與抗白粉病相關的蛋白TaWRKY2及其編碼基因的製作方法

2023-04-25 12:45:21

專利名稱：與抗白粉病相關的蛋白TaWRKY2及其編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與抗白粉病相關的蛋白TaWRKY2及其編碼基因。
背景技術：
小麥白粉病(Powdery mildew)是由專性寄生真菌禾布氏白粉菌Bgt (Blumeriagraminis f sp. tritici)引起的ー種真菌性病害,屬世界性分布的病害,嚴重影響了世界小麥的產量。近年來，由於作物種植密度的增高，氮肥施用量的増大，以及作物種植的単一，使小麥白粉病造成的危害日益嚴重。小麥受害後，可導致葉片早枯，光合作用降低，呼吸作用加強，分櫱數減少，成穗率降低，幹粒重下降，一般可減產5% 10%，重病田減產達20%以上。由於小麥白粉病菌具有群體大、適應範圍廣、生理小種眾多.且變異速度快.使得許多有效抗病基因喪失抗性。目前育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防 治手段，多年來，且頗見成效，但抗性喪失一直是未能解決的問題，抗源多樣化是實現抗病性持久的有效途徑。為此通過生物學的方法克隆新的抗病基因，利用轉基因的方法提高小麥對白粉病的抗性是今後防治白粉病的有效策略之一。

發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種與白粉病抗性相關的蛋白及其編碼基因。本發明所提供的蛋白，名稱為TaWRKY2，來源於普通小麥京411，是如下a)或b)的蛋白質a)由SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)將SEQ ID NO : I所示的胺基酸序列經過ー個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關的由a)衍生的蛋白質。所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。所述引物對中的一條引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述引物對中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述蛋白或上述任一所述蛋白編碼基因在調節植物對白粉病的抗性中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述應用中，所述白粉病為大麥白粉病或小麥白粉病；所述植物為大麥或小麥。上述任一所述應用中，所述大麥白粉病由大麥白粉病菌弓I起的,所述小麥白粉病由小麥白粉病菌引起的。上述任一所述應用中，所述大麥白粉病菌為大麥白粉菌生理小種Kl (AvrMlal,virMla6, virMlal2, virMlg)或大麥白粉病菌生理小種 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2,AvrMlg);所述小麥白粉病菌為小麥白粉病菌15號生理小種E09 ；上述任一所述應用中，所述大麥為大麥品種POl (含Mlal);所述小麥為小麥品種揚麥158 (不含Pm21)。
實驗證明，本發明基因對小麥或大麥的抗白粉病性能是進行負調控的。本發明基因在小麥育種方面將有廣闊的應用前景，在保證小麥高產穩產方面具有重要的意義。


