PDGF受體α基因的外顯子1β及其應用的製作方法

2023-05-11 08:44:41

專利名稱：PDGF受體α基因的外顯子1β及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的多核苷酸，以及以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的RNA為靶的PDGF受體α的表達抑制方法、表達抑制物質和表達抑制劑，以及癌症的治療劑。
背景技術：
血小板衍生生長因子(PDGF)在細胞的增殖和發生、分化、創傷癒合以及癌惡變和動脈硬化等中起著重要作用。因此預期控制PDGF信號的物質可作為這些疾病的治療劑。實際上已提出作為治療劑的PDGF表達抑制劑(例如，參照日本專利特開平10-59850號公報)、PDGF與PDGF受體α的結合阻斷劑(例如，參照日本專利特表平8-500010號公報)和PDGF受體α酪氨酸激酶抑制劑(例如，參照日本專利特表2002-514228號公報)。
然而，擔心這些抑制劑和阻斷劑不僅對癌特異性PDGF信號、也對正常PDGF信號產生影響。本發明的目的在於提供用於可僅選擇性抑制癌細胞特異性PDGF信號的表達抑制方法的多核苷酸、表達抑制物質、表達抑制劑和癌治療劑。
發明的揭示本發明的多核苷酸的特徵在於，具有序列編號2所示的鹼基序列或其一部分。作為具有序列編號2所示的鹼基序列的一部分的多核苷酸，可列舉具有序列編號1所示的鹼基序列的多核苷酸。
本發明的多核苷酸的特徵在於，具有在序列編號2所示的鹼基序列中，缺失、取代或插入1個或數個鹼基，並包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的鹼基序列中的鹼基序列或其一部分。
這裡「PDGF受體α基因」是GenBank登錄號AC026580及AC025013所示的鹼基序列構成的基因及其同系物。
而且，本發明的多核苷酸也可以是具有與上述多核苷酸互補的鹼基序列或其一部分的多核苷酸。
這些多核苷酸可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA中的任一種。此外，具有1個或數個鹼基的缺失、取代或插入等的基因多態性(geneticpolymorphism)、具有包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的鹼基序列中的鹼基序列的多肽也在本發明的範圍內，但較好是具有同等機能的多肽，特別好的是由E2F-1調節轉錄的多肽。
本發明的PDGF受體α的表達抑制方法的特徵是，以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶。這裡「mRNA」是指從經轉錄形成的hnRNA除去內含子部分、外顯子部分結合而形成的RNA。「以mRNA作為靶」是指直接或間接地特異地使該mRNA不生成其編碼的蛋白質。「蛋白質的表達」表示DNA上的遺傳信息由mRNA被正確地翻譯而產生蛋白質。
本發明的PDGF受體α的表達抑制方法也可以是使用反義核苷酸、核酶、大酶(maxizyme)或RNAi的方法。
這裡「PDGF受體α基因的反義核苷酸」是指與PDGF受體α基因的mRNA的鹼基序列互補的核苷酸，可以是反義RNA或反義DNA，核苷酸也可以被修飾。上述反義RNA或DNA指與從作為對象的基因轉錄的mRNA序列互補的RNA或DNA，用於阻斷細胞內的遺傳信息的表達，特異地抑制靶蛋白的產生。
「核酶」是具有酶活性的RNA的總稱，指特異地切斷來自生物的RNA的酶。如果被摻入細胞內，則具有切斷靶RNA序列的機能。其結果是，抑制了蛋白質由靶RNA的表達。由於對靶RNA序列的特異性高，所以作為蛋白質的表達抑制物質較好。核酶包括錘頭型核酶和髮夾型核酶(hairpin ribozyme)等。
「大酶」一般如WO99/46388號公報的說明書記載，是形成二聚體結構的RNA分子，例如，它的兩個RNA分子不識別正常細胞中的mRNA，而通過構成大酶能識別癌細胞中特異性的mRNA，因而可只切斷癌細胞中特異性的mRNA。
「RNAi」指利用誘導被稱為RNA幹擾(RNA interference)的現象的雙鏈RNA(dsRNA)的方法。「被稱為RNA幹擾的現象」是將上述雙鏈RNA導入細胞內抑制靶基因表達的現象，目前認為是通過宿主內在的機制被切短成為21～23鹼基對，切短的RNA分子識別由宿主基因轉錄而成的mRNA，發生序列特異性的分解，其結果是，特異地抑制由宿主基因編碼的蛋白質的表達。
本發明的PDGF受體α的表達抑制方法可以是利用編碼反義RNA、核酶、大酶、或RNAi中的任一種的DNA的方法。
