一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法

2023-04-25 19:31:26 2

一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法，其為：肝素鈉粗品經純化水溶解後採用2次氯化鈉鹽解﹑過氧化叔丁醇氧化﹑異丙醇沉澱可以有效的去除肝素鈉原料中的硫酸皮膚素和硫酸軟骨素。本發明通過明確過氧化叔丁醇氧化劑的加入量、氧化溫度和時間，同時明確肝素鈉粗品﹑純化水和異丙醇之間的投料比去除肝素鈉粗品中的硫酸皮膚素和硫酸軟骨素。在本公司內部成功實現肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量控制在0.1%以下的目標，在硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量控制上實現了質的突破，該方法具有工藝路線短﹑反應條件溫和、操作簡便、成本低、效果好的優點，適於肝素鈉原料工業化生產的方法。
【專利說明】一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的 方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，涉及是一種在肝素鈉原料生產過程中降低硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素的方法。

【背景技術】
[0002] 肝素鈉 （ifeparin Sodium)又可稱為肝素，是含有硫酸基的粘多糖類天然抗凝血物 質，屬於不均一的多糖分子，分子量平均在1. 5萬左右，肝素鈉可加強抗凝血酶III (AT- III) 滅活絲氨酸蛋白酶，從而具有阻止凝血酶形成，對抗凝血酶和阻止血小板聚集等多種作用。 每毫升血液抗凝需要肝素鈉12. 5-17. 5IU。我國是全球肝素鈉粗品和肝素鈉原料藥的主要 生產國，也是全球最大的肝素鈉原料藥出口國，擁有美國FDA認證或歐盟CEP認證標準的肝 素原料藥已呈現供不應求的局面。
[0003] 肝素鈉原料來源於肝素鈉粗品，含有大量雜質蛋白、雜質核酸、微生物等雜質，需 經過物理和化學提取分離過程，定向獲取天然結構基團完整的肝素鈉，從而製成肝素鈉原 料藥。隨著用藥安全標準的不斷提高，客戶對肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的雜 質含量要求也越來越高。肝素鈉粗品經過檢測普遍都含有較高含量的硫酸皮膚素和硫酸 軟骨素，中國藥典2010規定硫酸皮膚素的含量< 5. 0%，歐洲藥典8. 0規定硫酸皮膚素和 硫酸軟骨素總含量< 2. 0%，美國藥典最新版藥典USP35-NF30規定這2個雜質的總含量為 < 1.0%,目前國內的肝素鈉生產企業肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素這2個雜質的 含量基本管控在2. 0%左右。
[0004] 目前有2篇已公開的關於降低肝素鈉中硫酸皮膚素的含量的專利，分別為專利 CN103044577和CN103694373,2013年公開的專利CN103044577提到用純化水將肝素鈉粗 品溶解，然後經過三次30%的過氧化氫氧化，三次乙醇沉澱得到低含量硫酸皮膚素的肝素 鈉。2014年公開的專利CN103694373是在專利CN103044577基礎上進行升級的，此專利先 對純化水溶解後的肝素鈉粗品進行鹽解-酶解，在這一步去掉肝素鈉粗品中90%的硫酸皮 膚素，然後同樣經過三次乙醇沉澱，三次30%的過氧化氫氧化，然後再加入低溫丙酮進行沉 澱，控制有機溶劑的沉澱溫度和沉澱時間，從而去除肝素鈉原料中的硫酸皮膚素的含量，專 利CN103694373報導的工藝路線過長，多達十四五步，操作較繁瑣，需要反覆的升溫降溫， 且去除硫酸皮膚素的效果一般，只能達到< 2. 0%，且這2篇專利只提到去除肝素鈉中的硫 酸皮膚素，而沒有涉及到怎樣去除其中的硫酸軟骨素。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是為了降低肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的問題， 提供更優質的肝素鈉原料，在將肝素鈉粗品製備成肝素鈉原料的工藝過程中，採用2次氯 化鈉鹽解、過氧化叔丁醇反應、異丙醇沉澱可以有效的去除肝素鈉原料中的硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素。本發明通過在製備肝素鈉原料過程中明確過氧化叔丁醇氧的加入量、反應 溫度和時間，同時明確肝素鈉粗品、純化水和異丙醇之間的投料比去除肝素鈉粗品中的硫 酸皮膚素和硫酸軟骨素，達到控制硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的目的。該方法具有工 藝路線短、反應條件溫和、操作簡便、成本低、效果好的優點，適於肝素鈉原料工業化生產。