圖I為小麥TaWRKY2蛋白亞細胞定位。圖2為抗病感病細胞圖示。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、TaWRKY2的獲得I、候選EST與基因全長cDNA的電子延伸以大麥HvWRKY I為種子序列，搜索小麥EST資料庫(http: / / co即bio, dfci.harvard. edu/tRi/cRi-bin/tRi)中的EST序列,保存高度同源的EST序列,將搜到的序列進行拼接組裝成重疊群(contig),在預測的開放閱讀框(Open reading frame, 0RF)タト,設計特異性引物；引物序列如下TaffRKY2 :F2 5，> ATGGAGGAGCAGTGGATGAT > 3，(SEQ ID NO :3)R2 5，> TCAAGCAACAGGGATCCGAC > 3』 (SEQ ID NO :4)2、小麥TaWRKY2基因的cDNA的克隆挑選大小一致小麥品種豫麥66 (高抗白粉病)、京411 (高感白粉病)各40粒種子，播種於苗缽中，長至第一片葉完全展開時(大約一周左右時間)，利用北京地區流行的小麥白粉病菌15號生理小種(E09菌株)對小麥材料進行高密度接菌處理，在接菌後O、I、
2、3、12、24小時，收集小麥葉片，用於總RNA的提取。利用Trizol法提取小麥總RNA，以總RNA 為模板，米用 Invitrogen 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase 合成 cDNA 第一鏈，以合成的第一鏈為模板，用上述的引物對F2/R2進行RT-PCR擴增，擴增產物進行測序。對京411的擴增產物的測序結果表明得到cDNA為SEQ ID NO 2所示的基因，將該基因命名為TaWRKY2，其編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO :1所示。實施例2、小麥TaWRKY2的分子特性及作用機制研究轉錄因子的特徵之ー是定位於細胞核中，並在細胞核中執行其轉錄調控功能。為此，利用基因槍介導的方法在小麥葉片細胞中對小麥TaWRKY2蛋白的亞細胞定位進行了研究。結果表明，與大麥HvWRKY2相同，小麥TaWRKY2也定位於細胞核中(圖I)。圖I中，CFP (青色螢光蛋白)、CFP-HvWRKY2 (CFP在HvWRKY2的N端、TaWRKY2_YFP (黃色螢光蛋白在TaffRKY2 的 C 端)、Overlay 重疊。
實施例3、TaffRKY2在大麥和小麥抗白粉病中的功能研究I、TaWRKY2在大麥抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2對大麥小種專化抗性的影響載體pGY_l 在文獻「Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654」中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。載體p35S_GUS 在文獻「Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654」中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。大麥品種POl (含 Mlal)在文獻「 Shen Q H et al. , Recognition Specificityand RARiVSiafl Dependence m Barley Mla Disease Resistance Genes to the PowaeryMildew Fungus. 2003,15 :732_744」中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。大麥白粉病菌生理小種Kl(AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)在文獻「Shen QHet al. , Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732-744，，中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。p D0NR201 購自 Invitrogen 公司；pUbi_GW 購自 Invitrogen 公司。BP 反應試劑及LR反應試劑均購自Invitrogen公司。載體pUbi_TaWRKY2的構建及鑑定方法設計擴增TaWRKY2全長的引物，上遊引物的前端加上attBl，下遊引物加上 attB2F :5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATGAT3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。以人工合成的SEQ ID NO 2所示基因為模板，進行PCR擴增；擴增產物進行回收，回收後產物和PD0NR201進行BP反應生成ENTRY載體。PCR 產物(40ng/ul) 3. 5ulBP重組酶混合物 0. 5ulp D0NR201(100ng/ul) Iul25°C,3hr。酶切鑑定陽性克隆，陽性克性即為ENTRY載體。ENTRY載體再和p Ubi-Gff進行LR反應。體系如下ENTRY 載體(100ng/ul) IulLR重組酶混合物0. 5ulp Ubi-Gff(100ng/ul) IulTE (PH = 8. 0)2ul25°C,3hr。酶切鑑定陽性克隆，陽性克性即為pUbi_TaWRKY2。將陽性克隆進行測序驗證，測序驗證結果測得pUbi-TaWRKY2中含有SEQ ID NO 2所示基因序列。用於後續實驗。載體pUbi_HvWRKY2的構建及鑑定方法用如下引物對F/R，以人工合成的Genebank號為AJ853838的序列為模板，進行PCR擴增，得到HvWRKY2基因。按照上述方法得到重組載體pUb i-HvffRKY2。F 5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATG3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。轉化方法基因槍介導的方法大麥種子經保溼吹芽種植後，待長至一周左右，剪下第一片葉，葉面朝上，放置於含有培養基(1%的瓊脂，80mg/L苯丙咪唑，其餘為水)的培養皿上，恢復3小時，進行基因槍轟擊；將目的質粒pUbi-TaWRKY2和質粒p35S_GUS按I : I體積充分混合，包裹在直徑為Ium金粉微粒上，採用roS-1000/He (美國Bio-Rad)轟擊靶材料，基因槍轟擊參數為阻擋網與轟擊材料之間的距離為5. 5cm，可裂膜壓カ為llOOPa，每槍金粉-DNA用量為42/0. 2lug。

