、使用體外受精的畜牧業等方面極具價值。發明概述本發明涉及改善用於人工授精的精液樣品的育性或受精力(fertility)的組合物和相應方法。本發明用於在新鮮的和冷凍保存的精液中改善未按性別分揀的(non-gendersorted)精子和按性別分揀的(gender-sorted)精子的功能性。因此，第一種形式的本發明涉及用於增強精子的活力或頂體完整率(PIA)的物質組合物，所述組合物包含組合的一定量的FAA和一定量的TIMP-2，其中所述量有效增強與該組合物接觸的精子的活力、PIA或者活力和PIA。FAA和TIMP-2可配置在精液儲存介質中，所述介質例如為Tyrode氏白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽介質(TALP)。組合物中的FAA和TIMP-2的濃度使得在接觸時精子被配置在約5昭/mL至約200jig/mLFAA和約5|tig/mL至約200|tig/mLTIMP-2的範圍、更優選約5jig/mL至約100昭/mLFAA和約5昭/mL至約100昭/mLTIMP-2的範圍、再更優選約10昭/mL至約50(ig/mLFAA和約10嗎/mL至約50嗎/mL的範圍的環境中。優選FAA和TIMP-2均為重組蛋白質。本發明的物質組合物可4皮凍幹，在此情況下其在與精子接觸前與合適的介質水合。另一種形式的本發明涉及改善精子功能性(以及在使用前冷凍儲存精子)的方法。該方法包括使精子與如剛才前段落描述的物質組合物接觸。該方法可用於改善按性別分揀的精子和/或未按性別分揀的精子的功能性。該方法任選地還包括在使精子與本發明的物質組合物接觸後在該物質組合物存在下冷凍或冷凍保存精子。又一種形式的本發明是用於增強精子的活力或頂體完整率(PIA)的試劑盒。該試劑盒含有組合的如先前段落描述的物質組合物，該組合物配置在適宜的容器中。包含在該試劑盒中的FAA和TIMP-2的量組合地有效增強與該組合物接觸的精子的活力、PIA或者活力和PIA。該試劑盒任選地包括如何使用該試劑盒的說明書。本發明包括含有單位劑量形式的FAA和TIMP-2組合的組合物。也就是說，FAA和TIMP-2的組合以濃縮形式(例如濃縮的溶液或凍幹的)提供，並進4亍包裝，使得包裝內容物在加入到適宜量的精液儲存介質中時，整個包裝內容物產生的溶液具有適宜濃度的FAA和TIMP-2。附圖簡述圖1A和IB:重組FAA(rFAA)誘導的時程。如本文所述用IPTG誘導細菌培養物。在相對於誘導蛋白表達的0、2和4小時收集1mL樣品。用非變性(50mMKPO4、400mMNaCl、100mMKCl、10%甘油、0.5。/。曲通X-100和10mM咪唑，pH7.8)裂解緩衝液(圖1A，可溶的)或用變性8M尿素緩沖液(圖1B,不可溶的)製備的提取物通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)獨立分析。繪製在各個時間點的誘導的("i，，)和未誘導的("ui")級分。rFAA表現為不溶性級分中誘導樣品的主要蛋白(圖1B，泳道"4hi，，)。M-分子量標i己。圖2A和2B:rFAA的表達和檢測。Sol=用非變性裂解緩沖液4是取的可溶性裂解物；Insol=在Laemmli樣品緩衝液中裂解的不溶性包涵體；UI-未誘導的對照裂解物；1=誘導的(0.5mMIPTG)裂解物。圖2A圖示了SDS-PAGE凝膠。圖2B圖示了蛋白質印跡。蛋白質印跡用綴合辣根過氧化物酶的抗His(6x)抗體(1:5000稀釋度)進行。rFAA由適宜分子量的抗體特異性識別，證實高度可誘導的rFAA表達。M=分子量標記。圖3:rFAA的純化。用4mL變性緩衝液(8M尿素)裂解25mL液體培養物的細菌細胞沉澱(S-起始材料)，並將其與lmL(0.5mL床體積)BDTalon牌金屬親和樹脂混合20分鐘。收集未結合的(UB)的材料，用5mL(10X床體積)緩沖液洗滌樹脂IO分鐘(WI),重複該洗滌(W2)，rFAA用含有250mM咪唑的0.5mL(lx床體積)變性緩衝液洗脫(El-5)。高度純化的重組FAA在洗脫級分中顯現為單一條帶。M=分子量標記.圖4:親和純化的重摺疊rFAA。透析純化的rFAA,並如在發明詳述中所述重摺疊。M-分子量標記；rFAA-最終的純化產物。圖5:rTIMP-2誘導的時程。細菌培養物如在發明詳述中所述用IPTG誘導。在相對於誘導蛋白表達的2和4小時收集lmL樣品。用變性8M尿素緩沖液製備提取物，並通過SDS-PAGE分析。凝膠用考馬斯藍染色。繪製在各個時間點的未誘導的("ui")和誘導的("i")級分。相比於2和4小時(ui)，在2和4小時(i)清楚檢測到可誘導的rTIMP-2。M-分子量標記。圖6A和6B:rTIMP-2的表達和檢測。在2小時表達培養後製備誘導的(0.5mMIPTG)裂解物。可溶的和不溶的級分通過SDS-PAGE(圖6A)和蛋白質印跡(圖6B)分析。圖6A圖示了考馬斯藍染色的凝膠，圖6B顯示了用綴合辣根過氧化物酶的抗His(6x)抗體(1:5000稀釋度)進行的蛋白質印跡。Sol-可溶性裂解物；Insol-不溶性包涵體；M-分子量標記。rTIMP-2(由圖6A和6B中的箭頭指示)容易通過不溶級分的考馬斯藍染色檢測。儘管蛋白質印跡對檢測可溶性級分中的rTIMP-2敏感，但在不溶性級分中存在強得多的rTIMP-2條帶，反映出通過考馬斯藍染色檢測的差異。圖7A和7B:由2小時表達培養物純化rTIMP-2。