本發明的PDGF受體α的表達抑制物質的特徵在於，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶。例如通過表達抑制物質使其結合於該mRNA，或使該mRNA分解，也可以是表達抑制物質間接地使其他物質結合於該mRNA，或由其他物質使該mRNA分解。「PDGF受體α的表達抑制物質」是指抑制PDGF受體α蛋白質由PDGF受體α基因產生的物質。
作為本發明的PDGF受體α的表達抑制物質，具體可列舉反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等。
作為本發明的PDGF受體α的表達抑制物質，具體可列舉編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA等。
本發明的PDGF受體α的表達抑制劑的特徵在於，以上述表達抑制物質為有效成分。
本發明的癌症的治療劑的特徵在於，含有上述表達抑制劑。
本發明的癌的治療方法的特徵在於，含有上述表達抑制劑。
附圖的簡單說明

圖1是顯示本發明實施例2中用RT-PCR揭示的PDGF受體α基因的外顯子1β～4的表達模式的圖。
圖2是顯示核酶結構的圖。
圖3是顯示大酶結構的圖。
圖4是顯示本發明的實施例1中用含-1395至+312的鹼基序列的報導構建物(reporter construct)進行螢光素酶測定的結果的圖。圖中的「+」表示導入100ng含-1395至+312的鹼基序列的報導構建物的結果，「-」表示導入100ng不含-1395至+312的鹼基序列的報導構建物的結果。
圖5是表示本發明的實施例1中用含-517至+1445的鹼基序列的報導構建物進行螢光素酶測定的結果的圖。
圖6是表示本發明的實施例1中用缺失轉錄起始點的不同長度的缺失突變體進行螢光素酶測定的結果的圖。
圖7是表示由基本轉錄因子轉錄的PDGFRα的mRNA和由E2F-1轉錄的PDGFRα的mRNA的示意圖。
實施發明的最佳形式已知在癌細胞中，大部分的場合，RB蛋白等抑制癌的蛋白質參與的信號轉導途徑發生異常。例如，在RB蛋白上遊起作用的細胞周期蛋白D1的過度表達，通過增強對生長因子的敏感性，認為其參與癌細胞的惡變。在體外的細胞培養體系中，通過向過度表達細胞周期蛋白D1的細胞株加入FGF(成纖維細胞生長因子)，可使該細胞惡變。本申請的發明者發現PDGF(血小板衍生生長因子)也起同樣作用，可使過度表達細胞周期蛋白D1的細胞株惡變。
在細胞周期蛋白D1-RB途徑的下遊存在轉錄因子E2F-1，通過增加FGF受體的表達而使對FGF的敏感性提高。如下列實施例詳述，E2F-1也使PDGF受體α的表達亢進，但本申請的發明者發現它不作用於以往知道的啟動子，而作用於以往的內含子1中由E2F-1控制的新啟動子區域，對通過該新啟動子轉錄時所用的新外顯子1β進行了鑑定。
這樣，在E2F-1和PDGF參與的癌的惡變中，了解到這些因子的一個靶是具有PDGF受體α的外顯子1β的mRNA。因此，通過特異性抑制從具有該外顯子1β的轉錄產物產生PDGF受體α，可阻斷與癌細胞惡變有關的信號，從而抑制癌細胞增殖。並且，不限於細胞周期蛋白D1-E2F-1途徑，如果癌細胞的增殖是由於通過具有外顯子1β的mRNA的過度轉錄而與PDGF受體α共同引起癌惡變的因子的話，本發明可應用於這種癌細胞的增殖抑制。
以下，對根據上述發現完成的本發明的實施方式舉實施例詳細說明。實施方式和實施例如無特別說明，可用J.Sambrook，E.F.Fritsch T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(2nd edition)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York(1989)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley Sons Ltd.等的標準方案集記載的方法，或其經修飾、改變的方法。使用市售的試劑盒和測定裝置時，如無特別說明，可使用其所附的方案。
本發明的目的，特徵、優點及其思路，根據本說明書的說明，本領域普通技術人員應該可以明白，從本說明書的記載，本領域普通技術人員能夠很容易地再現本發明。以下說明的發明的實施方式及具體實施例等是說明本發明的較好實施方式的例子，僅是為舉例或說明而提出的，本發明並不限於此。在本說明書揭示的本發明的意圖和範圍內，根據本說明書的記載，可作各種改變和改進，這對本領域普通技術人員是顯而易見的。