[0006] 本發明的目的可以通過以下措施達到： 一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法，其包括如下步驟： (1) 取含有雜質硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的肝素鈉粗品用純化水溶解成水溶液，升溫 至55-65°C，加入氯化鈉和異丙醇，在此溫度下攪拌後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清 液，得到第一次鹽解後的肝素鈉粗品； (2) 向第一次鹽解後的肝素鈉粗品中再次加入純化水，升溫至55-65°C，加入氯化鈉和 異丙醇，在此溫度下攪拌後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到第二次鹽解後的肝 素鈉粗品； (3) 用純化水溶解第二次鹽解後的肝素鈉粗品，並將其升溫至75-80°C，加入過氧化叔 丁醇氫氧化鈉水溶液，調節反應液pH值至9. 0-11. 5,維持此溫度進行反應，反應結束後降 溫至20-25 °C,反應液用娃藻土過濾； (4) 收集濾液升溫至55-65°C，加入異丙醇，在此溫度攪拌後，再用超聲儀中進行超聲， 後降溫至5-KTC，在此溫度下靜置或離心除去上清液，得到除去了硫酸皮膚素和硫酸軟骨 素的肝素鈉。
[0007] 本發明中，對肝素鈉中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的測定方法是按照歐洲藥 典8.0中肝素鈉有關物質法檢測。本發明中的肝素鈉粗品的抗II a效價彡90USP U/mg，其 中雜質硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總質量含量在20. 0-30. 0%之間。
[0008] 在步驟（1)中，肝素鈉粗品和純化水的投料比（W/W)為1. 0 :4. 5-5. 5,優選1. 0 : 4. 8-5. 2 〇
[0009] 在步驟（1)中，肝素鈉粗品水溶液升溫至55-65°C，優選55-60°C，並向其中加入氯 化鈉和異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°c靜置或離心除去上清液，得到第 一次鹽解後的肝素鈉粗品。其中肝素鈉粗品和氯化鈉的投料比（W/W)為100 :9. 0-11. 0,加 入的異丙醇和步驟（1)中純化水的投料比（V/V)為1. 8-2. 5 :1. 0,優選為2. 0-2. 3 :1. 0。
[0010] 在步驟（2)中，加入純化水和步驟（1)中肝素鈉粗品的投料比（W/W)為3. 0-4. 0 : 1. 0,優選1. 0 :3. 5-3. 8 ;肝素鈉粗品水溶液同樣升溫至55-65°C，優選55-60°C，並向其中加 入氯化鈉和異丙醇，肝素鈉粗品和氯化鈉的投料比（W/W)為100 :9. 0-11. 0,加入的異丙醇 和步驟（1)中純化水的投料比（V/V)為1. 8-2. 5 :1. 0,優選2. 0-2. 3 :1. 0。在55-65°C下攪 拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到第二次鹽解後的肝素鈉粗品。
[0011] 步驟（3)中，用來溶解第二次鹽解後的肝素鈉粗品的純化水和步驟（1)中肝素鈉 粗品的投料比（W/W)為1. 0 :3. 0-4. 0,優選1. 0 :3. 5-3. 8,用來反應的過氧化叔丁醇和步驟 (1)中肝素鈉粗品的投料比（W/W)為3. 0-5. 0 :100,優選3. 0-4. 0 :100。過氧化叔丁醇氫氧 化鈉水溶液中過氧化叔丁醇的濃度為0. 2-0. 6kg/L,優選0. 3-0. 52 kg/L。過氧化叔丁醇不 溶於水中，但易溶於氫氧化鈉水溶液中，故本法將過氧化叔丁醇溶在氫氧化鈉得到配製好 的過氧化叔丁醇氫氧化鈉水溶液再加到反應液中，用來溶解過氧化叔丁醇的氫氧化鈉水溶 液濃度為〇· 5_2mol/L，優選lmol/L。