用變性緩衝液裂解細菌細胞沉澱(S-起始材料)，並將其與BDTalon牌金屬親和樹脂混合20分鐘。收集未結合的(UB)材料，用緩沖液洗滌樹脂(W1、W2),rTIMP-2用含有250mM咪唑的0.5mL(lx床體積)變性緩衝液洗脫(E1、E2)。M-分子量標記。進行SDS-PAGE(圖7A;考馬斯藍染色)和蛋白質印跡(圖7B;抗His6)，以證實純化物質的純度。圖8:親和純化的重摺疊rTIMP-2。透析純化的rTIMP-2，並如在發明詳述中所述重摺疊。M-分子量標記；1和2=在重摺疊兩個不同批次製備物後的rTIMP-2產物。圖9:重組FAA加強的、肝素誘導的體外牛精子獲能。數據通過組間方差分析(ANOVA)來分析。顯示了最小二乘法平均值和平均值的標準偏差(SEM)。實驗重複4次。沒有相同字母標誌的值顯著不同(pC"核苷酸取代，該取代在翻譯的蛋白中產生"T86~>P"突變。4個相同克隆的603bp的共有核苷酸序列描述於SEQ.ID.NO:3，翻:^的基因產物示於SEQ.ID.NO:4。克隆Al-5被轉化入原核表達細胞(BL21(DE3)pLysS)中，生產為His6標記的融合蛋白的rFAA。實際的231個胺基酸的翻譯基因產物示於SEQ.ID.NO:12。SEQ.ID.NO:12與SEQ.ID.NO:4的不同之處僅在於其含有由載體自身的3，末端編碼的24個殘基和6個C端組氨酸殘基。重組FAA產物總計為231個胺基酸，分子量為26.7kDa，含有His6標籤。(參見SEQ.ID.NO:12)。細菌裂解物的可溶性和不溶性級分的SDS-PAGE分析表明，rTIMP-2主要以包涵體的形式在不溶性級分中表達。溫育4小時的誘導培養物中的rTIMP-2表達與2小時相比沒有顯著上調(參見圖5)。因此，rTIMP-2表達培養物在用IPTG誘導後延續2小時。與rFAA的表達(其主要見下文)類似，rTIMP-2主要在不溶性細菌裂解物中表達(參見圖6A和6B)。採用抗His6抗體的蛋白質印跡證實了His標記的重組蛋白的身份(參見圖6B)。使用基於鈷的金屬親和樹脂(抗His6)將細胞裂解物的rTIMP-2純化至接近均一。圖7A和7B描繪了通過SDS-PAGE(圖7A)和蛋白質印跡(抗His6)(圖7B)觀察到的rTIMP-2的典型純化譜。將含有rTIMP-2(圖7A和7B中的泳道S)的整個裂解物與金屬親和樹脂混合，並由樹脂洗脫純化的rTIMP-2(圖7A和7B;透析重摺疊。純化的重摺疊終產物(示於圖8的凝膠)用於功能性精子測定。重組TIMP-2和FAA在本文所述條件下以相對高水平(>50-75mg/L)表達。重摺疊的純化重組蛋白的回收率在幾個實驗批次之間為約15J5mg/L培養基(約30%回收率)。(參見實施例的實驗細節)。細菌裂解物的可溶性和不溶性級分的SDS-PAGE分析表明，rFAA主要以包涵體形式在不溶性級分中表達。對比圖1A(可溶性級分)和圖1B(不溶性級分)。最佳rFAA表達的時程為誘導後4小時，如27kDa條帶的刺激表達水平所示。對比圖1B泳道"4hi"(4小時，誘導的)與圖1B泳道"2hi"(2小時，誘導的)或任何標記為"ui"(未誘導的對照)的泳道。因此，所有rFAA表達培養物在用IPTG誘導後都延續4小時。rFAA的表達通過含抗His6抗體的4小時培養物的蛋白質印跡證實(參見圖2B)。通過該抗體檢測到未誘導的樣品(可溶的和不溶的)中低水平組成型表達的rFAA,類似於在誘導的可溶性樣品中檢測到的水平(參見圖2A)。不溶的誘導裂解物明顯地主要含有rFAA，以蛋白質印跡中強烈的抗體交叉反應為證(圖2B)。使用基於鈷的金屬親和樹脂(抗HiS6)在變性條件下將細胞裂解物中的rFAA純化至接近均一。圖3顯示了通過SDS-PAGE和考馬斯藍染色觀察到的典型純化i普。將含有rFAA的整個裂解物(圖3中的泳道S)與金屬親和樹脂混合，以使rFAA特異性結合樹脂。在多次洗滌後，用5個床體積的洗脫緩衝液連續地由樹脂洗脫純化的rFAA(圖3，泳道E1至E5)。通過在非變性緩衝液中進行多步透析重摺疊親和純化的變性rFAA,純化的重摺疊終產物(示於圖4的凝膠)用於功能性精子測定。rTIMP-2以劑量依賴性方式加強肝素誘導的獲能。加入rTIMP-2導致頂體反應性精子的百分率劑量反應性增加(P<0.05),高於用單獨的肝素或肝素和溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)治療後觀察到的百分率。參見圖10，該圖描繪了隨rTIMP-2濃度(昭/mL)變化的頂體反應性精子的百分率。頂體反應的最大刺激(57%)需要加入200|ug/mL的rTIMP-2。然而，以25昭/mL觀察到的反應與50或100|Lig/mL沒有顯著不同。採用空載體裂解物的對照溫育與由單獨的肝素和LPC誘導的沒有差異(未顯示數據)。rFAA也以劑量依賴性方式加強肝素誘導的獲能。在沒有LPC刺激的情況下與單獨的肝素溫育4小時(圖9，"Hep")導致在約16%的精子群中誘導頂體反應(即自發的頂體反應)。在與肝素的4小時溫育結束時加入LPC(圖14,"0")產生約30%的頂體反應性細胞。加入rFAA導致頂體反應性精子的百分率劑量依賴性增加(p〈0.05)。以25昭/mLrFAA實現了約60%反應性精子的最大響應(參見圖9)。用空載體(沒有插入片段的陰性對照)轉化的培養表達細胞在用細菌提取物治療後的頂體反應性精子的百分率與由單獨的肝素和LPC誘導的沒有差異(未顯示數據)。