一種含有（肼基羰基）二茂鐵配體的銥配合物及其製備方法和應用與流程
2023-05-10 21:34:26
本發明屬於螢光材料技術領域，具體涉及一種含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物及其製備方法和用途。
背景技術：
銥金屬配合物因其具有良好的螢光量子產率和發光效率及其良好的光學穩定性，已經引起了眾多學者極大的研究興趣。與釕聯吡啶配合物相比，銥金屬配合物具有發光效率高、壽命長、靈敏度高等優點，近年來受到分析化學工作者的青睞。前人的研究偏重於合成具有良好的螢光量子產率的銥金屬配合物，對於針對性檢測次氯酸的銥金屬配合物的研究較少。與其他ROS/RNS類似,次氯酸/次氯酸根在生物體內發揮著重要的生理作用,在生物體中，通過氯離子在髓過氧物酶的催化下的過氧化反應合成的次氯酸是一種必需的抗菌劑。並且，體內過量的次氯酸會引發諸如肝缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、肺損傷、風溼病、心血管疾病、神經退化、甚至癌症等疾病，其在體內的濃度水平及作用過程就成為了研究其致病原理的關鍵點。因此,活體生物樣品中次氯酸/次氯酸根的原位測定與示蹤對於進一步解明其各種生理功能具有重要的實際意義。而光學探針方法因其具有操作簡便，靈敏度高，穩定性好，選擇性好，具有可視性，可進行非侵入型的實時監控等優點，已日益成為一種生命分析領域的重要研究方法。
技術實現要素：
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種具有高靈敏度、高選擇性、pH適用範圍寬、螢光響應迅速的含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物。
同時，本發明還提供了上述含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的製備方法，其製備周期較短，副反應比例較少，產率較高。
本發明還提供了上述含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物在次氯酸含量檢測方面的應用。
為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案是：
該含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物，其結構式為：
上述的含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的製備方法，由以下步驟組成：
(1)氯橋二聚體的製備
在氮氣保護下，將IrCl3·3H2O和2-苯基苯並噻唑加入2-乙氧基乙醚與水的混合溶劑中，IrCl3·3H2O和2-苯基苯並噻唑的摩爾比為1:2～2.5，加熱至回流，攪拌反應15～24h後停止反應，冷卻至室溫，抽濾得到沉澱，所得沉澱分別用二次去離子水、乙醇、正己烷洗滌，真空烘乾，得到氯橋二聚體；
(2)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵的製備
在無水無氧條件下，將4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-甲酸加入二氯亞碸溶劑中，加熱至回流，攪拌2～4h後停止反應，將溶劑旋蒸除去，將剩餘固體溶於無水二氯甲烷中，在冰浴條件下逐滴加入溶有(肼基羰基)二茂鐵和三乙胺的無水二氯甲烷溶液，4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-甲酸與(肼基羰基)二茂鐵的摩爾比為1:1～3，滴加完成後冰浴下攪拌2～4h後停止反應，恢復至室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇作為展開劑進行純化，除去溶劑乾燥後得到4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵；
(3)銥配合物的合成
在氮氣保護下，將氯橋二聚體和4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵按照摩爾比為1:2～5的比例混合加入二氯甲烷溶劑中，加熱至35～45℃，攪拌反應15～24h後停止反應，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇作為展開劑進行純化，除去溶劑乾燥後得到含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物。