具有序列編號2所示的人PDGF受體α基因的外顯子1β的鹼基序列或其一部分的多核苷酸，根據序列編號2所示的鹼基序列信息，可從cDNA文庫、基因組文庫等人基因文庫製備。而且，來自小鼠、大鼠、雞、豬、狗、猴等人以外的生物物種的PDGF受體α基因的外顯子1β也可以用E2F-1控制轉錄來確定，例如與人PDGF受體α基因的外顯子1β的雜交也可通過檢查以往的內含子1中的序列中的新外顯子等來鑑定，它們也包含在本發明的多核苷酸中。
這裡，「人PDGF受體α基因的外顯子1β」是指包含具有序列編號2所示的鹼基序列的多核苷酸而構成的外顯子，「PDGF受體α基因的外顯子1β」是指包含具有序列編號2所示的鹼基序列的多核苷酸而構成的外顯子以及在人以外的生物物種中與此對應的外顯子。
PDGF受體α基因的外顯子1β由於是mRNA上的非翻譯區域，在人以外的生物物種中，在鹼基序列水平上不一定要求有高度同源性，但有必要在特定種類的細胞中保存轉錄機能，例如必需有由E2F-1控制轉錄這一其它外顯子1所沒有的特徵。
如圖1所示，含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA，僅在特定的癌細胞中被檢出。因此，以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶的表達抑制方法，以及本發明的多核苷酸，表達抑制物質和表達抑制劑等，作為攻擊特定癌細胞(如具體可列舉人大腸癌細胞SW480和人食道癌細胞TTn等)用的癌治療方法和癌治療劑是有用的。
本發明的表達抑制方法是以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶的方法，例如，可以是結合於含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA，抑制翻譯從而抑制PDGF受體α的表達的方法，或是分解或切斷上述mRNA從而抑制PDGF受體α的表達的方法。以下對使用反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等表達抑制物質的表達抑制方法舉例進行說明。
(1)反義核苷酸的製備作為本發明的表達抑制方法中使用的反義核苷酸，具體可例舉含與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應的這部分鹼基序列或其一部分互補的鹼基序列的反義RNA或反義DNA。還可以是由15～30個鹼基序列組成的反義寡核苷酸。
本發明的反義核苷酸在結構上不受其序列的位置、長度、修飾、錯配序列的存在等的限制。作為經過上述修飾的反義核苷酸，具體可例舉為使反義核苷酸在體內或細胞內保持穩定而使磷酸二酯鍵的磷酸基的一個氧原子被硫原子或甲基修飾的反義核苷酸、嗎啉-4-基修飾的反義核苷酸。
本發明的反義DNA可用S1核酸酶等依賴DNA的DNA聚合酶經引物延伸法在體外合成。此外，將反義鏈的一部分作為引物進行PCR，可僅合成反義鏈。也可用DNA合成儀等進行人工合成。反義寡核苷酸的合成可依據反義DNA進行，最好人工合成。
另一方面，本發明的反義RNA，例如用RNA合成儀和固相合成法等可容易地合成。其後用HPLC以NH3OH/EtOH洗脫，可分離出目標RNA。
本發明的反義RNA可通過以上方法人工合成，也可製作在特異地識別T7RNA聚合酶的啟動子序列(5』-TAATACGACTCACTATA-3』序列編號3)的下遊插入了具有與反義RNA對應的DNA序列的雙鏈DNA的載體，用T7RNA聚合酶由體外轉錄體系合成。
此外，也可以使用摻入了與反義RNA對應的DNA的病毒載體或質粒等表達載體，在細胞內使反義RNA表達。作為病毒載體，可以是腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
(2)插入了核酶的質粒的製備如圖2所示，核酶具有與靶mRNA的鹼基序列互補的鹼基序列(表示核酶的5』末端部分和3』末端部分的鹼基序列)和具催化活性部位(以○記號表示的鹼基)的24個鹼基序列。核酶的5』末端部分和3』末端部分的鹼基序列如果與靶mRNA的鹼基序列特異地結合，則切斷存在於mRNA上的NUX序列(N為任意鹼基，X是a、u、c中的任一個鹼基)而使靶mRNA分解。即，認為如果基於與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應的部分的鹼基序列合成核酶並給予細胞內，則可特異地切斷含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA。