因為rTIMP-2和rFAA以25|ug/mL的濃度獨立地刺激頂體反應，所以進行實驗，以檢查rTIMP-2和rFAA對頂體反應的組合作用。0、25和50昭/mL的rTIMP-2和rFAA的交叉治療表明治療之間沒有顯著的相互作用。在沒有rFAA治療的情況下，沒有觀察到獨立的rTIMP-2作用，表明rTIMP-2的作用被公牛改變。然而，以每個劑量加入rFAA都加強rTIMP-2作用(參見圖11)，導致所誘導的頂體反應百分率增加與在單獨的rFAA和TIMP-2的劑量-反應實驗中所觀察到的類似。25(ig/mL的rTIMP-2濃度產生的作用與在50昭/mL的較高劑量觀察到的作用沒有差異。然後用含有組合的rTIMP-2和rFAA的組合物處理精子。具體地說，評價處理的和未處理的精子在冷凍保存後的活力和頂體完整性。因此，在進行冷凍保存之前，用25昭/mL組合的rFAA和rTIMP-2處理新鮮收集的精液樣品。冷凍保存按照工業標準進行。在融化後(O小時)立即盲評活力(％)和頂體完整性(頂體完整率，PIA)。然後將樣品於38。C溫育3小時，此時重複進行檢測。3小時溫育期代表了人工授精工業的標準質量控制測試，用於確定精液樣品在多大程度上能夠經受與冷凍保存和融化相關的損害。對比融化後3小時的處理樣品和對照樣品表明，治療使活力顯著提升。與處理樣品的活力(55.7土1.6;參見表l)相比，對照樣品的活力(50.4土1.7)在3小時溫育期後降低(p〈0.0001)。同樣，在3小時時間段後，對照樣品在融化後具有完整頂體的精子百分率(66.9土1.6)與處理的樣品相比(70.9士1.3;參見表1)顯著下降(p〈0.01)，表明(一般相信)重組蛋白在冷凍保存過程中保護細胞的漿膜。另參見圖12中顯示的曲線圖。如在該曲線圖中所示，用組合的rFAA和rTIMP-2處理的精液改善經歷冷凍保存的公牛精液的PIA0)和活率(——)。該作用在較低精子濃度(1(^106個精子/塑料細管)時特別顯著。另外，已確認rFAA和rTIMP-2這二者在所述重組蛋白直接加入純精液時結合精子膜。參見圖13，該圖為證實結合作用的凝膠。對新鮮收集的純公牛精液補加25嗎/ml空載體(圖13的泳道1和3)或25嗎/mlrFAA(圖13的泳道2和4)，並溫育20分鐘，然後進行商業冷凍保存。然後融化精液，洗滌精細胞3次，通過採用抗HiSfe抗體的蛋白質印跡評價細胞裂解物。如在圖13中所示，在補加rFAA的樣品中檢測到單一條帶，表明向純精液直接加入重組蛋白足以允許精細胞吸收。使用rTIMP-2觀察到類似的結果(未顯示數據)。這些結果的意義在於，它們確認所述治療可直接應用於純精液(以及已由精液中分離出來並重懸浮在不同介質中的精細胞)。表1.在冷凍保存、融化和於38。C溫育3小時之後評價rTIMP-2和rFAA對精子活力(百分率)和頂體完整性(頂體完整率，PIA)的組合作用。精子被包裝成10x106、20xl(^或25《106個精子/塑料細管。數據表示為平均值土SEM。提供所有劑量(25頭公牛的65次射精液)的組合數據，之後提供通過多種精子濃度評價的一部分樣品的組合數據。tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage181實驗精液樣品在收集時補加25|ig/mlrTIMP-2和25貼/mlrFAA。所有樣品都使用工業標準技術冷凍保存。2通過Studentt檢驗分析數據；上標表示於所示水平達到的顯著性***p<o.ooOi、**p<o.01、*p<0.05、卞pO.lO。表1提供的結果表明了本發明的用途。含有FAA和TIMP-2組合的組合物為經受冷凍保存和融化的精子賦予統計學顯著的活力增加以及統計學顯著的PIA增加。兩個參數(活力和PIA)均正好與人工授精的成功成正比。精子必須既是運動的，又具有完整頂體，以穿透卵子。先前按性別分揀以分離攜帶X-染色體的精子和攜帶Y染色體的精子的精液樣品在冷凍保存後也經受3小時的應力測試。初步數據表明，精子與含有組合的rFAA和rTIMP-2的組合物接觸將精子活力(％)和PIA分別改善了平均33.1%和42.5%。參見表2。表2.按性別分揀的精子在融化後3小時的活力和頂體完整率(PIA)。tableseeoriginaldocumentpage19表2提供了3頭公牛的數據。使用按性別分揀的精子的其它實驗正在進行中，以馬全證rFAA和rTIMP-2在這些特化類型的精液樣品中的冷凍保護作用。儘管樣本量小，但提供於表2的數據是引人注目的。該數據強有力地表明，含有組合的FAA和TIMP-2的冷凍保存溶液顯著增加冷凍保存精子的活力和PIA。如在表2中所示，治療過的精子的活力與未治療的對照相比增加33.1%。治療過的精子的PIA與未治療的對照相比增加42.5%。這些顯著改善證實了本發明增加冷凍保存精子的功能性的用途。因此，本發明包括能夠大量生產為重組融合蛋白的兩種獨立精液蛋白(rFAA和rTIMP-2)的轉化細胞系。這些蛋白可用作精液添加劑，以改善精子功能，尤其是在冷凍保存精液中。根據經歷冷凍保存的細胞對肝素誘導的獲能的響應和頂體完整性的測定，含有這兩種重組蛋白組合的組合物改善精子功能。(參見實施例和以上討論)。這些精液添加劑增強頂體反應，精子膜被保護，在融化後產生更有功能的精液產物。在標準的冷凍保存精子和按性別分揀的冷凍保存精子中均表現出有益作用。本發明特別適合於按性別分揀精子的領域，因為已知按性別分揀的精子的活力和育性不如常規(未分揀的)精子，原因在於與分揀細胞群相關的應力。