[0012] 步驟（3)中，本發明採用過氧化叔丁醇來進行反應，同時該氧化劑反應後生成的副 產物在水溶液中去除簡潔、有效且不產生額外的操作步驟。本法所得副產物不溶於肝素鈉 且溶於水，並且沸點低，在最後樣品烘乾時更容易去除且不會在肝素鈉中產生較大的殘留。 過氧化叔丁醇不易溶於水但易溶於鹼液，本法採用其在鹼性水溶液中進行反應，不會對反 應帶來不利的影響。
[0013] 步驟（3)中，反應液的pH值被調節至9. 0-11. 5,優選10. 0-11.0,用濃度為lmol/ L氫氧化鈉或lmol/L鹽酸來調節此pH值。反應結束後反應液被降溫至20-25°C，降溫時間 > 40min,過濾前板框安裝上濾布，用娃藻土和純化水混合塗在過濾布上，用來過濾降溫後 的反應液。
[0014] 在步驟（4)中，本發明採用異丙醇而非乙醇進行沉。由於過氧化叔丁醇反應後生 成叔丁醇，叔丁醇的極性為4. 0左右，本發明需要用來去除生成的叔丁醇且易通過沉澱去 除肝素鈉中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的2個雜質的溶液的極性在4. 0-4. 3間，同樣要求此 溶劑沸點要低，在最終肝素鈉產品烘乾時易去除，基於上述理由我們選定了異丙醇，其極性 大於丙酮極性，理論上沉澱肝素鈉效果比丙酮好，且沸點為82. 45°C (正常1個大氣壓下)， 雖然其沸點高於乙醇，但是其和叔丁醇溶解性大於乙醇和叔丁醇溶解性，這樣更容易出除 生成的叔丁醇，實驗發現採用本發明中的異丙醇具有更優的效果。
[0015] 在步驟（4)中，收集硅藻土過濾後的濾液並升溫至55-65°C，緩慢向其中加入異丙 醇進行沉澱，異丙醇和步驟（1)中所加入的純化水的投料比為（V/V)為1. 8-2. 5 :1. 0,優選 為2. 0-2. 3 :1. 0 ;在55-65°C攪拌0. 5-1. 5h，後將此溶液放入超聲儀中超聲20-30min，然後 緩慢降溫至5-KTC，降溫時間彡lh，在5-KTC靜置或離心除去上清液，得到除去硫酸皮膚 素和硫酸軟骨素的肝素鈉，取樣測試此經過處理後的硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量。
[0016] 目前特定的肝素鈉產品在硫酸皮膚素和硫酸軟骨素方面具有其總含量< 0. 5%的 要求，發明人對此進行專門的工藝研究，成功解決了這一難題，使其可達到< 〇. 1%，在硫酸 皮膚素和硫酸軟骨素總含量控制上實現了質的突破。本發明是在現有的技術上針對肝素鈉 粗品中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量過高的問題，採取不同於現有的技術，另闢蹊徑採 用氯化鈉鹽解，通過2次氯化鈉鹽解得到去除肝素鈉粗品中30%左右硫酸皮膚素和硫酸軟 骨素，後用有機氧化劑進行氧化，和異丙醇進行沉澱，在此過程中除去大部分的硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素，克服現有的肝素鈉原料中的硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量超標的問題， 實驗證明在保證肝素鈉原料其它質量的前提下，可以有效的去除掉肝素鈉中的硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素，在本公司內部成功實現肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量控制 在0. 1%以下的目標，在硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量控制上實現了質的突破。本工藝具 有路線短、反應條件溫和、操作簡便、成本低、效果好的優點，是適於肝素鈉原料工業化生 產的方法。

【具體實施方式】
