一種利用木質纖維素原料製備phbv的方法

2023-05-11 06:07:11

專利名稱：一種利用木質纖維素原料製備phbv的方法
技術領域：
本發明屬於生物化工技術領域，涉及一種利用秸稈類木質纖維素為原料工業化生 產PHBV的方法。
背景技術：
近年來，由於全球石油資源減少和大量塑膠製品使用過後帶來的嚴重白色汙染問 題，嚴重破壞了人類的生存環境。由於為了能更好的保護人類的生存環境，生物降解材料的 研究和生產受到了人們廣泛地關注。其中，一種新型生物高分子3-羥基丁酸-co-3-羥基 戊酸共聚物(即PHBV)，被認為是替代化學合成塑料、攻克白色汙染最具潛力的新的熱塑性 聚脂，PHBV的分子結構式如下
formula see original document page 3PHBV是不以石油、天然氣為原料，而是利用澱粉和葡萄糖作為原料，通過微生物發 酵技術生產出的生物材料。它很容易被細菌消化，在土壤或堆肥化條件下完全分解為二氧 化碳和水，沒有毒害物質生成，對環境沒有汙染。由於PHBV具有生物可降解性、生物相容 性、壓電性、光學活性等許多優良的特性，可在眾多領域如生物可降解包裝材料、組織工程 材料、緩釋材料及電學材料等方面得到廣泛應用。隨著世界範圍內能源危機的加劇、以及 環境保護意識的增強，PHBV類材料的開發以及利用已引起了科研領域以及工業界的廣泛興 趣。目前PHBV的工業化生產及其廣泛應用所面臨的最大問題是其生產成本過高的問 題，因此目前其主要還是應用在醫學和其他要求高的領域。用細菌發酵生產PHBV的一般工 藝流程如下菌種培養一發酵一巴氏法消毒一沉澱一分離一沉澱物一抽提一乾燥由於工藝路線的選擇問題，目前國際上僅有少數幾家企業能生產，因生產成本很 高，還均未能實現大規模生產。我國中科院微生物所目前已開發出了用澱粉糖與丙酸發酵 生產PHBV技術，並與杭州天安有限公司合作建立起了一個年產lkt PHBV的生產裝置。隨 著的開發成功，我國在這一領域的研究和生產達到了國際先進水平，也標誌著我國在生物 降解塑料的生產方面邁上了一個新的臺階。天然植物纖維是容易獲取的豐富可再生資源，比如，目前我國每年農作物秸稈產 量達到10億噸。因此，可以通過利用廉價的天然纖維素原料生產PHBV以降低發酵的原料 成本，必將受到人們的廣泛關注。目前，常用木質纖維原料水解糖化工藝有兩種分別是酸水解和酶水解。酸水解速度快並且容易完成，通常酸水解採用的礦物酸為H2S04或HC1，溫度160 240°C。纖維素原料經高溫處理後水解液中不但含有可發酵的糖，而且含有糠醛和5-羥甲基糠醛等發酵抑制物，是由糖降解所產生的，這些化合物抑制了微生物對糖的發酵，因此在 發酵以前需將糖醛和5-羥甲基糖醛等發酵抑制物脫除。脫除的方法很多，如石灰中和法、 蒸發法、亞硫酸鹽預處理、離子交換、酶、活性炭處理等，都可以脫除部分發酵抑制物，但是 處理成本過高，生產中難於實現。因此，纖維素的水解現在主要採用的是纖維素酶水解，纖維質材料必須經過預處 理才能獲得較高的酶解轉化率。較好的預處理方法可以減少酶的用量。影響纖維素水解的 因素包括多孔性、纖維素束的結晶度以及木質素和半纖維素的含量。木質素和半纖維素的 存在使得纖維素酶接觸纖維素很困難，因此降低了水解效率。預處理將木質素和半纖維素 去除，減小纖維素的結晶度和增加多孔性，可以顯著提高水解效率。纖維質材料的很多預處 理方法目的是去除半纖維素和木質素，增大纖維素的可接觸面積，進而提高水解效率。由於 木質素、半纖維素對纖維素的保護作用以及纖維素本身的結晶結構，天然的纖維質原料直 接進行水解時，其水解程度是很低的，因此必需對纖維素進行一定的預處理。目前，木質纖維素酶解反應預處理方法很多，包括物理方法、化學方法和生物方法 等。常用的纖維原料物理預處理方法是機械粉碎法，通過切、碾和磨等工藝使纖維原料的粒 度變小，增加底物和酶接觸的表面積，降低纖維素的結晶度。包括粉碎、球磨、壓縮碾磨粉 碎、超聲波等技術。蒸汽爆破法是目前國內外研究較多的有效預處理方法之一。