性控精液樣品由本發明極大地獲益，因為本發明的組合物和方法能夠降低對融化後的活力和完整頂體的負面作用。因為與未性控的常規冷凍精液相比，當前的精子性控技術使每個授精塑料細管的性控精子更少，所以有益作用被進一步加強。因此，增加每塑料細管中存在的精子的功能性的本發明還改善對常規冷凍的響應不佳的公牛精液的育性。本發明還增加精子數減少的塑料細管和按性別分揀的塑料細管中的精子的功能性。簡而言之，本發明能夠增加性控塑料細管中的精子的功能性，以使這些按性別分揀的精液樣品的育性與它們的未分揀的對應物相同。編碼本文所述的重組蛋白的FAA和TIMP-2基因在哺乳動物之間具有高度同源性。因此，本發明適用於廣泛範圍的哺乳動物物種，包括所有的經濟學上重要的牲畜、瀕危動物和人。實施例包括以下的實施例僅是為了提供本文描述並要求保護的本發明的更完整的公開內容。實施例不以任何方式限制本發明的範圍。除非另有說明，否則化學品和試劑由SigmaChemical(St.Louis，Missouri)商購獲得。1.克隆和序列分析(a)2型金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-2):先前報告了24kDa精液肝素結合蛋白(HBP-24)的純化(McCauley等，2001)。由精液純化的HBP-24的微序列分析鑑定出20個N末端胺基酸殘基，其與被鑑定為金屬蛋白酶-2組織抑制劑(TIMP-2;DeClerck等，1989)的牛金屬蛋白酶抑制劑的N-末端具有90%同一性。為克隆精液TIMP-2基因，基於已公布的牛大動脈cDNA序列(Boone等，1990)設計牛TIMP-2基因特異性引物。總RNA由牛副性腺組織(精嚢、尿道球腺和前列腺)提取。如McCauley等(2001)所述進行逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法。部分TIMP-2cDNA的擴增是成功的，由每個牛副性腺產生RT-PCR產物。全部3個腺體的RT-PCR產物的DNA序列的分析表明，在它們之間以及與公布的cDNA序列(Boone等，1990)具有95%以上的同源性。隨後，如下所述克隆和測序TIMP-2基因的完整編碼區。(b)PCR擴增進行逆轉錄PCR，以由精嚢RNA擴增首鏈cDNA。cDNA合成由用5昭總RNA作為模板的SuperscriptIIRNA酶H—RT(GibcoBRL,GrandIsland,NewYork)催化。首鏈cDNA產物在TIMP陽2基因的部分cDNA區段的PCR擴增中用作模板，所述區段如McCauley等(200l)所述基於牛大動脈TIMP-2序歹ij(M32303)設計。基因特異性引物設計用於由精嚢擴增牛TIMP-2基因的完整編碼序列。使用的引物為正向5'-atgggcgccgccgcccgcagcctgccgctcgcgttctgcctcctgctgctg-3，(SEQ.ID.NO:5)和反向5，-tcaatgatgatgatgatgatgcgggtcctcgatgtccagaaact-3，(SEQ.ID.NO:6)。PCR循環條件為45秒，94。C;45秒，57°C;和1分鐘，72。C,35個循環。按照生產商的說明將擴增的PCR產物克隆到pCR4-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中，並使用AppliedBiosystems373A自定化DNA測序儀使用DyeDeoxy牌終止子化學品測序。所有序列數據都用GCG軟體(也稱為Wisconsin軟體包)(可由美國國立衛生研究所在線公開獲得，10.0版)分析。分離並表徵兩種不同的克隆bTIMP-215L和bTIMP-225。第一個克隆bTIMP-215L具有包含bTIMP-2的完整前體的所有密碼子的目標基因。bTIMP-225克隆編碼成熟TIMP-2肽。除了TIMP-2序列以夕卜，每個克隆還都含有在cDNA的3'末端摻入的6xHis標籤和終止密碼子。對於該實施例，亞克隆bTIMP-225克隆，用於重組TIMP-2生產。TIMP-2cDNA用作模板，以擴增585bp的TIMP-2片段(SEQ.ID.NO:1),該片段編碼成熟TIMP-2肽(195個胺基酸，SEQ.ID.NO:2)。為按讀框保持可信的TIMP-2翻譯，PCR產物設計成在蛋白的C-末端加入摻有His-標籤的pCRT7/CT-TOPO載體(SEQ.ID.NO:11)。正向引物的序列為5，-atgtgcagctgctccccg-3，(SEQ.ID.NO:7);反向引物的序歹寸為5，-cgggtcctcgatgtccagaaactc-3，(SEQ.ID.NO:8)。在"MASTERCYCLER"⑧牌梯度熱循環儀(Eppendorf,Westbury,NewYork)上用於PCR的循環條件為95°C,2分鐘，後接35輪的94。C，l分鐘；58°C,l分鐘；和72°C，1分鐘；最後的延伸於72°C進行10分鐘。使用"TOPOTA"牌克隆試劑盒(Invitrogen)按照生產商的說明將新鮮PCR產物克隆入pCRT7/CT-TOPO載體中。2.育性相關抗原(FAA)由精清純化出天然蛋白之後，首先通過反向高效液相層析(RP-HPLC)和微測序分析(McCauley等，1999)描述了FAA的化學特性。獲得完整蛋白的N-末端序列以及lys-C消化的FAA的兩個內部肽，並確定其與推斷的人DNA酶I樣蛋白(DNaselL3;Genbank登錄號U56814)的肽序列同源。