內源性的非編碼小RNAs及其應用的製作方法

2023-04-25 19:18:46

專利名稱：內源性的非編碼小RNAs及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥工程領域，涉及一種內源性的非編碼小RNAs及其應用，具體涉及一種微小RNA(micix)RNA，miRNA)及其前體序列和它們在製備預防和/或治療惡性腫瘤疾病的試劑盒中的應用。
背景技術：
當前惡性腫瘤是全世界死亡率較高的疾病，且惡性腫瘤的發病 率逐年增加，嚴重威脅著人類的健康。第三次全國死因調查結果表明，我國城鄉居民惡性腫瘤死亡率屬於世界較高水平，而且呈持續的增長趨勢，惡性腫瘤已成為我國城市居民首位死因(25%)。近年來有關腫瘤發病機理及腫瘤防治的研究取得很大進展，但在全球範圍內，惡性腫瘤的防治仍是當今生命科學研究領域的一個難點。細胞凋亡在腫瘤發病機制中發揮重要作用，腫瘤細胞凋亡的抑制與腫瘤的發生發展具有密切的關係。許多參與凋亡調控的基因在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，這些基因可以作為腫瘤診斷及治療的作用靶點。因此，尋找腫瘤細胞中新的參與凋亡的蛋白因子、miRNA等及闡明其在腫瘤細胞凋亡中的作用機理具有極其重要的應用價值。microRNA(miRNA)是一類長度在22nt左右的內源非編碼小RNA，廣泛存在於動物、植物、病毒等多種有機體中。它主要通過與靶基因的3' UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控機體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動，預測超過1/3的人類基因都是保守的miRNA靶基因。實驗證據表明，miRNA可通過調控其靶標基因參與的信號通路，影響腫瘤的發生和發展，發揮著類似於癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的發現為腫瘤發病機制的研究提供了新的思路，為腫瘤診斷和治療提供了新的策略。隨著科技的發展和腫瘤細胞信號傳導途經研究的不斷深入，以生物靶分子為基礎的腫瘤生物治療成為研究抗腫瘤藥物的熱點。腫瘤的生物療法以分子生物學、細胞生物學和分析免疫學為基礎，與手術放療化療三大常規療法作用相互補充，大幅提高腫瘤的治療療效。將生物技術與放療化療結合起來，引入促凋亡的分子可以逆轉腫瘤細胞產生的耐藥性，增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，從而避免了傳統的放療化療方法引起的耐藥性和毒副作用的缺點，達到治療腫瘤的效果。本領域迫切需要了解促腫瘤細胞凋亡相關的因子，將其作為藥物治療的靶分子應用於臨床的治療中，因此尋找與促腫瘤細胞凋亡相關的因子與放療化療結合治療腫瘤疾病，具有廣闊的前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的具有促腫瘤細胞凋亡功能的微小RNA即miR-644，該miRNA為生物體內一段內源的miRNA，具有促進腫瘤細胞凋亡的功能，在腫瘤細胞模型和裸鼠荷瘤模型的實驗中均增強了阿黴素對腫瘤細胞的治療效果。針對上述技術目的，本發明的技術方案如下一方面，本發明提供一種微小RNA在製備用於預防、治療和/或預後評估惡性腫瘤的藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為miR-644及其前體序列。優選地，所述miRNA-644的序列為包含下述SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'。優選地，所述miRNA-644前體的序列為包含下述SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體5' -UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGAA
腳UGCUC腳A⑶UUUCUUAUA⑶⑶GGCUUUCUUAGAGCAAAGAUGGUUCCCUA-3'。優選地，所述miRNA-644的序列進行了硫代修飾、甲氧修飾或膽固醇修飾。優選地，所述miRNA-644或其前體的序列通過轉入已知表達載體構建含有miRNA-644或其前體序列的表達載體，並將構建的含有miRNA-644或其前體序列的表達載體轉入病毒表達獲得。優選地，所述已知表達載體為pSilencer Adeno CMV1. O穿梭載體(pSilencerAdeno CMVl.Oshuttle vector),所述病毒為腺病毒。另一方面，本發明提供了一種用於預防和/或治療惡性腫瘤的藥物組合物，其包含治療有效量的上述miR-644及其前體序列和藥學上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5' -A⑶⑶GGCUUUCUUAGAGC-3'。優選地，所述藥學上可接受的載體或輔料選自質粒表達載體、病毒、殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒等。