目前所用的 蒸汽爆破法是用蒸汽將原料加熱至160 260°C，維持20s 30min在高溫高壓下造成木質 纖維素軟化，然後迅速使原料減壓造成纖維素晶體和纖維素的破裂，木質素和纖維素分離， 而半纖維素在高溫下發生自水解作用可溶化，木質素也發生部分降解。以上預處理過程結合稀酸、稀鹼法處理可以顯著提高酶解效率。但是高溫或者稀 酸稀鹼處理過程會造成纖維素降解生成發酵抑制物，因此發酵抑制物的脫除效果直接影響 了後續微生物發酵過程的應用。活性炭是一種強力高效的吸附劑和脫色劑，廣泛應用於水的淨化、吸附有害氣體 及將各種液體製品及飲料進行脫色提純等許多方面。活性炭對糖液的脫色效能很強，國 外不少製造精糖的糖廠，用活性炭將經過澄清處理之後的糖液脫色提純，霍漢鎮的《活性 炭-高效的糖液脫色劑》(廣西輕工業，2003) —文對活性炭的糖脫色理論進行了研究。活 性炭通常是用各種植物碎料(木屑、椰殼及蔗渣等)或適當的煤或木炭為原料，經過特殊的 加工處理製成。活性炭的內部有很多極微細的孔隙。孔隙的直徑很小，因此總表面積很大， 有很強的吸附能力。因原料和製造方法的不同，活性炭的品種相當多，分別適用於不同的用 途。製造活性炭一般要經過炭化和活化兩個步驟。尤其活化，這是製造活性炭的關鍵 步驟，有兩類方法一是氣體活化法，用水蒸氣或二氧化碳等為活化劑；另一為化學劑活化 法，用氯化鋅或磷酸等為活化劑。氣體活化法是使炭在高溫下與氣體發生反應，將碳化物表 面侵蝕，形成微孔發達的構造，產品的形狀以顆粒狀為主，內部微孔結構較發達，表面積大， 吸附容量高。適合用於吸附液相和氣相中分子量較小的物質，但不宜用於對大分子物質的 吸附。化學活化常用氯化鋅或磷酸作活化劑，利用氯化鋅或磷酸活化製得的活性炭，孔隙的 尺寸通常稍大，這類活性炭適用於吸附溶液中的大分子物質，例如糖液的脫色。活性炭具有 芳香環式的結構，善於吸附芳香族有機物(糖汁中的有色物大部分屬於這類)，並善於吸附 含有三個碳原子以上的其他有機物。它對不帶電物質的吸附力較強，而對帶電物質(如陰
4離子)的吸附較弱。對後者的吸附與溶液PH值有關酸性溶液中吸附較強，鹼性溶液中較 弱。活性炭的吸附作用和溫度有關。對於多數的物理吸附作用，在低溫下能夠達到較大的 吸附量，但吸附的速度較慢。在糖廠使用的多數情況下，活性炭和糖液接觸的時間不長，故 要求吸附進行得較快，就常用較高的溫度，70 85°C在這個溫度下，一般經過15 30分鐘 活性炭的吸附作用就接近其最大值。中國專利CN1186461C公開了一種低聚木糖的製備方法，利用玉米芯鹼處理後用 木聚糖酶水解，對水解液用活性炭和離子交換樹脂脫色製備木聚糖，該專利介紹了木聚糖 脫色的方法，相對操作繁瑣，不適用於後續要求脫色脫毒的發酵體系。中國專利CN1020042C 公開了一種結晶木糖的製備方法，用蔗渣為原料得到稀酸水解液，用陽離子交換樹脂和活 性炭一起進行脫色，該過程需要濃縮沉澱等過程，操作比較繁瑣，不適用於有後續要求脫色 脫毒的發酵體系。中國專利CN1020042C公開了一種以秸稈為原料應用酶和膜技術製備高 純度低聚木糖的方法，對酶解糖液利用納濾、活性炭、離子交換樹脂進行脫色處理，得到低 聚木糖，不適用於有後續要求脫色脫毒的發酵體系。以上對於纖維素原料水解液脫色過程， 不適用於有脫毒要求的發酵過程。針對真養產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus)生產PHBV工藝，於平(真養產鹼杆 菌發酵生產PHBV的培養條件優化，中國食品學報，2007)、堵國成(真養產鹼桿菌合成3-羥 基丁酸與3-羥基戊酸共聚物發酵條件研究，微生物學報，1999)、楊明(真養產鹼桿菌發酵 生產聚B-羥基丁酸(PHBV)的研究，食品與發酵工業，1999)等用葡萄糖為碳源對真養產鹼 桿菌產PHBV的條件進行了研究，相對來講原料的大規模供應會受到限制。因此，對於真養 產鹼桿菌生產PHBV工藝而言，現有技術存在的問題可歸結為(1)微生物發酵原料主要是 澱粉或者葡萄糖類物質，原料生產成本高，如果大規模生產會存在與人爭糧的問題；(2)纖 維素原料預處理工藝大多需要使用高溫高壓處理方法；預處理階段使用的稀酸或稀鹼會形 成降解產物，這些降解產物會對後續微生物的發酵產生毒害作用，必須對酶解糖液進行脫 毒脫色處理，才能被微生物利用；(3)酶解液的脫色脫毒過程，用到化學試劑和材料較多， 甚至會引入新的化學雜質，操作複雜，增加了原料成本。

