採用重組微生物的聚乳酸的製造方法
2023-04-25 14:53:41 1
專利名稱：採用重組微生物的聚乳酸的製造方法
技術領域：
本發明涉及使用重組微生物的聚乳酸的製造方法。
背景技術：
從地球環境問題的觀點來看，作為自然界中容易被分解的生物降解性塑料，以及作為可以由糖或植物油等可再生的碳資源合成的「綠色」塑料，生物來源的聚酯備受關注。 這其中，聚乳酸，由於成本較為低廉，融點也具有170°C以上這樣充分的耐熱性，可以熔融成型，因此可以期待其是實用上優良的生物降解性聚合物。然而，以往，如特開2004-204464中所示，經過中和微生物生產的乳酸，並進行純化的工序，在形成二聚物的環狀化合物(丙交酯(Iactide))之後聚合，從而生產聚乳酸，因此存在成本增高的問題。迄今為止，報導了許多具有以糖作為碳源來生產聚酯能力的微生物(非專利文獻 1)。微生物生產的生物降解性塑料的代表例是以3-羥基丁酸(3HB)作為單體的聚-3-羥基丁酸(polyhydoroxybutylatelHB)。PHB是具有熔解溫度為180°C左右的熱可塑性高分子，除了生物降解性之外，它還具有熔融加工性優異這樣的優點。另一方面，由於PHB的結晶性高，因而又硬又脆，即存在耐衝擊性差這種物性上的問題。作為解決PHB物性上問題的一種方法，人們在開發使用微生物製造由3HB與其它羥基鏈烷酸構成的共聚酯的方法。例如，專利文獻1中公開了由3HB與3-羥基吉草酸(3HV)構成的共聚物的製造方法。而且，專利文獻2中公開了通過使甲基桿菌屬(MethylcAacterium sp.)、副球菌屬 (Paracoccus sp.)、產鹼菌屬(Alcaligenes sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的微生物與碳原子數為3至7的伯醇接觸，生產3HB與3HV的共聚物的方法。經確認，這種3HB和3HV的共聚物與PHB相比，富有柔軟性，而且共聚酯中3HV含有率如果增加，柔軟性就提高。在使用上述微生物的3HB和3HV的共聚物的製造法中，例如在前述專利文獻1中，通過在培養基中添加丙酸，以及在專利文獻3中，通過在培養基中添加丙烷-1-醇，從而控制共聚酯中3HV的含有率。3HB和3-羥基已酸(以下，簡稱為3HH)這兩種成分的共聚酯P (3HB-CO-3HH)及其製造方法也分別記載於例如專利文獻4和專利文獻5中。這些公報的P(3HB-co-3HH)共聚物的製造方法採用從土壤中分離的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸或橄欖油等油脂，發酵生產。而且，還有克隆該豚鼠氣單胞菌的PHA合酶基因，將該基因導入到富氧產鹼菌(Alcaligenes eutrophus)中，使用這種重組菌株，以脂肪酸作為碳源，生產 P(3HB-co-3HH)的報導(專利文獻6)。此外，上述的共聚酯的使用微生物的製造法中，無論何種情況下，都需要使用作為具有直接合成聚合物活性的酶蛋白質的多羥基鏈烷酸合成酶，但人們也在嘗試改變這種合成酶，調節單體單元的摩爾分率。例如，專利文獻7公開了通過改變被鑑定為假單胞菌屬 (Pseudomonas sp. )61-3的微生物的多羥基鏈烷酸合成酶的胺基酸序列，生產3HB含有率高的PHB的變異酶。另一方面，人們期待以3-羥基鏈烷酸以外的成分作為單體單元的共聚酯具有與上述共聚酯不同的物性。專利文獻8公開了，作為這種含有3-羥基鏈烷酸以外的單體單元的共聚酯的例子，在培養基中添加乳酸，並同時培養整合了編碼丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙醯CoA轉移酶的核酸的富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha、舊名富氧產鹼菌(Alcaligenes eutrophus))，製造由3HB和乳酸(LA)構成的共聚酯的方法。而且，同篇文獻中還公開了通過在培養基中添加乳酸和癸烯酸，同時培養整合了編碼丙酸梭菌來源的丙醯CoA轉移酶的核酸和編碼假單胞菌屬61-3來源的多羥基鏈烷酸合成酶的核酸的大腸桿菌，製造由3-羥基己酸酯、3-羥基辛酸酯、3-羥基癸酸酯和乳酸構成的共聚物的方法。以上是以3-羥基鏈烷酸作為單體單元的共聚酯、以3-羥基鏈烷酸以外的成分作為單體單元的共聚酯，以及使用微生物的它們的製造方法。但是，沒有關於以糖作為原料，通過微生物發酵，有效生產聚乳酸的方法的報導。非專利文獻1 《生物降解性塑料手冊》、生物降解性塑料研究會編、1995年、第 178-197頁、(株)工3 歹4一 工ζ發行)專利文獻1 特開昭57-150393號公報專利文獻2 特開平5-74492號公報專利文獻3 特公平7-79705號公報專利文獻4 特開平5-93049號公報專利文獻5 特開平7165065號公報專利文獻6 特開平10-108682號公報專利文獻7 國際公開公報W02003/100055專利文獻8 國際公開公報W02006/U679
發明內容
本發明的目的在於提供通過以糖作為原料的微生物發酵來有效生產聚乳酸的方法。本發明人發現，導入了編碼前述專利文獻7中所述的多羥基鏈烷酸合成酶的變異體的核酸的重組微生物能夠有效地由糖直接製造聚乳酸，從而完成了下述各發明。(1)聚乳酸的製造方法，包括在含有碳源的培養基中培養重組微生物的工序1)， 和從工序1)的培養物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質，和由下述的a)或b)的胺基酸序列構成的對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列，b)在a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個胺基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。