表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因vp243的dna疫苗及其構建方法和應用的製作方法

2023-05-11 04:07:31

專利名稱：表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因vp243的dna疫苗及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA疫苗及其構建方法和應用，特別涉及一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其構建方法和應用。本發明屬於生物醫藥領域。
背景技術：
傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)主要侵害雛雞法氏囊等中樞免疫器官，導致以淋巴細胞衰竭為特徵的免疫抑制性疾病。IBDV是雙鏈、雙節段RNA病毒，屬於雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，其基因組由A、B兩個節段組成，B節段(約2. 8kb)編碼VPl蛋白，為RNA依賴的RNA聚合酶。A節段(約3. 3kb)具有兩個相互部分重疊的開放閱讀框(ORF)，ORFl編碼分子量約為IlOkDa的前體融合蛋白(VP243)，前體融合蛋白經過加工，成熟後變為VP2、VP3和VP4。0RF2編碼VP5蛋白，也稱非結構蛋白。目前，預防IBD主要使用弱毒苗和滅活苗，隨著IBDV變異株和超強毒株的出現，經常導致免疫失敗。重組亞單位疫苗和活載體疫苗表達的VP2蛋白雖然能在不同程度上誘導中和抗體，但仍未能解決IBDV抗原變異問題。DNA疫苗的出現，開拓了 IBD疫苗研究的新紀元。DNA疫苗能同時誘導體液免疫和細胞免疫，對不同血清亞型毒株具有交叉保護，還具有嵌合免疫、多重免疫及聯合免疫等優點。本研究首次將IBDV多聚蛋白基因VP243進行了密碼子優化，克隆入真核表達載體pCAGGS中，構建了 IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243，並對其免疫原性進行了研究。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其構建方法和應用。為了達到以上目的，本發明採用的技術手段為
本發明的一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特徵在於所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。在本發明中，優選的，所述的DNA疫苗是通過將SEQ ID NO. I所示的序列克隆入pCAGGS表達載體中得到的。進一步的，本發明還提供了一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的構建方法，其特徵在於包括以下步驟(I)根據雞偏嗜密碼子將IBDV VP243基因進行密碼子優化，優化後的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在優化後的基因兩端分別設計酶切位點，合成基因；(2)將合成的基因克隆到PUC19載體中，構建得到pUC19-optiVP243重組質粒；(3)將pUC19_optiVP243重組質粒進行酶切，獲得optiVP243基因；(4)將optiVP243基因克隆到用同樣酶酶切後的pCAGGS表達載體中，構建得到pCAGoptiVP243重組表達質粒，即為所述的DNA疫苗。
在本發明的一個具體實施例中，步驟(I)中所述的酶切位點為EcoRI、ClaI。
在本發明中，更優選的，所述的構建方法還包括對所述重組表達質粒 pCAGoptiVP243進行提取純化。
更進一步的，本發明還提供了所述的DNA疫苗在製備治療或預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
與傳統疫苗相比，本發明的DNA疫苗既擁有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又具有隻有弱毒疫苗或重組疫苗才有的同時誘導體液免疫和細胞免疫應答的特點。


圖I為重組質粒pCAGoptiVP243 PCR和酶切鑑定；
M:DLlkb Marker; I :pCAGoptiVP243 PCR鑑定；2:pCAGoptiVP243 EcoRl/Clal 雙酶切結果
圖2為質粒轉染DF-I細胞48h後間接免疫螢光檢測；A:重組質粒pCAGoptiVP243轉染孔；B:空載體pCAGGS轉染孔；C:正常細胞對照
圖3為質粒轉染DF-I細胞48h後Western blot檢測；