發明內容
本發明的技術目的在於提供了一種用新的利用木質纖維素原料生產PHBV的方 法，使得該方法具有原料豐富、成本低廉、適合工業化應用的特點。為達到以上目的本發明通過以下技術方案實現的一種利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於木質纖維素原料經過預 處理後，用纖維素酶水解，收集酶解液用活性炭脫毒脫色作為真氧產鹼桿菌發酵合成PHBV 的唯一碳源製備成發酵培養基，並進行發酵生產PHBV。本發明所述的木質纖維素原料的預處理方法為任意木質纖維素預處理方法的現 有技術，例如蒸汽爆破法、高溫水處理法、球磨法、螺杆擠壓膨化法等；本發明所述的原料預處理步驟前可加入0 1. 0%的稀酸或稀鹼作為輔助劑以提 高后續酶解效率；其中，所述的稀酸包括HC1或H2S04 ；稀鹼包括NaOH、K0H ；本發明所述的酶解糖化步驟預處理後的原料按照初始固液比1 10加入底物，調節PH值為4. 5 5. 0，酶解過程中間隔24h補加纖維素原料1 4次，保持酶解體系固 形物含量為10%，按照5. 0 30. OFPU/g原料的量加入纖維素酶，反應溫度50°C，攪拌酶解 36 120h，酶解結束後，過濾除去固體殘渣，得到酶解糖液；本發明所述的活性炭是用氯化鋅活化或磷酸活化製得的活性炭；本發明所述的活性炭的脫色條件為pH2. 5 8. 0，溫度40°C 100°C，炭粉加量 0. 1 5%，0. 1 3h ；本發明所述的真氧產鹼桿菌發酵生產PHBV的培養基培養條件為碳源為葡萄糖 濃度為2. 0 10. 0%的纖維素酶解液，硫酸銨0. 1 0. 5% ；用氨水調節pH7. 0 8. 0，接 種量10%，32 38°C培養35 50h ；本發明所述的木質纖維素包括秸稈、高粱稈、甘蔗渣、或者草類。本發明的有益效果在於1、酶解糖液中直接加入氯化鋅或磷酸活化製得的活性炭，不僅具有很好的脫色效 果，並且可以去除各種發酵抑制物，而且該過程沒有化學雜質的引入，操作簡單。2、利用木質纖維素原料生產PHBV，從而可聚合得到最終產物PHBV，具有原料豐 富、成本低廉、適合工業化應用的特點。3、生物材料PHBV的推廣和使用具有很好的可生物降解性，減少了環境中的白色 汙染。
具體實施例方式本發明實施例中使用到的相關計算公式和測定方法如下1、濾紙酶活力的測定——纖維素酶的總體酶活力測定採用國際理論和應用化學協會(IUPAC)推薦的標準方法測定[Ghose，T. K.，et al. Pure&Appl. Chem.，1987，59，257 268]，一個濾紙酶活力的國際單位(FPIU)等於在標 準反應條件下每分鐘生成1 P mol葡萄糖量的酶量。測定方法如下取3支25mL刻度試管分別在其中加入50mg粉碎成粉末狀的濾紙，一定質量的固 定纖維素酶，0. 05M檸檬酸緩衝液5. OmL。將上述試管置於恆溫水浴器中，保持在振幅lOOr/min和溫度50°C下保溫60min後 立即取出加入5. OmL DNS試劑，在沸水中反應5min，冷卻後加水至25mL搖勻，於550nm波長 下測定吸光度A值。反應生成的葡萄糖的量根據葡萄糖標準曲線求得；計算出生成2mg葡 萄糖相對的酶量，按下式計算樣品的濾紙酶活力(FPU)，最終結果取平均值
FPU= _2啊■糖_