因此，作為本發明的表達抑制物質的核酶，可從序列編號2所示的人PDGF受體α基因的外顯子1β的鹼基序列中選擇與NUX序列對應的序列，使其包含與含有該序列的15～20個鹼基序列互補的鹼基序列以及具有催化活性部位(以○記號表示的鹼基)的24個鹼基序列。作為與NUX對應的序列，可例舉序列編號2表示的34～36位的GTC、75～77位的GTC、78～80位的GTC、81～83位的GTC、172～174位的GTC、267～269位的GTC。此外，上述核酶可以是錘頭型核酶或髮夾型核酶。
實際的合成方法有人工合成、體外合成、由表達載體在細胞內合成等，與(1)的反義RNA的情況相同，故在此省略說明。
(3)大酶的設計與製備如圖3所示，大酶由形成二聚體結構的RNA分子構成，兩個RNA分子具有特異地識別靶RNA的傳感器部位(圖中表示成X···X部分，X指任意鹼基。上行的X和下行的X表示互補的鹼基)、催化活性部位(圖中不形成雙鏈的部分)、存在於含靶RNA的mRNA上的NUX序列(N為任意鹼基，X表示A、U、C中的任一鹼基。圖中表示成GUC序列的部分。)以及識別其上遊(圖中GUC序列部分的上遊)或下遊(圖中GUC序列部分的下遊)的部位。大酶的傳感器部位特異地識別靶RNA並與其結合，而該大酶的另一傳感器部分特異地識別存在於含靶RNA的mRNA上的NUX序列的上遊和下遊並與其結合，切斷存在於含靶RNA的mRNA上的NUX序列，可使靶mRNA特異地分解。即，如果基於與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應的部分的鹼基序列合成大酶並給予細胞內，認為可特異地切斷含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA。
例如，將PDGF受體α基因的外顯子1β作為靶RNA，將與該靶RNA互補的鹼基序列作為傳感器部位。此外，從PDGF受體α的mRNA選擇存在於靶RNA下遊的NUX序列，確定與NUX序列上遊和下遊的序列互補的鹼基序列。NUX序列可以是PDGF受體α基因的外顯子1β的mRNA上的序列。由這些信息，通過RNA合成儀合成大酶的各RNA分子，可製作大酶。圖中X的數目可以增減1個或數個。
實際合成方法有人工合成、體外合成、由表達載體在細胞內合成等，與(1)的反義RNA的情況相同，這裡省略說明。但因大酶使用2分子的RNA，用表達載體在細胞內表達時，2分子RNA可摻入1個載體，也可分別摻入2個載體中。
(4)RNAi的製備如果將與目標基因對應的雙鏈RNA導入體內，有報導認為對應的mRNA會發生分解(Bass，B.L.(2000)Cell 101，235-238；Fire，A.(1999)Trends Genet.15，358-363；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490)。因此，如果將與具有PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的mRNA對應的雙鏈RNA(RNAi)導入細胞內或體內，則認為含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA會發生分解。
作為本發明的表達抑制物質的RNAi可如下製備。即，可用RNA合成儀人工合成與PDGF受體α基因的外顯子1β的有意義鏈或其一部分的鹼基序列對應的RNA以及與該RNA互補的RNA。此外，也可用HiScribe RNAi Transcription Kit(NEB公司制)在體外和體內合成。
另外，可將在正、負兩個方向克隆了PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的病毒載體或質粒等表達載體分別導入細胞內，使DNA的兩鏈在細胞內表達，在細胞內形成RNAi，並使靶的mRNA分解。也可使用具有將對應於PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的雙鏈的各鏈的DNA序列融合的序列的DNA，即，具有使有意義鏈DNA的3』末端和反義鏈DNA的5』末端融合的序列的DNA，或者將具有使互補的DNA的3』末端和有意義鏈的DNA的5』末端融合的序列的DNA摻入表達載體。上述病毒載體可以是腺病毒載體或逆轉錄病毒載體等。這樣的RNAi希望在30個鹼基以內，最好是21個鹼基。
(5)表達抑制物質的導入在體外的細胞培養系統中將表達抑制物質導入細胞內時，可將製備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表達抑制物質，用電穿孔法、微量注射法、脂質轉染法、用腺病毒、逆轉錄病毒等病毒載體等的病毒感染法或用鈣的轉染法等，導入作為對象的癌細胞。