進一步限定，在步驟(2)中，所述(肼基羰基)二茂鐵和三乙胺的摩爾比為1：1～3.5。
上述的含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物應用於次氯酸根檢測，特別是作為螢光探針用螢光法檢測生物及細胞中的次氯酸根含量的應用。
進一步限定，用螢光法檢測生物及細胞中的次氯酸根含量的方法由以下步驟組成：
(1)配製pH為7.4、濃度為25mmol的PBS-無水乙醇緩衝溶液，再配製濃度為50μmol的含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的乙醇溶液和濃度為4mmol的標準次氯酸水溶液；
(2)將PBS-無水乙醇緩衝溶液與含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的乙醇溶液按照體積比為5～10:1添加到另一個乾淨的螢光比色皿中，向其中分別加入0、10、20、30、40、50μL的標準次氯酸水溶液，用螢光分光光度儀分別測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I，激發波長為365nm，狹縫為10nm/10nm，以螢光比色皿中次氯酸的濃度為橫坐標，以其所對應的螢光強度I為縱坐標，繪製次氯酸濃度的工作曲線，所得線性回歸方程為：I-I0＝1.14+22.56C，I0為加入0μL的標準次氯酸水溶液時對應的螢光強度，C為標準次氯酸水溶液的濃度，μmol/L；
(3)將PBS-無水乙醇緩衝溶液與含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的乙醇溶液按照體積比為5～10:1添加到另一個乾淨的螢光比色皿中，用微量進樣器吸取待測次氯酸水溶液，加入到該螢光比色皿中，用螢光分光光度儀上測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I待測，激發波長為365nm，狹縫為10nm/10nm，將測得的螢光強度I待測代入步驟(2)的線性回歸方程中，從而待測次氯酸水溶液的濃度為C待測。
進一步限定，上述PBS-無水乙醇緩衝溶液中PBS與無水乙醇的體積比為2.5:1。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
(1)本發明是首次將帶有羰基肼基的二茂鐵引入銥的配合物中,得到一種新的銥配合物，將羰基肼基可被次氯酸特異性切割的特性與二茂鐵具有分子內淬滅螢光作用的特性結合，使銥配合物自身的螢光特性被二茂鐵猝滅，遇到次氯酸根之後羰基肼基被次氯酸特異性切割，從而實現發光信號的「開」和「關」，從而作為檢測次氯酸根的螢光探針，實現了生物及細胞中次氯酸含量的檢測。
(2)本發明的銥配合物具有高靈敏度、高選擇性、螢光響應迅速等優點,同時，本發明的銥配合物從酸到鹼的範圍內都可以用於次氯酸的檢測，即pH適用範圍較寬，是一種較好的檢測次氯酸的分析方法，並可進一步在螢光及電化學發光成像中應用。
(3)本發明的方法在製備4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-肼基羰基二茂鐵時反應條件應嚴格保持溶劑除水與反應體系除氧條件，相比於其他製備方法，本方法明顯縮短了製備周期，降低了副反應進行的比例，極大提高了反應的產率。
(4)本發明在新型銥金屬配合物性質研究的基礎上，首次在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中引入了體積比為28％的無水乙醇作為螢光探針的溶劑，大大提高了其作為螢光探針檢測次氯酸的靈敏度。
附圖說明
圖1為實施例1的產物質譜圖。
圖2為標準銥配合物Ir-Fc的質譜圖。
圖3為檢測次氯酸濃度的標準曲線圖。
圖4為銥配合物檢測標準次氯酸的螢光發射圖。
圖5為銥配合物檢測待測次氯酸的螢光性質圖。
圖6為銥配合物探針用於檢測細胞內次氯酸的螢光共聚焦顯微鏡照片。
圖7為銥配合物探針在不同pH條件下的螢光特性曲線。
圖8為銥配合物探針在不同溶劑條件下的螢光特性曲線。
具體實施方式
現結合附圖和實施例對本發明的技術方案進行進一步說明。
實施例1
本實施例製備含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的方法由以下步驟組成：
(1)氯橋二聚體的製備
在氮氣保護下，將0.3528g(1mmol)的IrCl3·3H2O加入2-乙氧基乙醚與水的混合溶劑中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力攪拌15min，攪拌均勻後，向其中加入0.4792g(2.2mmol)的2-苯基苯並噻唑，加熱至120℃，回流，攪拌反應24h後停止反應，冷卻至室溫，抽濾得到沉澱，所得沉澱分別用30mL二次去離子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗滌，50℃的乾燥箱中真空烘12h至乾燥，得到橙紅色粉末狀氯橋二聚體；