60min X 0.18 ( mg/Vmol) X 生成 2mg 葡萄糖的酶量(mL)其中，一個濾紙酶活力單位定義為每分鐘生成IP mol葡萄糖所需的酶量，單位 IU/mL。本發明所使用的纖維素酶Accellerase 1000 (購自傑能科國際公司)的濾紙酶活 93FPIU/mL。2、PHBV含量的測定採用氣相色譜法。稱取50mg幹細胞，加入2mL氯仿、2mL酸化甲醇(含3% H2S04)，置於旋塞試管中，100°C酯化4h，冷卻，加入ImL蒸餾水，劇烈振蕩2min，分層，氯仿相氣相色譜分析，計算出樣品中PHBV的百分含量。PHBV質量濃度(g/L)=細胞乾重(g/L) XPHBV百分含量實施例1原料預處理將玉米秸稈於210°C蒸爆處理5min，調節pH值為5. 0，反應溫度 50°C，加入纖維素酶15FPU/g原料，固液比1 10，24h後補料一次，保持酶解體系固形物含 量為10%，攪拌酶解36h，酶解後過濾取酶解液。脫毒脫色磷酸活化活性炭(溧陽市江陽活性炭廠)脫色條件為PH2.5，溫度 40°C，炭粉加量 5%，0. Ih。接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10 %，纖維素酶解液葡萄 糖濃度2. 0%，硫酸銨0. 1 %，用氨水調節pH7. 0，32°C，培養35h。產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到0.5g/ L0實施例2原料預處理玉米秸稈180°C，1. 0%稀硫酸，25min處理，取物料調節pH值為4. 5， 加入纖維素酶15FPU/g原料，反應溫度50°C，固液比1 10，24、48h後補料兩次，攪拌酶解 78h，酶解後過濾取酶解液。脫毒脫色氯化鋅活化活性炭(山西新華活性炭)脫色條件為pH8. 0，溫度100°C， 炭粉加量0. 1%,3. Oh0接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10 %，纖維素酶解液葡萄 糖濃度10.0%，硫酸銨0. 1%，用氨水調節pH8.0，38°C，培養50h。產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到25g/L。實施例3原料預處理甘蔗渣加入1. 0% NaOH球磨，25min處理，取物料調節pH值為4. 5， 加入纖維素酶30FPU/g原料，反應溫度50°C，固液比1 10，24h、48h、72h、96h後補料四次， 攪拌酶解120h，酶解後過濾取酶解液。脫毒脫色磷酸活化活性炭(溧陽市江陽活性炭廠)脫色條件為PH8.0，溫度 80°C，炭粉加量 2. l%,1.0ho接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10 %，纖維素酶解液葡萄 糖濃度9. 0%，硫酸銨0. 1 %，用氨水調節pH7. 8，38°C，培養48h。產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到15g/L。實施例4原料預處理高梁稈210°C，0. 5%稀鹽酸5min蒸爆處理，調節pH值為5. 0，反應溫 度50°C，加入纖維素酶15FPU/g原料，固液比1 10，24h、48h後補料兩次，攪拌酶解72h， 酶解後過濾取酶解液。脫毒脫色磷酸活化活性炭(哈爾濱活性炭廠)脫色條件為PH2. 5，溫度40°C，炭 粉加量5%，0. Ih。接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10%，纖維素酶解液葡萄 糖濃度8. 0%，硫酸銨0. 1 %，用氨水調節pH7. 0，32°C，培養48h。
產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到19g/L。實施例5原料預處理稻草，螺杆180°C螺杆擠壓膨化處理兩次，調節pH值為4. 5，反應溫度 50°C，加入纖維素酶5FPU/g原料，固液比1 10，24h、48h後補料兩次，攪拌酶解72h，酶解 後過濾取酶解液。脫毒脫色磷酸活化活性炭(溧陽市江陽活性炭廠)脫色條件為PH2.5，溫度 40°C，炭粉加量 5%，0. Ih。接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10 %，纖 維素酶解液葡萄 糖濃度6.0%,硫酸銨0.5%,用氨水調節ρΗ7· 0，38°C，培養40h。產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到15g/L。實施例6原料預處理稻草，210°C高溫水處理，取物料調節pH值為4. 7，反應溫度50°C，加 入纖維素酶5FPU/g原料，固液比1 10，24h、48h後補料兩次，攪拌酶解72h，酶解後過濾取