[0017] 實施例1 : 取批號：50121128批肝素鈉粗品測試此批樣品抗II a效價為96USP U/mg，硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素總含量為25. 6%，同時稱取此批肝素鈉粗品5kg加入到22. 5L純化水中，攪拌 使固體全部溶解，然後轉移至搪瓷玻璃罐內並升溫至55-65°C，加入0. 45kg氯化鈉和40. 5L 異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到第一次 鹽解後的肝素鈉粗品。再向其中加入15L純化水，再將液體升溫至55-65°C，加入0. 45kg 氯化鈉和40. 5L異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清 液，得到第二次鹽解後的肝素鈉粗品。再加入15L純化水，再將液體升溫至75-80°C，稱取 0. 15kg過氧化叔丁醇溶在0. 75L 0. 5mol/L氫氧化鈉水溶液中，攪拌溶解後加入搪瓷玻璃 罐內，測試此時反應液的pH值為10. 6,在此溫度下攪拌反應35-50min，然後通入冷凝水降 溫至20-25°C，反應液採用硅藻土過濾，收集過濾後的濾液並升溫至55-65°C，緩慢向其中 加入40. 5L異丙醇，在此溫度攪拌lh，後並放入超聲儀中超聲20-30min，然後緩慢降溫至 5-KTC，降溫時間> lh，在5-KTC靜置或離心除去上清液，然後過濾得到除去硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素的肝素鈉3. 54kg，取樣測試其抗II a效價為118USP U/mg，硫酸皮膚素和硫 酸軟骨素總含量為〇. 072%。
[0018] 實施例二： 取批號：50121129批肝素鈉粗品測試此批樣品抗II a效價為105USP U/mg，硫酸皮膚 素和硫酸軟骨素總含量為28. 9%，同時稱取此批肝素鈉粗品5. 2kg加入到28. 6L純化水中， 攪拌使固體全部溶解，然後轉移至搪瓷玻璃罐內並升溫至55-65°C，加入0. 572kg氯化鈉 和71. 5L異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到 第一次鹽解後的肝素鈉粗品。再向其中加入20. 8L純化水，再將液體升溫至55-65°C，力口 入0. 572kg氯化鈉和71. 5L異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離 心除去上清液，得到第二次鹽解後的肝素鈉粗品。再加入20. 8L純化水，再將液體升溫至 75-80°C，稱取0. 26kg過氧化叔丁醇溶在0. 5L lmol/L氫氧化鈉水溶液中，攪拌溶解後加入 搪瓷玻璃罐內，測試此時反應液的pH值為10. 8,在此溫度下攪拌反應35-50min，然後通入 冷凝水降溫至20-25°C，反應液採用硅藻土過濾，收集過濾後的濾液並升溫至55-65°C，緩 慢向其中加入71. 5L異丙醇，在此溫度攪拌lh，後放入超聲儀中超聲20-30min，然後緩慢降 溫至5-KTC，降溫時間> lh，在5-10°C靜置或離心除去上清液，然後過濾得到除去硫酸皮 膚素和硫酸軟骨素的肝素鈉3. 385kg，取樣測試其抗II a效價為134USP U/mg，硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素總含量為〇. 082%。
[0019] 實施例三： 取批號：50121130批肝素鈉粗品測試此批樣品抗II a效價為98USP U/mg，硫酸皮膚 素和硫酸軟骨素總含量為22. 8%，同時稱取此批肝素鈉粗品4. 7kg加入到23. 5L純化水中， 攪拌使固體全部溶解，然後轉移至搪瓷玻璃罐內並升溫至55-65°C，加入0. 47kg氯化鈉 和47L異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到第 一次鹽解後的肝素鈉粗品。再向其中加入15. 45L純化水，再將液體升溫至55-65°C，加入 0. 47kg氯化鈉和47L異丙醇，在此溫度下攪拌1-1. 5h，後降溫至15-20°C靜置或離心除去上 清液，得到第二次鹽解後的肝素鈉粗品。再加入15. 45L純化水，再將液體升溫至75-80°C， 稱取0. 188kg過氧化叔丁醇溶在0. 313L 2mol/L氫氧化鈉水溶液中，攪拌溶解後加入搪瓷 玻璃罐內，測試此時反應液的pH值為10. 2,在此溫度下攪拌反應35-50min，然後通入冷凝 水降溫至20-25°C，反應液採用硅藻土過濾，收集過濾後的濾液並升溫至55-65°C，緩慢向 其中加入47L異丙醇，在此溫度攪拌lh，後放入超聲儀中超聲20-30min，然後緩慢降溫至 5-KTC，降溫時間> lh，在5-KTC靜置或離心除去上清液，然後過濾得到除去硫酸皮膚素 和硫酸軟骨素的肝素鈉3. 40kg，取樣測試其抗II a效價為116USP U/mg，硫酸皮膚素和硫 酸軟骨素總含量為0. 085%。