I:重組質粒pCAGoptiVP243轉染孔；2:空載體pCAGGS轉染孑L ;M:Proteinmolecular marker
圖4為IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243免疫後雞體內抗體滴度檢測結果。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，絕不限制本發明的保護範圍。
實施列I表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的構建及表達
I材料和方法
I. I病毒株和細胞
IBDV-HLJ0504株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所禽免疫抑制病課題組分離鑑定並保存；PCAGGS載體和DF-I細胞由本實驗室保存，可通過商業途徑購買得到。
I. 2儀器與試劑
質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自omega公司；限制性內切酶和T4DNA連接酶購自Fermentas公司；Endofree質粒大提試劑盒購自Qiagen公司；紫外分光光度計購自 GE公司；大腸桿菌感受態ToplOF』由本實驗室保存；Lipofectamine 2000轉染試劑購自 invitrogen ；IBDV VP2單克隆抗體由本實驗室保存；RIPA裂解液購自碧雲天公司。
I. 3重組表達質粒pCAGoptiVP243的構建
根據雞偏嗜密碼子將IBDV VP243基因進行密碼子優化，優化後的IBDV VP243 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，基因兩端設計有EcoRI和ClaI酶切位點，設計完成後送金斯特公司合成並克隆入PUC19載體中，得到pUC19-optiVP243重組質粒，將 pUC19-optiVP243重組質粒進行EcoRI/Clal雙酶切，獲得optiVP243基因並亞克隆至同樣用EcoRI/Clal雙酶切後的pCAGGS表達載體中。對重組表達質粒pCAGoptiVP243進行雙酶切鑑定，並進行測序，確定基因序列及讀碼框的準確性。
I. 4重組質粒的提取純化
使用Endofree質粒大提試劑盒對重組表達質粒pCAGoptiVP243進行提取純化,按使用說明進行。
I. 5體外轉染DF-I細胞
將DF-I細胞飼養於六孔板內，所用培養液是含10%PAA胎牛血清的DMEM。待細胞生長至60-80%時，吸去培養液，用無雙抗的Hank』 s液將細胞洗三次，再用少量的opti-MEM(Invitrogen)將待轉染孔細胞洗一次，然後每孔加入I. 5ml opti-MEM,於 37°C CO2培養箱孵育Ih ;將4 μ I重組質粒pCAGoptiVP243 (質粒濃度為I μ g/ μ I)稀釋於 246 μ Iopti-MEM 中；同時，取 10 μ I Lipofectamine 2000 稀釋於 240μ1 opti-MEM 中，輕微混勻，室溫孵育5min ;將稀釋的質粒和Lipofectamine 2000在一個EP管中輕微混勻，室溫孵育20min ;將質粒和Lipofectamine 2000混合液滴加於剛才處理過的DF-I細胞單層上， 置37°C CO2培養箱孵育；IOh後，吸去培養液，用含雙抗的Hank’s液將細胞洗二次，每孔細胞加入2ml DMEM(含10%PAA胎牛血清和100U/ml雙抗)置37°C CO2培養箱繼續培養。48h 後收穫細胞，進行western blot和間接免疫突光試驗。同時設立pCAGGS空載體轉染孔和正常細胞孔兩個陰性對照。
2 結果2. I 重組質粒 pCAGoptiVP243 的構建
PCR及雙酶切鑑定均顯示重組表達質粒pCAGoptiVP243構建正確(圖1)，測序結果表明目的片段及讀碼框均正確。
2. 2重組質粒pCAGoptiVP243在DF-1細胞中的瞬時表達
重組質粒pCAGoptiVP243在轉染DF-I細胞後，經間接免疫螢光染色，在螢光顯微鏡下可見特異的的螢光，兩種陰性對照均未見特異的螢光(圖2)。收集轉染後48h的DF-I 細胞，用VP2單抗進行western blot分析,結果pCAGoptiVP243質粒轉染孔可檢測出分子量約為48kDa的pVP2蛋白，陰性對照孔未檢測到特異性條帶(圖3)。
實施例2本發明的DNA疫苗的免疫試驗
I、材料和方法
I. I 試劑
IBDV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司。
1.2SPF 雞
SPF雞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供，14日齡SPF雞實驗期間飼養於禽病感染實驗室的負壓隔離器中。