(2)根據(1)中所述的製造方法，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號4所示的胺基酸序列、或序列號4所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。(3)根據(1)中所述的製造方法，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號6所示的胺基酸序列、或序列號6所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。(4)根據(1)中所述的製造方法，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位和第481位的胺基酸分別被取代為其它胺基酸的胺基酸序列。(5)根據(1)中所述的製造方法，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln被取代為Lys的胺基酸序列。(6)根據(1)中所述的製造方法，前述蛋白質都是由導入到微生物中的重組表達載體編碼的蛋白質。(7)重組微生物，具有對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質，和由下述的a)或b)的胺基酸序列構成的對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列b)在a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個胺基酸被缺失或取代，或者還插入了 1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。(8)根據(7)中所述的重組微生物，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號4所示的胺基酸序列、或序列號4所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。(9)根據(7)中所述的重組微生物，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號6所示的胺基酸序列、或序列號6所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。(10)根據(7)中所述的重組微生物，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位和第481位的胺基酸分別被取代為其它胺基酸的胺基酸序列。(11)根據(7)中所述的重組微生物，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481 位的Gln被取代為Lys的胺基酸序列。(12)根據(7)中所述的重組微生物，其特徵在於導入了具有編碼前述蛋白質的基因的重組表達載體。本說明書包括作為本申請的優先權基礎的日本專利申請號2008-276185號的說明書和/或附圖中記載的內容。本發明的製造方法能夠以便宜的碳源作為原料，有效地製造聚乳酸，可以降低生物降解性塑料的製造成本。
[圖1]是表示重組質粒pTV118NPCTCl(ST/QK)的構成的概要圖。圖中phaCl (ST/QK)表示STQK基因，PCT表示埃氏巨球形菌(Melsdenii)來源的PCT基因，Pre表示富養羅爾斯通氏菌(R. eutropha)來源的啟動子，Plac表示大腸桿菌乳糖操縱子啟動子。[圖2]實施例中製備的聚合物的分子量分布曲線。[圖3A]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因和phaCl(ST/QK)基因的重組質粒PTV118NPCTC1 (ST/QK)製備的聚合物的GC/MS分析結果的表圖。[圖3B]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因和phaCl(WT)基因的重組質粒pTV118NPCTCl (WT)製備的聚合物的GC/MS分析結果的表圖。[圖3C]是表示使用PLA標準品(MW20000)製備的聚合物的GC/MS分析結果的表圖。[圖3D]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因或丙酸梭菌來源的PCT基因和phaCl (ST/QK)基因的重組質粒pTV118NPCTCl (ST/QK)製備的聚合物的GC/MS分析結果的表圖。[圖4]是表示實施例中製備的聚合物的1H-NMR光譜分析結果的表圖。[圖5]是表示重組質粒pTV118NPCTCl(WT)構成的概要圖。圖中，phaCl (WT)表示假單胞菌sp. 61-3來源的多羥基鏈烷酸合成酶基因(野生型)，PCT表示埃氏巨球形菌來源的PCT基因，PRe表示富氧產鹼菌來源的啟動子，Plac表示乳糖操縱子啟動子。[圖6]是經時表示由於PCT基因的差異導致的乳醯基CoA產量的差異的圖。[圖7]是表示埃氏巨球形菌來源的PCT基因與丙酸梭菌來源的PCT基因的聚乳酸生產性的比較的圖。