優選地，所述藥物組合物的給藥方式為口服給藥或注射給藥；更優選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、直接腫瘤瘤內注射等。又一方面，本發明還提供了一種用於預後評估惡性腫瘤的試劑盒，所述試劑盒包含用於特異性檢測上述miR-644的探針或引物。優選地，所述試劑盒中包含的探針或引物具有下述SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列5' -GCTCTAAGAAAGCCACACT-3'。綜上所述，本發明人通過大量的實驗證明，miRNA-644 (5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3')通過誘導腫瘤細胞凋亡提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，在腫瘤預防、治療及預後評估中具有重要的應用價值。經化療藥物阿黴素處理，腫瘤細胞中miRNA-644表達顯著上調，miRNA-644的上調可能參與了腫瘤細胞凋亡的發生。腫瘤細胞中過表達miRNA-644可以誘導腫瘤細胞凋亡的發生。將miRNA-644與適當的載體結合形成藥物，導入腫瘤部位或體內，對惡性腫瘤患者將具有預防及治療作用。發明人通過構建能夠過表達miRNA-644的腺病毒感染胃腺癌SGC-7901細胞系及宮頸癌Hela細胞系，發現miRNA-644可以誘導兩種腫瘤細胞系凋亡，在細胞水平證明了 miRNA-644通過誘導腫瘤細胞凋亡而達到治療腫瘤的潛在作用。通過miRNA-644反義寡核苷酸抑制miRNA-644的表達，可以抑制阿黴素誘導的腫瘤細胞凋亡。裸鼠皮下接種腫瘤細胞，接種部位同時注射miRNA-644模擬物，可顯著抑制裸鼠皮下腫瘤生長。在整體動物水平也證明了 miRNA-644的潛在預防、治療作用。腫瘤細胞中過表達miRNA-644，使用較低劑量的阿黴素即可誘導腫瘤細胞凋亡，提高了腫瘤細胞對藥物的敏感性，在腫瘤治療中可以克服化療藥物的毒副作用及耐藥性的形成。因此，本發明提供了將miRNA-644及其前體與適當載體或輔料如真核基因表達載體、腺病毒、殼聚糖、膽固醇、脂質體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過口服、靜脈注射、肌肉注射、或直接腫瘤部位注射的方式，用於預防和/或治療惡性腫瘤。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為阿黴素處理誘導腫瘤細胞凋亡過程中miRNA-644表達水平的變化的實驗結果示意圖；其中圖IA為SGC-7901腫瘤細胞中miRNA-644表達水平實驗結果示意圖；圖IB為Hela腫瘤細胞中miRNA-644表達水平實驗結果示意圖；圖2為miRNA-644過表達腺病毒構建載體後轉入病毒後miRNA-644表達的實驗結果示意圖；其中圖2A為含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMVI. O穿梭載體的示意圖；圖2B為PCR驗證獲得含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMV1. O穿梭載體的陽性克隆的電泳圖，圖中1為DNA標記(DNA Marker)，2為擴增獲得6 1Obp的miRNA-644片段；圖2(為miRNA-644腺病毒感染SGC-7901腫瘤細胞miRNA-644表達水平檢測實驗結果示意圖；圖2D為miRNA-644腺病毒感染Hela腫瘤細胞miRNA-644表達水平檢測實驗結果示意圖；圖3為通過腺病毒過表達miRNA-644可以誘導腫瘤細胞凋亡的實驗結果示意圖；其中圖3A為SGC-7901腫瘤細胞凋亡的實驗結果示意圖；圖3B為Hela腫瘤細胞中凋亡的實驗結果不意圖；圖4為通過轉染人工合成的miRNA-644模擬物過表達miRNA-644可以誘導腫瘤細胞凋亡的實驗結果示意圖；其中圖4A、4B為SGC-7901腫瘤細胞及Hela腫瘤細胞轉染miRNA-644模擬物24小時後，實時螢光定量PCR方法檢測miR-644表達水平的結果示意圖；圖4C、4D為SGC-7901及Hela腫瘤細胞轉染miRNA-644模擬物後腫瘤細胞凋亡的實驗結果示意圖；圖5為裸鼠皮下接種腫瘤部位注射miRNA模擬物腫塊形成的生長曲線；圖6為通過miRNA-644反義寡核苷酸抑制腫瘤細胞中miRNA-644表達，腫瘤細胞對阿黴素誘導的凋亡敏感性增強的實驗結果示意圖，其中圖6A為Hela細胞轉染miRNA-644反義寡核苷酸後，miRNA-644的表達情況的實驗結果示意圖；圖6B為抑制內源性miRNA-644後，低劑量阿黴素作用下Hela細胞的凋亡情況的實驗結果示意圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。實施例1阿黴素處理誘導腫瘤細胞凋亡過稈中miRNA-644表汰水平的變化該實驗分別用2uM阿黴素處理SGC-7901及Hela腫瘤細胞(均購自於中科院上海細胞庫)3h，6h，12h，24h後收集細胞，用Trizol提取總RNA，採用實時螢光定量PCR的方法對miR-644的表達水平進行檢測，觀察在阿黴素處理腫瘤細胞的過程中miR-644的表達變化。