(2)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵的製備
在無水無氧條件下，將214mg(1mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亞碸溶劑中，加熱至80℃回流，攪拌3h後停止反應，將溶劑旋蒸除去，將剩餘固體溶於50mL的無水二氯甲烷中，在0℃冰浴條件下逐滴加入溶有244mg(肼基羰基)二茂鐵和130μL三乙胺的無水二氯甲烷溶液，滴加完成後冰浴下攪拌3h後停止反應，恢復至室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇作為展開劑(V:V＝40:1)進行純化，除去溶劑乾燥後得到4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵；
(3)銥配合物的合成
在氮氣保護下將0.13g(0.1mmol)氯橋二聚體和0.1g(0.228mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵按照摩爾比為1:2.28的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶劑中，加熱至40℃，攪拌反應24h後停止反應，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作為展開劑進行純化，除去溶劑乾燥後得到目標產物含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物(Ir-Fc)，其結構式為：
其產率為50％。
將所得產物經EIS-QTOF質譜分析所得結果參見圖1，結果為1053.1325[M+H]-，與Ir-Fc的標準質譜圖(圖2)的標準值1053.1315[M+H]-接近，說明本實施例所得產物為上述結構的Ir-Fc。
實施例2
本實施例製備含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物的方法由以下步驟組成：
(1)氯橋二聚體的製備
在氮氣保護下，將0.3528g(1mmol)的IrCl3·3H2O加入2-乙氧基乙醚與水的混合溶劑中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力攪拌15min，攪拌均勻後，向其中加入0.4356g(2mmol)的2-苯基苯並噻唑，加熱至120℃，回流，攪拌反應15h後停止反應，冷卻至室溫，抽濾得到沉澱，所得沉澱分別用30mL二次去離子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗滌，50℃的乾燥箱中真空烘12h至乾燥，得到橙紅色粉末狀氯橋二聚體；
(2)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵的製備
在無水無氧條件下，將214mg(1mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亞碸溶劑中，加熱至75℃回流，攪拌3h後停止反應，將溶劑旋蒸除去，將剩餘固體溶於50mL的無水二氯甲烷中，在0℃冰浴條件下逐滴加入溶有732mg(3mmol)(肼基羰基)二茂鐵和130μL三乙胺的無水二氯甲烷溶液，滴加完成後冰浴下攪拌2h後停止反應，恢復至室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇作為展開劑(V:V＝40:1)進行純化，除去溶劑乾燥後得到4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵；
(3)銥配合物的合成
在氮氣保護下,將130mg(0.1mmol)氯橋二聚體和880mg(0.2mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵按照摩爾比為1:2的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶劑中，加熱至35℃，攪拌反應24h後停止反應，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作為展開劑進行純化，除去溶劑乾燥後得到目標產物含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物(Ir-Fc)，其產率為48％。