具體實施例方式本發明是聚乳酸的製造方法，包括在含有碳源的培養基中培養重組微生物的工序1)，和從工序1)的培養物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質，和由下述的a)或b)的胺基酸序列構成的對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列，b)在a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個胺基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。以下，就本發明中使用的蛋白質、重組微生物、和本發明的製造方法的各個條件進行說明。1)對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質本發明中使用的「對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質」，是具有催化CoA由適當的CoA底物轉移到丙酸和/或LA上的反應的活性的蛋白質。具有這種活性的蛋白質一般被稱為丙醯CoA轉移酶(PropionylCoA "TransferashPCT)。以下，本發明中，將該蛋白質表示為PCT。表1中示出了迄今為止已報導的PCT來源的(微生物名)的代表例以及編碼它們的鹼基序列信息的文獻信息。[表1]
權利要求
1.聚乳酸的製造方法，包括在含有碳源的培養基中培養重組微生物的工序1)，和從工序1)的培養物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質，和由下述的a)或b)的胺基酸序列構成的對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列，b)在a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個胺基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的製造方法，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號4所示的胺基酸序列，或序列號4所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。
3.根據權利要求1所述的製造方法，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號6所示的胺基酸序列，或序列號6所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。
4.根據權利要求1所述的製造方法，對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位和第481位的胺基酸分別被取代為其它胺基酸的胺基酸序列。
5.根據權利要求1所述的製造方法，對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln 被取代為Lys的胺基酸序列。
6.根據權利要求1所述的製造方法，所述蛋白質都是由導入到微生物的重組表達載體所編碼的蛋白質。
7.重組微生物，具有對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質，和由下述的a)或b)的胺基酸序列構成的對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列，b)在a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個胺基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。
8.根據權利要求7所述的重組微生物，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號4所示的胺基酸序列，或序列號4所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。
9.根據權利要求7所述的重組微生物，所述對CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號6所示的胺基酸序列，或序列號6所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個胺基酸的胺基酸序列。
10.根據權利要求7所述的重組微生物，對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位和第481位的胺基酸分別被取代為其它胺基酸的胺基酸序列。
11.根據權利要求7所述的重組微生物，對多羥基鏈烷酸的合成反應進行催化的蛋白質的胺基酸序列是序列號2所示的胺基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln被取代為Lys的胺基酸序列。
12.根據權利要求7所述的重組微生物，其特徵在於，導入了具有編碼所述蛋白質的基因的重組表達載體。
全文摘要
本發明的目的在於提供通過以糖作為原料的微生物發酵來有效生產聚乳酸的方法。聚乳酸的製造方法，包括在含有碳源的培養基中培養具有催化CoA轉移到丙酸和/或乳酸的反應的蛋白質、和下述的a)或b)的胺基酸序列構成的催化多羥基鏈烷酸的合成反應的蛋白質的重組微生物的工序1)a)序列號2所示的胺基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的胺基酸中的至少1個以上被取代為其它胺基酸的胺基酸序列b)a)中規定的蛋白質中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個胺基酸被缺失或取代，或者還插入了1個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列，和從工序1)的培養物中回收前述聚乳酸的工序2)。
文檔編號C12P7/62GK102197140SQ200980142438
公開日2011年9月21日 申請日期2009年10月27日 優先權日2008年10月27日
發明者伊藤正和, 小畑充生, 嶋村隆, 幸田勝典, 田口精一, 神戶浩美 申請人:豐田自動車株式會社, 國立大學法人北海道大學