如圖I所示，隨著阿黴素處理SGC-7901及Hela腫瘤細胞時間的增加，miR-644的表達水平在兩種腫瘤細胞中均呈現明顯上升的趨勢。實施例2miRNA_644腺病毒的構律米用Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV載體系統構建miRNA-644過表達載體或腺病毒。按照公司說明書構建相應載體及腺病毒。以大鼠基因組為模板，PCR擴增miRNA-644及其上下遊兩端各將近300個bp的序列，擴增得到片斷約600bp(SEQ ID NO :2，如下所示)，擴增引物如下F5/ -CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTG-3' (SEQ ID NO :7);R5/ -GGTAATGATGTGGTGTAAGTCCTG-3' (SEQ ID NO :8)。·擴增片段序列如下CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTGGAGTGTTTTATCATGAAAGTGTATTAAATTTTGTAAAATCCTTTTTTGGTATCAATTGAGATGATCATGTGATTTTTTTCCCCCCCTCATTCTGTTAATGTGGTATATTATGTTGATTTTTCATAGGTTGAACCTTTTTTGCATTCCAGGAATAAATCCTACTTAGTCAAAAGGATTAAAGTGTGCTTTTAATATGCTGCTGAGATTTTTTTGCTGATTTTTTTTTAGTATTTTTCCATCAGTGTTCATAAGGAATGTTGCTCTGTAGTTTTCTTATAGTGTGGCTTTCTTAGAGCAAAGATGGTTCCCTATTACTTTCTAATTTTATACTTCTACACATTAACAACTTTTATATTTAAAGCAGAAACTGGAAA
ATCAGGCCAATTTGGTATTAATGAAATTACAGAGGTAATTTAGATATGGGAATAAATTACCGATAATATTATTCTATCATTCATTTTAGTTACAATAAGTTTGGGTGCATATAATAGAAAACACTAAAATAATAGTGGTTTATGTAAGATAGAAGTGTATTTGTCCCCATTATTTAAAAATAGTCCAGCAGGACTTACACCACATCATTACC擴增獲得的片斷克隆入T載體，亞克隆入pSilencer Adeno CMV1.0穿梭載體(pSilencer Adeno CMVl.Oshuttle vector),獲得含 miRNA-644 的載體(如圖 2A)。通過PCR及測序驗證獲得含miRNA-644載體的克隆，PCR結果見圖2B。Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)，共轉染HEK-293細胞(購自於美國ATCC)，包裝腺病毒，擴增收集病毒，測定病毒滴度。實時定量PCR(Real-time PCR)鑑定miRNA-644的表達。miRNA-644 突變體病毒構建將 miR_644pSilencer Adeno CMV1. O 穿梭載體通過基因定點突變的方法突變miRNA-644序列的四個鹼基(通過QuikChange定點突變試劑盒(Stratagene公司)進行基因定點突變，具體方法參照試劑盒說明操作)，突變引物如下，突變的喊基劃橫線標出5' ~GCTCTGTAGTTTTCTTATAGTTGACCTTTCTTAGAGCAAAGATGG~3/ (SEQ ID NO 5)5' ~CCATCTTTGCTCTAAGAAAGGTCAACTATAAGAAAACTACAGAGC~3/ (SEQ ID NO :6)。得到突變後的miR_644pSilencer Adeno CMVL O穿梭載體按照上述相同的方法構建miRNA-644突變體腺病毒。病毒均溶於無血清培養基，-80°C儲存備用。將miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及Hela腫瘤細胞，24小時後，收集細胞，提取RNA，Real-time PCR檢測miRNA-644表達水平，結果顯示感染miRNA-644腺病毒的細胞miRNA-644表達量明顯升高，而感染miRNA-644突變體病毒的細胞miRNA-644表達沒有變化，(如圖2C，2D)。實施例3腺病毒i寸表汰miRNA-644可以誘導腫瘤細朐凋亡將miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及HeIa腫瘤細胞，腺病毒感染12、24、36、48小時後，通過原位末端缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡情況。如圖3所示，過表達miRNA-644後SGC-7901及Hela腫瘤細胞隨著時間的延長均有細胞凋亡發生。實施例4miRNA-644樽擬物i寸表汰miRNA-644可以誘導腫瘤細朐凋亡·將SGC-7901及Hela腫瘤細胞轉染人工合成的miRNA-644模擬物(模擬物於上海吉瑪公司合成，為2'-甲氧修飾的寡核苷酸序列，其序列為SEQ ID N0:1)，轉染後12、24、48小時,通過原位末端缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡情況。