I. 3 方法
將14日齡SPF雞隨機分為4組，第I組和第2組各10隻，分別注射pCAGoptiVP243 和pCAGGS，100 μ g/只，腿部肌肉兩點注射，首次免疫後14日採用相同劑量和途徑加強免疫。第3組(CC)和第4組(NC)各5隻雞，不免疫。二免後14天，第1，2，3組分別攻毒IBDV 強毒HLJ0504株，IO3ELD50/只，攻毒後觀察並記錄各組雞死亡情況，第4組作為正常對照組， 不攻毒。攻毒後7天，將各組雞剖檢，採集法氏囊，稱重，統計各組雞囊重比(F/B=(法氏囊重/體重)X 1000)，並製備病理切片，觀察法氏囊病理變化，分析法氏囊組織學病變分值 (HBLS)0根據法氏囊病理組織學變化的不同程度，HBLS分為5個分值1，沒有任何病變；2，散在的或部分濾泡病變；3，小於或等於50%的濾泡發生病變；4，50%-75%的濾泡發生病變； 5，75%-100%的濾泡發生病變。保護標準為攻毒後7天，感染雞正常存活，攻毒組F/B彡正常對照組F/B-2X正常對照組S. D.，HLBS ( I。
2.結果
免疫後IBDV抗體滴度檢測及攻毒保護試驗
IBDV DNA疫苗pCAGoptiVP243以IOOyg劑量免疫14日齡SPF雞，首免後I周， 抗體滴度均為陰性，首免後2周IBDV抗體開始轉陽，平均抗體滴度達620 ;二免後抗體滴度迅速升高，到二免後2周，平均抗體滴度可達2800 (圖4)。試驗期間，pCAGGS免疫組和對照組IBDV抗體均為陰性。二免後2周，對各組雞攻毒IBDV強毒HLJ0504，攻毒後，未免疫攻毒組(CC) 5隻雞全部死亡，pCAGGS免疫組10隻雞死亡8隻，pCAGoptiP243免疫組和正常對照組(NC)全部存活。根據囊重比(F/B)和法氏囊組織學病變分值(HBLS)的判定標準， pCAGoptiVP243免疫組保護率為80%，pCAGGS和未免疫組保護率均為0% (表I)。
表I 二免後2周各組雞攻毒保護試驗
權利要求
1.一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗，其特徵在於所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO. I所示的序列。
2.如權利要求I所述的DNA疫苗，其特徵在於所述的DNA疫苗是通過將SEQIDNO. I所示的序列克隆入pCAGGS表達載體中得到的。
3.—種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗的構建方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)根據雞偏嗜密碼子將IBDVVP243基因進行密碼子優化，優化後的IBDVVP243基因的序列如SEQ ID NO. I所示，在優化後的基因兩端分別設計酶切位點，合成基因； (2)將合成的基因克隆到pUC19載體中，構建得到pUC19-optiVP243重組質粒； (3)將pUC19-optiVP243重組質粒進行酶切，獲得optiVP243基因； (4 )將optiVP243基因克隆到用同樣酶酶切後的pCAGGS表達載體中，構建得到pCAGoptiVP243重組表達質粒，即為所述的DNA疫苗。
4.如權利要求3所述的構建方法，其特徵在於步驟(I)中所述的酶切位點為EcoRI、ClaI0
5.如權利要求3所述的構建方法，其特徵在於還包括對所述重組表達質粒pCAGoptiVP243進行提取純化。
6.權利要求I或2所述的DNA疫苗在製備治療或預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種表達傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因VP243的DNA疫苗及其構建方法和應用。本發明將傳染性法氏囊病病毒強毒株(HLJ0504)的多聚蛋白基因(VP243)進行雞偏嗜密碼子優化，並克隆入真核表達載體pCAGGS，構建了重組表達質粒pCAGoptiVP243。將製備的pCAGoptiVP243以100μg的劑量經腿肌兩點注射首免14日齡SPF雞，28日齡以相同劑量和途徑二免，二免後14天攻擊IBDV強毒HLJ0504株。結果表明，該DNA疫苗可以誘導較高水平的抗體並能提供對強毒的免疫保護。
文檔編號A61K48/00GK102973952SQ20121049538
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者王笑梅, 高宏雷, 高玉龍, 祁小樂, 秦立廷, 王永強 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所