使用DNaselL3的5'和3'區賴:設計的寡核苷酸產生由牛副性腺RNA轉錄的592bpPCR產物。分離出該PCR產物，並連接入pCR③2.1-TOPCf克隆載體(Invitrogen,Carlsbad,California)中，通過5，RACE(即5'互補DNA末端的快速擴增；參見Atow"Me,Ao^(2005),第2巻，629-630頁，該文獻通過引用結合到本文中)延伸。這導致鑑定出FAA的900bpcDNA(其描述於美國專利第6,891,029號)。起始密碼子在92bp的5'UTR之前，終止密碼子不在ORF中。因此，分離的cDNA序列代表部分FAAcDNA。使用SignalP3.0(生物序列分析中心，Lyngby,Denmark)檢驗預測的蛋白揭示，胺基酸殘基1-20代表信號肽(Bendtsen等，2004)。成熟肽序列由此在肽切割位點之後的bp153開始。將先前報告的天然FAA蛋白的胺基酸序列(McCauley等，1999)嵌入FAAcDNA的推斷蛋白序列中，由此驗證已克隆了對應於天然FAA的可信cDNA。用Blast檢索引擎(Altschul等，1990)進行序列分析揭示了與DNA酶I樣III(U56814)的763bp區段的同一性(88%),DNA酶I樣III為1079bp的cDNA，具有305個胺基酸的ORF(在切割信號肽之後為285個胺基酸)。一級蛋白結構使用保守區資料庫(ConservedDomainDatabase)(可通過美國國家生物#支術信息中心，Bethesda,Maryland獲得)和ExPASy(蛋白質專家分析系統(ExpertProteinAnalysisSystem))蛋白質組伺服器序列分析工具(可通過瑞士生物信息學研究所，Geneva,Switzerland獲得)分析。部分FAAcDNA(約全部的90%)編碼269個胺基酸的蛋白，該蛋白的估計分子量為30.8kDa(在切割信號肽後為28.7kDa)，預測的等電點(pl)為9.0(Wilkins等，1998)。這些預測與通過SDS-PAGE測定的為31kDa的天然FAA的表觀分子量和通過2-D電泳卩險測的石威性pi(McCauley等，1999)相一致。牛FAAcDNA克隆(參見美國專利第6,891,029號)用作模板，以通過PCR擴增新的重組核苷酸片段(603bp，SEQ.ID.NO:3)，該片段被用作生產rFAA的表達克隆。新設計的寡核苷酸正向引物5，-atggagaagctaaacggaaat-3，(SEQ.ID.NO:9)和反向引物5，-gctgacatccagggccttc-3，(SEQ.ID.NO:10)成功地擴增了FAA基因的603bp產物(DNA示於SEQ.ID.NO:3，編碼蛋白示於SEQ.ID.NO:4)。用於在mastercycler梯度熱循環儀(Eppendorf，Westbury,NY)上進行PCR的循環條件為94。C,2分鐘，接著94°C，1分鐘，35個循環；55°C，l分鐘；以及72。C，1分鐘；於72°C進行10分鐘的最終延伸。如上所述使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)按照生產商的推薦將新鮮的PCR產物直接克隆入pCRT7/CT-TOPO表達載體中。使用TOP10F，OneShot⑧化學感受態大腸桿菌(Invitrogen)轉化克隆的產物。轉化反應於冰上溫育(30分鐘)，並於42。C熱激30秒。在加入250|ulSOC介質後，將每個轉化反應置於37°C、200rpm的EnvironLab-line搖床(BarnsteadInternational,Dubuque,Iowa)中達1小時。將等份(50fil)的每種轉化物分布在預溫熱的、補加50fig/mL氨苄青黴素的選擇性LB平板(1.0%胰腖、0.5%酵母提取物、1.0%NaCl、1.5%瓊脂糖，pH7.0)中，並於37°C過夜溫育。然後選擇來自各個轉化的單細菌菌落，並接種入含氨千青黴素(50pg/mL)的LB培養基中，於37°C的振搖(225rpm)溫育箱中再溫育16小時。收穫細胞，通過小型製備方法(Qiagen小型製備離心柱；Qiagen，Valencia,Califomia)按照生產商的說明純化DNA。Re-PCR使用上述的相同寡核普酸引物進行，以證實在質粒DNA製備物中存在或不存在FAA插入片段。選擇陽性克隆，並在亞利桑那大學的DNA測序工作室測序(AppliedBiosystems373A自動化DNA測序儀，使用DyeDeoxyTM終止子化學)。PCR產物通過在含有溴化乙錠(EtBr;5jug/mL)的TBE緩衝液(90mMTris，90mM硼酸，2mMEDTA,pH8.3)中進行瓊脂糖凝膠(2。/。重量/體積)電泳來分析，並通過紫外線照射來顯現。在水平凝膠裝置(Bio-Rad)中以75V進行20分鐘的凝膠電泳，接著以100V進行，直至完成。100bp的PCRDNA梯(EZLoad100bpMolecularRuler,Bio-Rad)用作參比標準。分析凝膠圖像，並使用紫外燈箱和連接AlphaImager軟體(AlphaInnotechCorporation,SanLeandro,CA)的CCD照相機捕獲。用GCG軟4牛(10.0版,GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin.)和可由SanDiego超級計算機中心(SanDiego，California)在線獲得的BiologyWorkBench3.2版軟體進行核苷S吏序列分析和比較。