酶解液。脫毒脫色磷酸活化活性炭(鞏義市超越濾料廠)脫色條件為pH5，溫度40°C，炭 粉加量3%，0. Ih。接種發酵活化液體真養產鹼桿菌ATCC 17699，接種量10 %，纖維素酶解液葡萄 糖濃度9.0%,硫酸銨1.5%,用氨水調節ρΗ7· 0，38°C，培養40h。產物分離提取發酵液離心，取菌體，乾燥後，測定PHBV質量濃度可以達到25g/L。
權利要求
一種利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於木質纖維素原料經過預處理後，用纖維素酶水解，收集酶解液用活性炭脫毒脫色作為真氧產鹼桿菌發酵合成PHBV的唯一碳源製備成發酵培養基，並進行發酵生產PHBV。
2.根據權利要求1所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的木 質纖維素預處理方法包括蒸汽爆破法、高溫水處理法、球磨法、螺杆擠壓膨化法。
3.根據權利要求2所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的木 質纖維素預處理前可加入O 1.0%的稀酸或稀鹼作為輔助劑。
4.根據權利要求3所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的稀 酸包括HCl或H2SO4。
5.根據權利要求3所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的稀 鹼包括NaOH或Κ0Η。
6.根據權利要求1所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的纖 維素酶解的方法為預處理後的原料按照初始固液比1 10加入底物，調節PH值為4. 5 5.0，酶解過程中間隔24h補加纖維素原料1 4次，保持酶解體系固形物含量為10%，按 照5. 0 30. OFPU/g原料的量加入纖維素酶，反應溫度50°C，攪拌酶解36 120h，酶解結 束後，過濾除去固體殘渣，得到酶解糖液。
7.根據權利要求1所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的活 性炭的脫色條件為ρΗ2· 5 8. 0，溫度40°C 100°C，炭粉加量0. 1 5%，0. 1 3h。
8.根據權利要求1所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於所述的真 氧產鹼桿菌發酵生產PHBV的培養基培養條件為碳源為葡萄糖濃度為2. 0 10. 0%的纖 維素酶解液，硫酸銨0. 1 0. 5%，用氨水調節pH7. 0 8. 0 ；接種量10%，32 38°C培養 35 50h。
9.根據權利要求1至9之一所述的利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其特徵在於 所述的木質纖維素包括秸稈、高粱稈、甘蔗渣、或者草類。
全文摘要
本發明涉及一種利用木質纖維素原料製備PHBV的方法，其技術要點在於木質纖維素原料經過預處理後，用分批補料的方法進行纖維素酶水解，以獲得較高的糖濃度，收集酶解液用氯化鋅或磷酸活化製得的活性炭脫毒脫色，脫毒後酶解糖液作為真氧產鹼桿菌發酵合成PHBV的唯一碳源。本發明不僅對於開發利用我國豐富的農作物秸稈資源，而且對於更好保護環境和減少白色汙染都有重要意義，具有原料豐富、成本低廉、適合工業化應用的特點。
文檔編號C08G63/06GK101812482SQ20101011627
公開日2010年8月25日 申請日期2010年3月2日 優先權日2010年3月2日
發明者張紅漫, 徐俊, 李瑩娟, 林增祥, 趙晶, 黃和 申請人:南京工業大學