作為將表達抑制劑導入個體體內的方法，可以是將以如上製備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表達抑制物質作為有效成分的表達抑制劑，直接給於人或人以外的脊椎動物中作為導入對象的癌細胞附近，也可根據表達抑制劑不經口、口服、皮內、皮下、靜脈內、肌肉內或腹腔內給予的方法。這種情況下，表達抑制劑可根據使用部位和目的還含有藥理學上許可的適當的賦形劑或基質。
作為給予個體的表達抑制劑，較好是配製成使表達抑制物質容易被細胞攝取的形態。例如，可以是將編碼上述反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi的DNA融合入病毒載體而得到的表達載體，在體外感染適當的細胞株，產生病毒，並注射此病毒引起感染的方法。作為病毒載體，可以用在細胞內表達的腺病毒載體和逆轉錄病毒載體。
此外，可通過使上述表達載體包裹入脂質體中，與癌細胞融合而將質粒導入細胞內。也可用TransIT In Vivo Gene Delivery System(TakaRa的商品名)進行體內轉染。這種情況下，表達抑制劑可直接注射於患部或靜脈注射。
也可將如上製備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等RNA，經體外選擇法(invitro selection)與易導入細胞內的HIV的TAT等肽結合，將形成的RNA適體(RNAaptamer)作為表達抑制劑進行注射。
作為對象的癌細胞，具體可例舉人大腸癌細胞SW480和人食道癌細胞TTn，但只要是能確認由DPGF受體α基因的外顯子1β轉錄的mRNA，什麼癌細胞都可以。
(6)表達抑制物質的表達抑制作用的評價用上述(5)記載的方法，對在體外培養的特定的癌細胞導入了表達抑制物質和未導入的，通過RT-PCR法比較評價由PDGF受體α基因的外顯子1β轉錄的mRNA的量，可對表達抑制物質的表達抑制作用進行評價。此外，也可用通過Northern印跡法等評價由PDGF受體α基因的外顯子1β轉錄的mRNA的量的方法。根據這些結果，發現可更有效地抑制由PDGF受體α基因的外顯子1β轉錄的mRNA的翻譯的反義核苷酸。
上述是體外試驗，也可能用體內試驗進行評價。
作為體內評價方法，具體可例舉以下方法。即，對正常小鼠皮下注射上述特定的癌細胞，在一定期間內使腫瘤生長，其後用(5)的導入方法給予如上製備的表達抑制劑一至數次。給予後，通過比較評價導入了表達抑制劑的小鼠和未導入表達抑制劑的小鼠的癌的大小和生存率，可進行表達抑制物質的表達抑制作用的評價。
以下，詳細說明本發明的實施例。
實施例1
本實施例鑑定PDGF受體α基因中由轉錄因子E2F-1控制的新外顯子。
首先，本申請的發明者發現小鼠NIH3T3細胞加入PDGF後其增殖不依賴於支架(scaffold)。因此考察了該細胞株中PDGF受體α(PDGFR-α)的表達，發現PDGF受體的表達上升，它在轉錄水平受到調控。
由於細胞周期蛋白D1通過依賴細胞周期的pRb磷酸化而使轉錄因子E2F-1活化，研究了其上升是否是由於E2F-1對人PDGF受體α的啟動子的調節。將轉錄起始點的-1395至+312的序列(根據Genomics，Vol.30，224-232，1995報導的轉錄起始點將鹼基編號。參照GenBank登錄編號D50001S01)組成的啟動子區域，用pGL3螢光素酶載體克隆在螢光素酶基因的上遊，在細胞周期蛋白D1過度表達的NIH3T3細胞中用轉染法與E2F-1的表達載體一起導入。培養24～72小時後，進行螢光素酶測定，考察上述啟動子的轉錄活性。作為陽性對照，使用在mFGFR-1的啟動子的下遊插入了螢光素酶基因的質粒。其結果是，mFGFR-1啟動子的轉錄活性上升，但PDGF受體α的啟動子的轉錄活性未見上升(圖4)。因此，表明以前知道的PDGF受體α的啟動子並不參與過度表達細胞周期蛋白D1的小鼠NIH3T3細胞中的PDGF受體α的表達的上升。
另外，通過轉錄因子結合序列檢索(TF search)，考察在人PDGFR-α基因的外顯子1β的下遊是否是與E2F-1結合的共有序列，發現據認為E2F-1可結合的序列在報告的轉錄起始點下遊約1kbp附近成群地存在於4個位置。因此，將由-295至+1445的鹼基序列組成的DNA結合在螢光素酶基因的上遊，用所得的報導構建物與上述記載的方法同樣進行螢光素酶測定，考察E2F-1的轉錄活性。其結果是，可確認該區域的轉錄活性由於E2F-1而上升(圖5)。此外，無E2F-1轉錄活化能的突變E2F-1(1～368位的胺基酸序列)或132位的亮氨酸被穀氨酸取代而無DNA結合能的突變E2F-1均未見轉錄活性，因而提示該區域實際由E2F-1調節。