接大麥白粉菌生理小種Kl (AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)的方法基因槍轟擊完畢後，將大麥葉片放入培養箱中恢復培養4小時(培養條件20°C 16h光照/18°C 8h黑暗)，4小時後進行接菌，將孢子抖落在大麥葉片上，保證I個孢子/mm2，培養40小時(培養條件20°C 16h，光照/18°C 8h，黑暗)，進行⑶S染色，37°C過夜染色完畢後進行脫色，兩天後利用顯微鏡進行細胞觀察。統計表達⑶S的細胞中感病細胞的比例來計算吸器指數，根據吸器指數來判斷基因TaWRKY2的功能。吸器指數與抗病性的關係吸器指數小於20%為高抗，大於60%為高感、30%-60%之間為(包括30%和60%)中抗或中感。抗病細胞的判斷標準細胞內表達GUS，且細胞內不含有吸器，而細胞表面附著有分生孢子的細胞為抗病細胞(圖2A)。感病細胞的判斷標準細胞內表達GUS，且細胞內含有吸器的細胞為感病細胞(圖2B)。吸器指數的計算公式吸器指數=感病細胞的個數パ抗病細胞的個數+感病細胞的個數)X 100%。以轉入pGY-1和p35S-GUS的大麥葉片作為空對照，以轉入pUbi_HvWRKY2和載體P35S-GUS的大麥葉片作為陽性對照。實驗設3次重複，結果取平均數。結果表明，轉入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的大麥葉片的吸器指數為55. 69 % ;轉入pGY-1和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數為17. 58% ;轉入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數為58. 65%。結果顯示，在大麥葉片中過表達TaWRKY2後，吸器指數明顯上升，說明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麥的小種專化抗性中有負調控作用。(2) TaffRKY2對大麥本底抗性的影響大麥白粉病菌生理小種A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)在文獻「Shen QH et al. Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732_744」中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。方法與實驗(I)中所述基本相同，不同的是接種的致病菌為大麥白粉病菌生理小種 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)。
實驗設3次重複，結果取平均數。結果表明，轉入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的大麥葉片的吸器指數為81.40% ;轉入pGY-1和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數為54. 60 % ;轉入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數為81. 45%。結果顯示，在大麥葉片中過表達TaWRKY2後，吸器指數明顯上升，說明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麥的本底抗性中有負調控作用。2. TaffRKY2在小麥抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2對小麥本底抗性的影響小麥品種揚麥158(不含 Pm2I)在文獻「LIUP et al. Transfer ofdisease resistance oi Triticum aes11tpvum-HaynaIaia villosa DゾS/6AI J trans丄ocationlines in diferent wheat background. Journal of Naming AgriculturalUniversity. 2004,27(2) :1 5」中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。小麥白粉病菌15號生理小種(菌株E09)在文獻「Hu T Z et al. Identificationand Molecular Mapping Gene in Wheat Cultivar yu mai 66 of the Powdery MildewResistance. ACTA AGRONOMICA SINICA 2008,34(4) :545_55」中公開過，公眾可從中國科學
院遺傳與發育生物學研究所獲得。方法與實驗I中⑴所述基本相同，不同的是接種的致病菌為小麥白粉病菌15號生理小種(菌株E09)，轉化的是小麥品種揚麥158(不含Pm21)的葉片。實驗設3次重複，結果取平均數結果表明，轉入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的小麥葉片的吸器指數為80. 36% ;轉入pGY-1和p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數為54. 60% ;轉入pUbi_HvWRKY2和p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數為81. 45%。結果顯示，在小麥葉片中過表達TaWRKY2後，吸器指數明顯上升，說明TaWRKY2在小麥的本底抗性中起負調控作用。(2) TaffRKY2對小麥廣譜抗性的影響小麥品種小麥一簇毛麥易位系6VS/6AL(含Pm21)在文獻「CaoAZ et al. Cloningand Analysis of an Hv-OxOLP bene induced by Ergsiphe gramims in H. villosa.Journal of Triticeae Crops. 2006, 26 (5) :27 32」中公開過,公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。方法與實驗⑴中所述基本相同，不同的是所用的小麥品種是小麥品種小麥ー簇毛麥易位系6VS/6AL(含Pm21)。實驗設3次重複，結果取平均數。結果表明，轉入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的小麥葉片的吸器指數為12. 57% ;轉入pGY-1和載體p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數為13. 60% ;轉入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數為12. 62%。結果顯示，小麥葉片中過表達TaWRKY2後，吸器指數幾乎不變，說明Pm21介導的廣譜抗性不依賴於TaWRKY2。說明TaWRKY2的功能在廣譜抗性中沒有作用，可能在小種專化抗性中起作用。
權利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質 a)由SEQID NO 1所示的胺基酸序列組成的蛋白質； b)將SEQID NO :I所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關的由a)衍生的蛋白質。
2.權利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
5.根據權利要求4所述的引物對，其特徵在於所述引物對中的一條引物序列如SEQID NO 3所示，所述引物對中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。
6.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒。
7.權利要求I所述蛋白或權利要求2或3中所述編碼基因在調節植物對白粉病的抗性中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述白粉病為大麥白粉病或小麥白粉病；所述植物為大麥或小麥。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特徵在於所述大麥白粉病由大麥白粉病菌引起的，所述小麥白粉病由小麥白粉病菌弓I起的。
全文摘要
本發明公開了與抗白粉病相關的蛋白TaWRKY2及其編碼基因。該蛋白質是如下a)或b)的蛋白質a)由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)將SEQ IDNO1所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關的由a)衍生的蛋白質。實驗證明，實驗證明，本發明基因對小麥或大麥的抗白粉病性能是進行負調控的。本發明基因在小麥育種方面將有廣闊的應用前景，在保證小麥高產穩產方面具有重要的意義。
文檔編號C12N7/01GK102649811SQ20111004497
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月24日 優先權日2011年2月24日
發明者劉敏, 沈前華, 王秋韞, 韓新運 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所