【權利要求】
1. 一種控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法，其特徵在於包括如 下步驟： (1) 取含有雜質硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的肝素鈉粗品用純化水溶解成水溶液，升溫 至55-65°C，加入氯化鈉和異丙醇，在此溫度下攪拌後降溫至15-20°c靜置或離心除去上清 液，得到第一次鹽解後的肝素鈉粗品； (2) 向第一次鹽解後的肝素鈉粗品中再次加入純化水，升溫至55-65°C，加入氯化鈉和 異丙醇，在此溫度下攪拌後降溫至15-20°C靜置或離心除去上清液，得到第二次鹽解後的肝 素鈉粗品； (3) 用純化水溶解第二次鹽解後的肝素鈉粗品，並將其升溫至75-80°C，加入過氧化叔 丁醇氫氧化鈉水溶液，調節反應液pH值至9. 0-11. 5,維持此溫度進行反應，反應結束後降 溫至20-25°C,反應液用娃藻土過濾； (4) 收集濾液升溫至55-65°C，加入異丙醇，在此溫度攪拌後，再用超聲儀進行超聲，後 降溫至5-KTC，在此溫度下靜置或離心除去上清液，得到除去了硫酸皮膚素和硫酸軟骨素 的肝素鈉。
2. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（1)中，所述肝素鈉粗品的抗II a效價彡90USP U/mg，其中雜質硫酸皮膚 素和硫酸軟骨素總質量含量在20. 0-30. 0%之間。
3. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方 法，其特徵在於在步驟（1)中，肝素鈉粗品和純化水的質量投料比為1. 0 :4. 5-5. 5 ;該步驟 中肝素鈉粗品和氯化鈉的質量投料比為100 :9. 0-11.0,異丙醇與純化水的體積投料比為 1. 8-2. 5 ： 1. 0 〇
4. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（2)中，向第一次鹽解後的肝素鈉粗品中再次加入純化水，加入純化水和步 驟（1)中肝素鈉粗品的質量投料比為1. 〇 :3. 0-4. 0 ;該步驟中肝素鈉粗品和氯化鈉的質量 投料比為100 :9. 0-11. 0,加入的異丙醇和步驟（1)中純化水的體積投料比為1. 8-2. 5 :1. 0。
5. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（3)中，用來溶解第二次鹽解後的肝素鈉粗品的純化水和步驟（1)中肝素 鈉粗品的質量投料比為1. 〇 :3. 0-4. 0 ;所述過氧化叔丁醇氫氧化鈉水溶液中，過氧化叔丁 醇的濃度為〇. 2-0. 6kg/L ;氫氧化鈉的濃度為0. 5-2mol/L。
6. 根據權利要求5所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（3)中，所述過氧化叔丁醇氫氧化鈉水溶液中過氧化叔丁醇與步驟（1)中 肝素鈉粗品的質量投料比為3. 0-5. 0 :100,氫氧化鈉的濃度為lmol/L。
7. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（3)中，被用來調節反應液pH值的為lmol/L鹽酸或lmol/L氫氧化鈉；調 節反應液pH值後的反應時間為35-50min。
8. 根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（4)中，異丙醇和步驟（1)中所加入的純化水的體積投料比為1.8-2. 5 : 1. 0 ;該步驟中加入異丙醇後攪拌0. 5-1. 5h再超聲20-30min，然後緩慢降溫至5-10°C，降溫 時間> lh。
9.根據權利要求1所述的控制肝素鈉原料中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素總含量的方法， 其特徵在於步驟（4)中，得到的肝素鈉中硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的總質量含量< 0. 1%。
【文檔編號】C08B37/10GK104193847SQ201410396942
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】唐詠群, 黃錫偉, 段豔冰, 婁媛媛, 劉玉輝 申請人:南京健友生化製藥股份有限公司