然而，推定的E2F-1結合位點位於所報告的轉錄起始點下遊約1.2kbp，很難認為該啟動子活性作用於以前報告的轉錄啟始點。因此，為考察該區域是否作用於以前報導的轉錄起始點，製作了缺失該轉錄起始點的不同長度的缺失突變體，與上述方法同樣進行螢光素酶測定，考察E2F-1的轉錄活性。其結果是，在轉錄起始點下遊缺失達到約1kbp的構建物也具有啟動子活性，而且E2F-1引起的轉錄活性也見上升。由這些結果提示PDGFR-α由E2F-1調節的mRNA從新的轉錄起始點表達的可能性(圖6)。
因此，用5』-RACE法確定E2F-1引起的轉錄起始點。將螢光素酶基因上遊結合了-295至+1445的鹼基序列組成的DNA的報導構建物經轉染導入NIH3T3細胞株，從該細胞株提取mRNA，用5』-Full RACE Core Set(TakaRa的商品名)，通過對螢光素酶基因序列具特異性的引物[正向引物-1(序列編號45』-CCTTAATTAAGGGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTA-3』)和反向引物-1(序列編號55』-CCTTAATTAAGGGGCGCAACTGCAACTCCGATAAAT-3』)]進行PCR，得擴增產物。考察該擴增產物的DNA序列後發現，在以前認為是內含子的區域存在新的外顯子。這樣，證明在以前認為是內含子的區域存在著由E2F-1調節轉錄的新的外顯子。
實施例2
本實施例確定PDGF受體α基因的外顯子1β是否在癌細胞中特異地表達。
根據PDGF受體α基因的外顯子1β和已知的外顯子4的序列設計引物[正向引物-2(序列編號65』-CCTTAATTAAGGAACCGCACACCAAGGGGCCCTCATT-3』)和反向引物-2(序列編號75』-AACAGCACAGGTGACCACAATCG-3』)]，用從圖1所示的各癌細胞提取的總RNA進行RT-PCR。如圖1所示，人大腸癌細胞SW480和人食道癌細胞TTn中檢出信號。回收這些擴增的條帶，測定DNA序列後發現，這些條帶是PDGF受體α基因的外顯子1β和已知的外顯子2～4的序列連結的人PDGFR-α的mRNA片斷，同時測定了序列編號1所示的全長338bp的外顯子1β的序列。即發現新鑑定的啟動子區域是人PDGFR的mRNA2(圖7)。
實施例3
用5』-RACE法測定外顯子1β的5』末端的更正確的位置。從表達含外顯子1β的PDGFR-αmRNA的人骨肉癌細胞MG-63提取mRNA，用5』-Full RACE Core Set，以對外顯子1β特異的引物[正向引物-2(序列編號6)和反向引物-3(序列編號85』-CCGCTCGAGGCGACGACGACTTCTTCACTCAGG-3』)]進行PCR。測定該PCR所得擴增產物的DNA序列的結果是，得到序列編號2所示的363bp的鹼基序列，發現外顯子1β的5』末端至少延伸到+1210。
產業上利用的可能性如上所述，本發明可提供用於僅選擇性抑制癌特異性PDGF信號的表達抑制方法的多核苷酸、表達抑制物質、表達抑制劑以及癌症的治療劑。
序列表110學校法人慶應義塾(KEIO UNIVERSITY)120PDGF受體α基因的外顯子1β及其應用130PCT/711150JP 02/3321421512002-11-151608170PatentIn version 3.12101211338212DNA213智人(Homo sapiens)220
223發明人Imoto，Masaya發明人Minato，Yusuke發明人Tashiro，Etsu4001gcgcgggggc gacagcggcg gcgcgggcgg gcggtctgga ataatgacaa acacatttgg 60ccctgagtga agaagtcgtc gtcgcctcgc attccagcaa ctgggatttg aggaatttcg120aaccgcacac caaggggccc tcattgtgct ccgtggcccc cgcccccgcc cgtcttcccg180cgccccctcc tcggtggaat catttctgca ttgcccgggg gctctgcttt cgctcagttc240tggccgcagg caggaagaga ggaaaggtct ccaggaaggt gccgaacttc ttgtgaggaa300gttagggacg acttggaact ggggaaactt gtttgcag3382102211363212DNA213智人(Homo sapiens)