如圖4所示，過表達miRNA-644後SGC-7901及Hela腫瘤細胞隨著時間的延長均有細胞凋亡發生。實施例5裸鼠皮下接種腫瘤部位注射miRNA模擬物腫塊形成生長曲線培養Hela腫瘤細胞，胰酶消化收集細胞，接種I X IO7細胞於無胸腺的BALB/c裸鼠(購自於北京維通利華動物動物實驗有限公司)背部皮下。接種細胞3天後，於接種部位注射miRNA-644模擬物(與實施例4中的miRNA-644模擬物同)(模擬物於上海吉瑪公司合成)，注射miRNA模擬物陰性對照作為對照組。每組6隻BALB/c裸鼠進行實驗，接種腫瘤細胞後每隔3天測量瘤塊的大小，連續觀察4周，按公式長X寬2/2計算腫塊體積，繪製腫瘤生長曲線，觀察miR-644在裸鼠水平上對腫瘤形成的影響。如圖5所示，注射miRNA-644的裸鼠腫瘤生長較對照組慢，成瘤體積較小。實施例6腫瘤細胞中過表汰miRNA-644,腫瘤細胞對阿黴素誘導的凋亡敏感件增強SGC-7901及Hela腫瘤細胞感染miRNA-644腺病毒及其突變體病毒，感染24小時後，使用低劑量的阿黴素(O. 2μΜ)處理細胞，24小時後通過原位末端缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡情況。如圖6所示，使用低劑量的阿黴素(O. 2 μ Μ)處理SGC-7901及Hela腫瘤細胞，腫瘤細胞凋亡不太明顯。過表達miRNA-644後，則用此劑量的阿黴素可以明顯促進腫瘤細胞凋亡的發生，也就是過表達miRNA-644可以增加阿黴素誘導的腫瘤細胞凋亡的敏感性。
權利要求
1.一種人源rniRNA-644及其前體在製備用於診斷、預防、治療和/或預後評估惡性腫瘤的藥物組合物或試劑盒中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述miRNA-644為包含下述SEQID NO I所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'。
3.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述miRNA-644前體的序列為包含下述SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體5' -UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGA AU⑶UGCUC腳 A⑶UUUCUUAUA⑶⑶GGCUUUCUUAGAGCAA AGAUG⑶UCCCUA-3,。
4.根據權利要求I至3任一項所述的用途，其特徵在於，所述miRNA-644的序列進行了硫代修飾、甲氧修飾或膽固醇修飾。
5.根據權利要求I至4任一項所述的用途，其特徵在於，所述miRNA-644或其前體通過轉入已知表達載體構建含有miRNA-644或其前體的表達載體，並將構建的含有miRNA-644或其前體的表達載體轉入病毒表達獲得。
6.根據權利要求5所述的用途,其特徵在於,所述已知表達載體為pSilencerAdenoCMV1. O穿梭載體，所述病毒為腺病毒。
7.一種用於預防和/或治療惡性腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的人源miRNA-644及其前體和藥學上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'； 優選地，所述藥學上可接受的病毒、載體或輔料均選自腺病毒、慢病毒、質粒表達載體、殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒。
8.一種用於診斷和/或預後評估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包含用於特異性檢測人源miRNA-644的探針或引物。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中包含的探針或引物具有下述SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列.5' -GCTCTAAGAAAGCCACACT-3'。
全文摘要
本發明提供一種微小RNA即miR-644及其前體序列在診斷、預防、治療和/或預後評估惡性腫瘤中的用途。本發明提供的微小RNA為包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′，所述微小RNA的前體為包含SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體。該微小RNA可以作為一種新型的藥物組合物用於惡性腫瘤的預防和/或治療，此外，該微小RNA還可以作為一種新的生物標誌物應用於惡性腫瘤的診斷和/或預後評估。
文檔編號A61K48/00GK102978278SQ201110263730
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者李培峰, 王建勳, 李倩 申請人:中國科學院動物研究所