實施例3
(1)氯橋二聚體的製備
在氮氣保護下，將0.3528g(1mmol)的IrCl3·3H2O加入2-乙氧基乙醚與水的混合溶劑中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力攪拌15min，攪拌均勻後，向其中加入0.5445g(2.5mmol)的2-苯基苯並噻唑，加熱至120℃，回流，攪拌反應18h後停止反應，冷卻至室溫，抽濾得到沉澱，所得沉澱分別用30mL二次去離子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗滌，50℃的乾燥箱中真空烘12h至乾燥，得到橙紅色粉末狀氯橋二聚體；
(2)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵的製備
在無水無氧條件下，將214mg(1mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亞碸溶劑中，加熱至75℃回流，攪拌3h後停止反應，將溶劑旋蒸除去，將剩餘固體溶於50mL的無水二氯甲烷中，在0℃冰浴條件下逐滴加入溶有610mg(2.5mmol)(肼基羰基)二茂鐵和130μL三乙胺的無水二氯甲烷溶液，滴加完成後冰浴下攪拌2h後停止反應，恢復至室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇作為展開劑(V:V＝40:1)進行純化，除去溶劑乾燥後得到4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵；
(3)銥配合物的合成
在氮氣保護下,將0.13g(0.1mmol)氯橋二聚體和2.2g(0.5mmol)4』-甲基-2,2』-聯吡啶-4-(肼基羰基)二茂鐵按照摩爾比為1:5的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶劑中，加熱至45℃，攪拌反應15h後停止反應，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，再用矽膠柱層析分離，採用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作為展開劑進行純化，除去溶劑乾燥後得到目標產物含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物(Ir-Fc)，其產率為40％。
上述含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物(下述簡稱銥配合物)可以作為螢光探針可以在螢光法檢測生物及細胞中的次氯酸含量中應用，具體檢測方法由下述步驟組成：
(1)配製pH為7.4、濃度為25mmol的PBS-無水乙醇(2.5:1,v/v)緩衝溶液，再配製濃度為50μmol的銥配合物的乙醇溶液和濃度為4mmol的標準次氯酸水溶液；
(2)將PBS-無水乙醇(2.5:1,v/v)緩衝溶液與銥配合物的乙醇溶液按照體積比為7:1添加到螢光比色皿系列中，向其中分別加入0、10、20、30、40、50μL的標準次氯酸水溶液，用螢光分光光度儀分別測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I，激發波長為365nm，狹縫為5nm/10nm，所得螢光強度分別是46.18、89.97、143.64、180.776、229.045、271.138，以螢光比色皿中次氯酸的濃度為橫坐標，以其所對應的螢光強度I為縱坐標，繪製次氯酸濃度的工作曲線，所得線性回歸方程為：I-I0＝1.14+22.56C，I0為加入0μL的標準次氯酸水溶液時對應的螢光強度，C為標準次氯酸水溶液的濃度，μmol/L，見圖3。
(3)將PBS-無水乙醇緩衝溶液與銥配合物的乙醇溶液按照體積比為7:1添加到另一個乾淨的螢光比色皿中，用微量進樣器吸取30μL待測次氯酸水溶液，加入到該螢光比色皿中，用螢光分光光度儀上測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I1＝177.23，激發波長為365nm，狹縫為5nm/10nm，將測得的螢光強度I1代入步驟(2)的線性回歸方程中，從而待測次氯酸水溶液的濃度為C待測＝5.76x10-6mol/L。
在實際檢測過程中，PBS-無水乙醇緩衝溶液與銥配合物的乙醇溶液的體積比可以在5～10:1的範圍內浮動，保證其螢光特性穩定即可。