3.rTIMP-2和rFAA的轉化和表達按照生產商的說明將rTIMP-2和rFAA構建體(10ng)單獨轉化入OneShotBL21(DE3)pLysS細胞(Invitrogen)中。將細胞與DNA混合，在冰上溫育30分鐘，於42。C熱激30秒。加入培養基(250piSOC)，並於37。C在振搖溫育箱(Innova4000,NewBrunswickScientificCo.Inc.,Edison,NewJersey)中溫育30分鐘。然後將溶液加入含有100昭/mL氨千青黴素和34|ug/mL氯黴素的10mLLB培養基中，將細胞於37°C振搖過夜培養。未用DNA(空載體)轉化的OneShotBL21(DE3)pLysS細胞用作蛋白表達研究的陰性對照。將過夜培養物接種入500mL至1L的含有氨千青黴素和氯黴素的LB培養基(1%胰腖、0.5%酵母提取物、1。/。NaCl)中並培養，直至它們達到約0.6的O.D.(約2-3小時)。以0.5mM終濃度加入IPTG(異丙基(3-D-硫代半乳糖苷)，以誘導rFAA或rTIMP-2的表達，培養物在振搖下於37°C再生長4小時。通過離心(3，000xg,20分鐘，4。C)收集細胞，儲存於-20。C,直至純化。進行初步實驗，以確定最佳蛋白表達的時程，並確定重組蛋白是表達為可溶性蛋白還是包涵體形式的不溶性物質。在用IPTG誘導後0、2和4小時收集0.5mL液體培養物的細菌細胞沉澱，並用0.5mL裂解緩衝液(50mMKPO4、400mMNaCl、100mMKCl、10%甘油、0.5。/。曲通X-100、10mM咪唑，pH7.8)提取。將樣品重懸浮在裂解緩沖液中，在幹水上冷凍，於42。C融化3次。通過以13,000xg離心1分鐘沉澱不可溶蛋白，用12%聚丙烯醯胺凝膠對溶解性和不溶性級分進行SDS-PAGE(Laemmli,1970)。將預染色的分子量標記(PrecisionPlus-牌雙色標準品，Bio-RadLabs,Hercules,California)力卩至1條泳道。進行平行凝膠電泳，1個凝膠用考馬斯藍(亮藍R-250)染色，另一個凝膠的蛋白轉移至硝酸纖維素膜(Trans-blot(0.2pm),Bio-Rad)，該膜用抗-His(C-末端)-HRP綴合抗體(Invitrogen,用含3%吐溫-20(PBS-T)的磷酸緩沖鹽水1:5000稀釋)探測。兩種重組蛋白的檢測基於存在摻入到表達蛋白的C-末端上的C-末端聚組氨酸標籤(His6-標籤)。(參見SEQ.ID.NO:11和12)。印跡的膜用PBS-T+5Q/。牛血清白蛋白(BSA)封閉，之後與抗體溫育。膜用PBS-T+1%BSA淋洗3次，印跡通過在HRP底物(TMB，Promega,Madison,Wisconsin)中溫育顯色。4.rTIMP-2和rFAA的純4b以每升培養物(12.5倍濃縮提取物)80mL變性提取緩衝液(8M尿素、50mMNaP04、300mMNaCl,pH7.0)裂解所收集的rTIMP-2或rFAA表達培養物的細菌細胞沉澱，並進行3次凍融循環，以確保如上所述的細胞完全破碎。通過以13,000xg離心澄清提取物，重組蛋白使用BDTalon-牌固定化金屬親和層析樹脂(BDBiosciences,MountainView,Califomia)按照生產商的說明純化。澄清的提取物與平衡的Talon樹脂混合(8mL濃縮提取物/mL樹脂)20分鐘，未吸附的物質通過離心去除，用變性提取緩衝液洗滌樹脂2次。通過向提取緩衝液加入250mM咪唑由樹脂洗脫重組蛋白。收集並合併3個床體積，之後取等份試樣進行電泳。重組蛋白的純度通過SDS-PAGE評價，蛋白的鑑定通過如本文所述的採用抗His抗體的蛋白質印跡來證實。5.復性(a)rT證-2:純化的rTIMP-2通過多步透析復性。對於rTIMP-2重摺疊，合併洗脫的級分，並在還原劑存在下透析(SnakeSkin透析管，10kDaMWCO,Pierce,Rockford,Illinois)，以防止在初始重摺疊過程中的二硫化物交聯。通過透析去除還原劑，加入碌u氧還試劑，以催化正確的二碌b4建形成，並用^f奮改的Novagen所述方法(EMDBiosciences,SanDiego:California)抑制非生產性二碌u化物中間體的形成。初始透析於25°C在50X體積的變性還原緩衝液(20mMTris-Cl、6M尿素、10mM卩-巰基乙醇(I3-ME)，pH8.5)中進行4小時。用新鮮的變性、還原緩衝液更換緩衝液，並於25°C繼續透析4小時。接著，將透析緩衝液換為非變性的還原緩沖液(20mMTris-Cl、10mM(3-ME，pH8.5)，於4°C進行至少4小時的透析。然後用20mMTris-Cl,pH8.5更換緩沖液，於4。C繼續透析至少4小時。然後，蛋白於4。C對25X體積的已冷卻的氧還重摺疊緩衝液過夜透析，所述緩沖液含有20mMTris-Cl、1mMGSH(還原的穀胱甘肽)、0.2mMGSSG(氧化的穀胱甘肽)，pH8.5。錯摺疊蛋白的不溶性聚集物通過離心去除，並澄清。重摺疊的蛋白於4°C對20mMTris-Cl，pH7.4透析3小時。可溶性蛋白通過超濾(iCON濃縮器，9kDaMWCO,Pierce)濃縮，通過蛋白測定(BCA測定，Pierce)定量。吸光度用光度適應計(Eppendorf,Westbury，NewYork)測定，使用在最後的透析緩沖液中製備的BSA標準品經非線性回歸多點校準曲線計算濃度。