4002cagtgtgctc gggttgcacg ccctagcgcg ggggcgacag cggcggcgcg ggcgggcggt 60ctggaataat gacaaacaca tttggccctg agtgaagaag tcgtcgtcgc ctcgcattcc120agcaactggg atttgaggaa tttcgaaccg cacaccaagg ggccctcatt gtgctccgtg180gcccccgccc ccgcctgtct tcccgcgccc cctcctcggt ggaatcattt ctgcattgcc240cgggggctct gctttcgctc agttctggcc gcaggcagga agagaggaaa ggtctccagg300aaggtgccga acttcttgtg aggaagttag ggacgacttg gaactgggga aacttgtttg360cag 363210321117212DNA213人工序列220
223啟動子序列4003taatacgact cactata17210421136212DNA213人工序列220
223正向引物14004ccttaattaa gggattctcg catgccagag atccta 36210521136212DNA213人工序列
220
223反向引物14005ccttaattaa ggggcgcaac tgcaactccg ataaat36210621137212DNA213人工序列220
223正向引物24006ccttaattaa ggaaccgcac accaaggggc cctcatt 37210721123212DNA213人工序列220
223反向引物24007aacagcacag gtgaccacaa tcg 23210821133212DNA213人工序列220
223反向引物34008ccgctcgagg cgacgacgac ttcttcactc agg 3權利要求
1.多核苷酸，其特徵在於，具有序列編號2所示的鹼基序列或其一部分。
2.多核苷酸，其特徵在於，具有在序列編號2所示的鹼基序列中缺失、取代或插入一個或數個鹼基，並包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的鹼基序列中的鹼基序列或其一部分。
3.多核苷酸，其特徵在於，具有與權利要求1或2所述的多核苷酸互補的鹼基序列或其一部分。
4.PDGF受體α的表達抑制方法，其特徵在於，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶。
5.如權利要求4所述的PDGF受體α的表達抑制方法，其特徵還在於，使用反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
6.如權利要求4所述的PDGF受體α的表達抑制方法，其特徵還在於，使用編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA。
7.PDGF受體α的表達抑制物質，其特徵在於，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶。
8.如權利要求7所述的PDGF受體α的表達抑制物質，其特徵還在於，它是反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
9.如權利要求7所述的PDGF受體α的表達抑制物質，其特徵還在於，它是編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA。
10.PDGF受體α的表達抑制劑，其特徵在於，以權利要求7所述的表達抑制物質為有效成分。
11.癌症的治療劑，其特徵在於，含有權利要求10所述的表達抑制劑。
12.癌症的治療方法，其特徵在於，使用權利要求10所述的表達抑制劑。
全文摘要
用基於特定的癌細胞中表達的PDGF受體α基因的外顯子1β的鹼基序列或其一部分多肽製作的反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi，抑制由PDGF受體α基因的外顯子1β轉錄的mRNA的翻譯。以反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等抑制表達的物質為有效成分的表達抑制劑作為癌症的治療劑是有效的。
文檔編號A61K31/7088GK1729291SQ20038010705
公開日2006年2月1日 申請日期2003年11月14日 優先權日2002年11月15日
發明者井本正哉, 湊雄介, 田代悅 申請人:學校法人慶應義塾