為了驗證本發明的含有(肼基羰基)二茂鐵配體的銥配合物Ir-Fc(下述簡稱銥配合物)對次氯酸的檢測效果，現以下述實驗為例進行說明。
(1)取2.4mL的PBS-無水乙醇(28％，v/v)緩衝溶液、600μL Ir-Fc的乙醇溶液加到系列螢光比色皿中，分別用微量進樣器取0、10、20、30、40、50μL的標準次氯酸水溶液，邊加樣邊在螢光分光光度儀上檢測各比色皿的螢光強度(激發：365nm，狹縫：10nm/10nm)，螢光發射圖見圖4。
由圖4中a～f線對比可知，隨著次氯酸的加入，螢光儀所檢測到的566nm處的螢光強度逐漸增大，說明次氯酸加入後切斷了化學鍵(-C2O2N2H2-)，導致了螢光淬滅基團二茂鐵的離去，被淬滅的銥配合物的螢光逐漸恢復。
(2)檢測樣品
由圖5可知，在螢光光譜儀上測定566nm的對應的螢光強度F為177.23，激發：365nm，狹縫：10nm/10nm，相對螢光強度I﹣I0﹦131.05，通過實施例4的線性回歸方程，求得c＝5.76x10-6mol/L。
(3)活細胞中螢光成像實驗
巨噬細胞按照組織培養保藏標準(American Type Tissue Culture Collection)規定進行培養。巨噬細胞用含有10μM該銥配合物探針的培養液在37℃下孵育3h，然後用培養液洗滌3次，作為空白對照組的共聚焦顯微鏡照片，如圖6中的a)Ir-Fc所示。
實驗組在巨噬細胞用含有10μM該銥配合物探針的培養液在37℃條件下孵育3h後，再用50μM NaClO等滲鹽溶液在37℃條件下孵育0.5h，之後用培養基洗滌3次，置於共聚焦顯微鏡下拍照，如圖6中b)Ir-Fc+HOCl所示。
如圖6中a)Ir-Fc所示，只用Ir-Fc螢光探針處理過的巨噬細胞在螢光顯微鏡下呈現出極微弱的螢光；與之形成強烈對比的是圖6中b)組用Ir-Fc螢光探針+次氯酸溶液處理過的巨噬細胞在螢光顯微鏡下呈現出較強的黃色螢光。
結果表明，Ir-Fc螢光探針是可以透過細胞膜的，而且有能力與細胞內的次氯酸發生相互作用而發出可檢測到的螢光信號。因此，在活細胞中使用該探針進行次氯酸檢測是可行的，即該銥金屬配合物探針可用於檢測活細胞內的次氯酸。
(4)pH性質研究
1)配製pH＝4/4.5/5、濃度為25mmol的醋酸/醋酸鈉-無水乙醇(乙醇濃度為28％,v/v)緩衝溶液，pH＝6/7/8、濃度為25mmol的PBS-無水乙醇(乙醇濃度為28％,v/v)緩衝溶液，pH＝9/10、濃度為25mmol的碳酸鈉/碳酸氫鈉-無水乙醇(乙醇濃度為28％,v/v)緩衝溶液，再配製濃度為50μmol的銥配合物的乙醇溶液和濃度為4mmol的標準次氯酸水溶液；
2)將pH＝4/4.5/5/6/7/8/9/10的上述緩衝溶液與銥配合物的乙醇溶液按照體積比為7:1添加到螢光比色皿系列中，向其中分別加入200μL的標準次氯酸水溶液，用螢光分光光度儀分別測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I，激發波長為365nm，狹縫為5nm/10nm。
實驗結果如圖7中所示，在未加入次氯酸時(Ir-Fc)，在pH＝4-10範圍內，pH值的變化對於Ir-Fc螢光探針在566nm處的螢光強度基乎無影響，螢光均很弱，加入次氯酸(Ir-Fc+HOCl)之後，隨著pH值的增加，566nm處的螢光呈現先增強後減弱的趨勢，但總體來說在p H從酸到鹼的範圍內都可用於次氯酸的檢測。
(5)溶劑條件研究
1)配製一系列pH為7.4、濃度為25mmol的PBS-無水乙醇(乙醇濃度分別為0％,22％，25％，28％,33％，50％，v/v)的緩衝溶液，再配製濃度為50μmol的銥配合物的乙醇溶液和濃度為4mmol的標準次氯酸水溶液；
2)將乙醇濃度分別為0％,22％，25％，28％,33％，50％的上述緩衝溶液與銥配合物的乙醇溶液按照體積比為7:1添加到螢光比色皿系列中，向其中分別加入200μL的標準次氯酸水溶液，用螢光分光光度儀分別測定其在波長為566nm處對應的螢光強度I，激發波長為365nm，狹縫為5nm/10nm。
如圖8中所示，在未加入次氯酸(Ir-Fc)時，水介質中乙醇的加入對於Ir-Fc螢光探針在566nm處的螢光強度基乎無影響，螢光均很弱；加入次氯酸(Ir-Fc+HOCl)後，Ir-Fc螢光探針在566nm處的螢光強度隨著酒精的濃度從0變化至50％(V/V)，出現了很明顯的變化。由圖可知，乙醇濃度為28％(V/V)時，該探針在566nm處的螢光最強。
此實驗結果表明，本發明的銥金屬配合物探針在酒精濃度為28％時，具有較高的檢測靈敏度。
本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明，不僅限於上述的實施方式。