等分蛋白樣品，並儲存於-20。C。(b)rFAA:通過首先對50X體積的含有50mMNaP04、150mMNaCl、6M尿素、0.2ML-精氨酸，pH8.0的緩衝液(25。C)進行多步透析，逐漸地4吏純化的rFAA復性。4小時後，用含有50mMNaP04、150mMNaCl、4M尿素、0.2ML-精氨酸，pH8.0的緩沖液更換透析緩衝液，時間達4小時，之後對50mMNaP04、150mMNaCl、2M尿素、0.1ML-精氨酸，pH8.0過夜透析。通過在透析後離心去除錯摺疊蛋白的不可溶聚集物。通過超濾濃縮溶解性蛋白，並通過如上所述的蛋白測定定量。6.肝素誘導的獲能將純化的重組蛋白加入在獲能條件下溫育的精液樣品，以確定rTIMP-2和/或rFAA是否加強用肝素獲能後的頂體反應。在37。C水浴中將冷凍保存的精液融化15秒，用1mLTALP(tyrode氏白蛋白、乳酸鹽、丙酮酸鹽)介質(100mMNaCl、3.1mMKCl、25mMNaHC03、0.3mMNaH2PO4、21.6mM乳酸鈉、2mMCaCl2、0.4mMMgCl2、10mMHepes、1mM丙酮酸鹽、6mg/mLBSA、50嗎/mL慶大黴素，pH7.4)洗滌3次。如前所述(Parrish等，1988)，在肝素(IO昭/mL;來自豬'J、腸粘月莫的鈉鹽；ScientificProteinLaboratories,Waunakee,Wisconsin)存在下，將4頭公牛的洗滌過的精子與漸增濃度的純化的rTIMP-2或rFAA(O、6.25、12.5、25、50、100或200嗎/mL的TALP介質溶液)於38°C溫育4小時，以誘導獲能。將兩種重組蛋白以0、25或50pg/mL的濃度加入交叉劑量反應實驗，以檢驗重組體對獲能的加合或協同作用。來自用空載體轉化的細胞的細菌細胞裂解物(200嗎/mL)用作陰性對照。在4小時溫育後，加入100嗎/mL的融合劑溶血性磷脂醯膽鹼(LPC),以在先前獲能的精子中誘導頂體反應。將每個劑量反應測定中的1個樣品與單獨的肝素溫育4小時，不加入LPC，以確定自發頂體反應的發生率。在LPC處理後，離心精子，將沉澱重懸浮在PBS中，再通過離心沉澱精子。立即將精子在冷乙醇中固定20分鐘，用PBS淋洗，在預溫載玻片(Esco氟載玻片，ErieScientific,Portsmouth,NewHampshire)上風乾。於4°C將精子與5嗎/mL綴合螢光素的PSA(FITC-豌豆凝集素，VectorLabs,Burlingame，California)在黑暗中溫育30分鐘，以染色頂體內容物。用雙蒸H20淋洗載玻片，加入vectashield封片劑，覆蓋蓋玻片，並用指甲油密封。用配有400X放大率的Nomarski鏡片的Leica(LeitzDiaplan)落射焚光顯微鏡檢查載玻片的頂體反應。因在精子的頂體帽中的細胞具有螢光染色觀察到具有完整頂體的未反應精子，而頂體反應性精子由赤道帶的螢光染色模式或無頭部螢光指示。7.膜穩定性於38。C對來自25頭公牛的新鮮射精的純精液補加20分鐘的rTIMP-2和rFAA(各25昭/mL)(劑量基於上述的頂體反應劑量反應研究)或未誘導的細胞裂解物(陰性對照)。分析25頭公牛的一部分的復份射精液，以便評價總共65個射精液。奶牛和肉牛均示於數據集中。以一步卵黃檸檬酸鹽TRIS混合劑稀釋精液，並在水夾套中冷卻至5°C;包裝塑料細管，並在液氮罐中的架子上於靜態蒸汽中冷凍(60個塑料細管/架子)。以總計IO、20或25xl(^個精子/塑料細管包裝精液。融化塑料細管，精子於38。C溫育3小時。然後在配備Nomarski鏡片的NikonEclipse80i顯^t鏡上測定活動精子數和失去頂體膜的精子數。如上所述，對來自3頭公牛的按性別分揀的精子補加rTIMP-2和rFAA(各為0或25|ug/mL)，冷凍保存，融化，並溫育3小時。按照所述方式記錄活力(％)和完整頂體(％)。8.育性實驗為確定向用於人工授精的精液加入rTIMP-2和rFAA是否改善育性，在育性實驗中使用分步射精液。等分新鮮射精液，一半用rTIMP-2十rFAA(各25昭/mL)強化，餘下樣品不進行處理，以用作陰性對照。以恆定精子濃度(20x106個精子/塑料細管，使用標準技術)分批冷凍保存精子。質量控制標準證實用於實驗的精子在融化後表現出>50%的活力。5頭Holstein公牛用作精液供體。在兩個區域每頭公牛每次處理分配至少300次授精(總共1200次授精)，以便產生充足的統計效力，從而檢測對育性的治療效力。育性基於妊娠診斷計算，妊娠診斷在授精後約45-60天由畜群獸醫經直腸觸診進行。預期育性呈統計學顯著性增加。使用相同的重組物質進行另外的育性實驗。然而，在此第二個育性實驗中，要強化的樣品含有按性別分揀的精子，而不是純精液。在分離攜帶X染色體的精子和攜帶Y染色體的精子之後，向樣品加入上述形式的重組蛋白，精液以多種濃度的精子/塑料細管冷凍保存。9.統計學分析使用Excel和SAS/STAT軟體進行數據分析。使用成對的雙樣品T檢驗分析對照和重組體治療的精子在具有完整頂體膜的精子百分率(PIA)或活力方面的差異。通過ANOVA和FisherLSD4t驗分析獲能治療之間的差異。計算所有數據的最小二乘法平均值。顯著性水平設定為p<0.05。使用SAS中的CATMOD方法分析由計劃的育性實驗產生的分類育性數據(成功的授精對不成功的授精)，以使治療組之間不等授精數的有害效應最低。主要作用包括雄性、治療、精子濃度、批次(射精)和所有相互作用。參考書目Altschul,S.F.,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers和D丄Lipman.Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol"1990;215:403-410.Ax,R丄.,K.Dickson,R.W.Lenz.InductionofAcrosomeReactionsbyChondroitinSulfatesInVitroCorrespondstoNonreturnRatesofDairyBulls.J.DairySci.,1985;68:387-390.Ax,R丄.和R.W.Lenz.GlycosaminoglycansasProbestoMonitorDifferencesinFertilityofBulls.J,DairySci.,1987;70:1477-1486.Baumgart,E.，S.V.Lenk，S.A.Loening和K.Jung.Tissueinhibitorofmetalloproteinases1and2inhumanseminalplasmaandtheirassociationwithspermatozoa.Int.J.Androl"2002;25(6):369-371.Bellin,M.E.，H.E.Hawkins和R丄.Ax.Fertilityofrangebeefbullsgroupedaccordingtopresenceorabsenceofheparin-bindingproteinsinspermmembranesandseminalfluid.J.Anim.Sci.，1994;72:2441-2448.Bellin,M.E.,H.E.Hawkins,J.N.Oyarzo，R丄Vanderboom和R丄.Ax.Monoclonalantibodydetectionofheparin-bindingproteinsonspermcorrespondstoincreasedfertilityofbulls.J.Anim.Sci.,1996;74:173-182.Bellin,M.E.，J.N.Oyarzo,H.E.Hawkins,H.M.Zhang,R.G.Smith,D.W.Forrest,LR.Sprott和R丄.Ax.Fertilityassociatedantigenonbullspermindicatesfertilitypotential.J.Anim.Sci.，1998;76:2032-2039.Bendtsen,J.D.，H.Nielsen,G.vonHeijne和S.Brunak.Improvedpredictionofsignalpeptides:SignalP3.0.J.Mol.Biol"2004;340:783-795.Blom,N.,S,Gammeltoft和S.Brunak.Sequence-andstructure-basedpredictionofeukaryoticproteinphosphorylationsites.J.Mol.Biol.,1999;294:1351-1362.Boone，T.C.,MJ.Johnson,Y.A.DeClerck和K.E.Langley.cDNAcloningandexpressionofametalloproteinaseinhibitorrelatedtotissueinhibitorofmetalloproteinases.Proc.Natl.Acad.Sci"1990;87:2800-2804.Brew,K.，D.Dinakarpandian禾口H.Nagase.Tissueinhibitorsofmetalloproteinase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-乳酸鹽-丙酮酸鹽介質(TALP)。24.權利要求22的試劑盒，其中在精液儲存介質中的FAA的量在約5嗎/mL至約200pig/mL的範圍內，在精液儲存介質中的TIMP-2的量在約5嗎/mL至約200}ig/mL的範圍內。25.權利要求22的試劑盒，其中在精液儲存介質中的FAA的量在約5嗎/mL至約100嗎/mL的範圍內，在精液儲存介質中的TIMP-2的量在約5叱/mL至約100昭/mL的範圍內。26.權利要求22的試劑盒，其中在精液儲存介質中的FAA的量在約10嗎/mL至約50!ig/mL的範圍內，在精液儲存介質中的TIMP-2的量在約10[ig/mL至約50昭/mL的範圍內。27.權利要求22的試劑盒，其中在精液儲存物中的FAA的量為約25昭/mL，在精液儲存介質中的TIMP-2的量為約25嗎/mL。28.權利要求21的試劑盒，其中所述FAA和所述TIMP-2為重組蛋白質。全文摘要描述了一種用於增強精子的活力和/或頂體完整率(PIA)的物質組合物。所述組合物包括組合的一定量的FAA和一定量的TIMP-2，其中所述量有效增強與所述組合物接觸的活力、PIA或者活力和PIA。所述組合物可以用作冷凍保存精子的介質。文檔編號C07K14/47GK101400700SQ200780009128公開日2009年4月1日申請日期2007年1月19日優先權日2006年1月19日發明者H·張,R·L·阿克斯,T·C·麥考利申請人:Tmi實驗室國際有限公司